基因敲除技術及其應用Contents基因敲除的步驟及方法2基因敲除的定義1基因敲除的應用34Subtitle基因敲除的定義

基因敲除(Geneknockout)是指一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。基因敲除的基本步驟

第一步：ES細胞的獲得第二步：重組載體的構建

第三步：重組DNA轉入受體細胞核內

第四步：目的細胞的篩選

第五步：轉基因動物的獲得基因敲除的方法一．Cre-LoxP系統Cre-LoxP系統屬于傳統的同源重組載體,但是具有了時空調控的功能。它由Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre-LoxP系統可以實現對基因的不同發育階段、不同組織類型中特異性的刪除,可以消除由于基因位置改變造成的影響,加強了對基因的控制能力,使研究者可以更方便地有針對性地進行目標階段的研究工作;Cre-LoxP系統可以實現染色體間的基因重排;但同時也可以看出該系統對基因的了解要求極高,并且對基因片段的操作能力要求也很高,基因片段的大小通常在10kb以上,這些都不利于研究工作進行。基因敲除的方法二．轉座子系統

轉座子系統自從20世紀50年代被McClintock發現以來,已經成為許多組織器官進行基因分析的工具。在人和小鼠的基因組中,轉座子衍生序列多達整個基因組的40%,這提示在發育過程中轉座子有重要作用。轉座子系統易于操作,所需時間短,具有高通量的特點,可以攜帶多種抗性標記,方便了同時進行多基因功能研究。但其應用范圍有限,適用于有一段克隆到的原始基因組序列,長度在10～15kb,且轉座子應滿足以下條件:①轉座子本身應該很短,易于操作,并對任何期望敲除區域有高效率;②在刪除目的區域后應留下足夠長的兩臂用于同源重組。這些都限制了轉座子的應用。基因敲除的方法三．基因捕獲載體系統基因捕獲技術是將突變基因導入小鼠ES細胞從而獲得小鼠基因組文庫,進行小鼠基因組的功能研究,它屬于大規模隨機敲除。典型的基因捕獲載體通常包括一個無啟動子的報道基因,并通過調控元件使含有小鼠基因組文庫的ES克隆很容易被選擇性培養基篩選出來。基因敲除的方法四．Hit和Run法Hit和Run法也稱進退策略。它包括兩次同源重組:第一步(Hit)用插入型載體進行同源重組,在靶位點插入帶有突變的基因組序列以及帶有兩個篩選標記(如neo和tk)的載體序列;第二步(Run)利用tk抗性篩選,富集發生去除了含有負篩選標記基因的載體序列的回復突變的克隆。Hit和Run法的不足之處是:①無法精確控制染色體內的同源重組,可能會失去攜帶突變的同源序列,而保留未修飾的內源片段;②整個過程需要采用兩種培養基分別進行先后兩次篩選;③無法同時引進多個位點突變。基因敲除的方法五.雙置換法雙置換法也屬于精細突變敲除。它首先用含有Hprt基因的打靶載體轉染Hprt-ES細胞,通過在次黃嘌呤、氨喋呤和脫氧胸腺嘧啶苷培養基中篩選并用PCR進行基因組分析,篩選發生同源重組、Hprt基因陽性克隆。然后用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉染上一步獲得的Hprt+ES細胞。同源重組發生后,突變序列將Hprt置換出來。這種方法的優點在于,第一步獲得的Hprt+ES細胞,除了可用于產生普通的基因剔除小鼠外,也可以作為將不同突變引入靶基因的基礎。基因敲除的研究和應用1.1在人類疾病動物模型方面的應用1.2基因和蛋白功能研究方面的應用1.3藥物依賴性研究方面的應用1.4毒理學研究方面的應用1.5免疫學方面的應用1.5免疫學方面的應用1.6治療措施研究方面的應用

在人類疾病研究方面的應用人類幾乎所有的疾病都與基因有關,基因敲除動物模型的建立,為研究人類疾病提供了一個嶄新方法,尤其是遺傳性疾病。OA1(眼球白化癥,ocularalbinism)是一種基因紊亂遺傳性疾病,能引起視力嚴重下降,斜視、光恐怖、眼球震顫。Incerti[3]通過敲除法去除小鼠OA1基因,眼科檢查顯示眼球底部黑色素不足,臨床癥狀表現與人的相似,從而用來研究OA1的發病機制。在基因和蛋白功能研究方面的應用klotho(kl)基因是Matsumura等在研究自發型高血壓時發現的與衰老有關的新基因[7]。kl基因主要在腎臟和腦表達,其表達產物有膜結合型和分泌型兩種蛋白異構體形式,二者可能分別是膜結合受體和體液調節信號蛋白。kl基因敲除小鼠過早出現和人類衰老相關的多種行為和病理生理改變,如壽命縮短、運動失調、性功能障礙、癡呆、白內障、動脈粥樣硬化、肺氣腫、骨質疏松、免疫功能降低等[8]。藥物依賴性研究方面的應用利用基因敲除技術可以選擇性敲除某一特定受體基因,獲得先天缺失該受體基因的動物,通過比較基因缺失動物和野生型動物在依賴性模型上的行為差別,可以準確判斷該受體所發揮的作用。阿片受體是阿片類物質直接作用的受體,不僅在介導阿片類鎮痛中發揮重要作用,而且也與精神活性藥物的依賴性有關。毒理學研究方面的應用金屬硫蛋白(MT)是細胞內富含半胱氨酸巰基(SH)的小分子蛋白,目前認為MT具有調節細胞內鋅和銅等功能性金屬離子的體內穩態、拮抗有害重金屬毒性、捕獲自由基、抗過氧化應激、抗凋亡和參與細胞生長調節等功能[17]。利用MT基因敲除小鼠還可進一步觀察多環芳烴化合物免疫毒性機制與MT之間的關系。另有研究選用MT基因敲除小鼠和野生型小鼠對DMBA的免疫毒性反應進行了觀察比較,結果發現DMBA對MT基因敲除的動物所造成的免疫損傷比含有MT的動物要明顯嚴重,提示MT對DMBA的免疫毒性具有明顯的保護作用。免疫學方面的應用近年來,在免疫學方面出現了幾十種免疫分子基因敲除動物模型,將免疫學研究特別是免疫耐受的研究推到一個新的階段。例如:TCR基因敲除后,小鼠胸腺發育不全,脾中B細胞增多;免疫球蛋白u鏈基因被敲除后,B細胞發育受阻;MHCI和II類抗原基因敲除后,小鼠缺乏CD4+、CD8+型T細胞;β2微球蛋白基因敲除后缺乏CD4+、CD8+型T細胞;RAG重組酶基因被敲除后,出現免疫球蛋白重排障礙等[18]。

治療措施研究方面的應用載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠是目前在動脈粥樣硬化(AS)治療研究領域中應用最多的基因工程動物。若干研究表明,通過正常體細胞基因轉移治療,可以延緩ApoE基因敲除小鼠AS病變的發展。內抑素是近年來發現的有效的血管新生抑制劑,Moulton和Kruger[19,20]發現通過大劑量持續注射內抑素全組蛋白能夠有效的抑制ApoE基因敲除鼠AS斑塊的發展。實驗證明,將正常小

治療措施研究方面的應用鼠的骨髓移植到ApoE基因敲除小鼠后,其血清中即可發現ApoE,而血漿清除脂蛋白的能力明顯增強,血清膽固醇亦達到正常水平。故認為骨髓移植是防止飲食所致小鼠AS的有效措施。

治療措施研究方面的應用人類器官移植在人類疾病治療中起舉足輕重的作用,但有兩大問題一直未得到解決:一是器官來源,目前器官來源主要是尸體,受到時間和運輸等條件的限制,在有些地方還涉及到宗教的問題;二是器官移植的免疫排斥反應。基因敲除動物模型可能會解決這兩個難題。Kuwaki等采用基因敲除法,將引起超

治療措施研究方面的應用急性排斥反應的半乳糖轉移酶基因敲除,用此方法培育的動物的器官可以移植到人體而無排斥反應。他們已成功培育半乳糖轉移酶基因敲除豬,且已經開展了將該基因敲除豬的心臟移植至狒狒體內的實驗,經移植后的狒狒存活了2-6個月(均值為78天),且均未出現超急性排斥反應的表現。參考文獻[1]陳系古,都同功.基因打靶技術在轉基因動物中的進展[J].中國實驗動物學雜志.1997,7:47-50.[2]黃冰,黃文革,陳系古,等.小鼠胚胎干細胞在六種培養體系的培養觀察[J].中國實驗動物學報,2000,8:1-6.[3]IncertiB,CorteseK,PizzigoniA,etal.Oa1knock-out:newinsightsonthepathogenesisofocularalbinismtype1[J].HumMolGenet.2000,9(19):2781-2788.[4]WittingPK,PetterssonK,Ostlund-LindqvistAM,etal.InhibitionbyacoantioxidantofaorticlipoproteinlipidperoxidationandatherosclerosisinapolipoproteinEandlowdensitylipoproteinreceptorgenedoubleknockoutmice[J].FASEBJ.1999,13(6):667-75.參考文獻[5]LehesteJR,MelsenF,WellnerM,etal.Hypocalcemiaandosteopathyinmicewithkidney-specificmegalingenedefect[J].FASEBJ.2003,17(2):247-249.[6]KisanukiYY,HammerRE,MiyazakiJ,etal.Tie2-Cretransgenicmice:Anewmodelforendothelialcell-lineageanalysisinvivo[J].DevBiol.2001,230(2):230-242.[7]UtsugiT,OhnoT,OhyamaY,etal.Decreasedinsulinproductionandincreasedinsulinsensitivityintheklothomutantmouse,anovelanimal