第七章免疫分析法藥學院藥物分析教研室2/2/20231【大綱要求】1、熟悉免疫分析法的基礎知識2、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學發光免疫分析法、熒光免疫分析法2/2/20232第一節：概述基本原理基本條件方法分類2/2/20233免疫分析法(Immunoassay，IA)：是指以特異性抗原－抗體反應為基礎的分析方法。1959年，由美國Yallow和Berson等人將放射性同位素示蹤技術的高靈敏性和免疫反應的高特異性結合起來，首先測定了糖尿病人血漿中的胰島素含量，從而創立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)。酶免疫分析法、化學發光免疫分析法、熒光免疫分析法、時間分辯免疫分析方法等。2/2/20234一、基本原理(一)競爭抑制原理實質都是抗原一抗體競爭結合反應Ag*：標記抗原Ag：未標記抗原Ab：特異抗體Ag*－Ab：標記抗原－抗體結合物，Ag－Ab代表未標記抗原一抗體結物K：平衡常數(K=K1/K2)。2/2/20235抗原－抗體反應須滿足以下條件：Ag*與Ag(待測物)必須是相同的生物活性物質；所加入Ag*和Ab的量應是固定的；Ag*與Ag的量之和應大于Ab的結合位點；Ag*、Ag及Ab須處在同一反應體系中。2/2/20236這種競爭抑制的數量關系成為免疫分析的定量基礎2/2/20237(二)競爭抑制曲線(劑量反應曲線)

用待測物的標準品配置一系列已知濃度的標準溶液，再加入一定量的標記抗原和抗體，待抗原抗體反應達到平衡后，測定系列標準溶液的Ag*－Ab的結合率。B代表結合的標記抗原；F代表游離的標記抗原；T代表總的標記抗原。2/2/20238B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag]2/2/20239(三)抗原一抗體反應的特點1．特異性一種抗原分子只能與由它刺激產生的抗體發生特異性結合反應。抗原的特異性主要取決于抗原決定簇(Cluster)的數量、性質及立體構型。抗體的特異性則取決于抗原結合段(fragmentofantigenbinding，IgFab)與相應抗原決定簇的結合能力。交叉反應(crossreaction)：結構相近似的其它藥物或化合物與抗體的結合。2/2/2023102．可逆性

抗原與抗體的特異性結合是由于兩者的分子結構及立體構型相互吻合，它僅發生在分子的表面，并依靠抗原一抗體分子間的靜電力作用、疏水作用、氫鍵作用及范德華引力等而存在。是可逆反應，改變反應條件可使結合物發生水解。2/2/2023113．最適比例性

抗原抗體的結合反應具有一定的量比關系。只有當抗原抗體兩者的分子比例合適時，才能發生最強的結合反應。以沉淀免疫反應為例2/2/202312二、基本條件三種基本試劑：標記抗原、未標記抗原和特異抗體(一)抗原及其制備1．全抗原與半抗原抗原(Antigen)：能在機體中引起特異性免疫應答反應的物質。物質的抗原性包括免疫原性和抗原特異性。免疫原性(Immunogenicity)：抗原注入動物體內后能促使動物產生特異抗體。抗原特異性(AntigenicSpecifiety)：抗原能與特異抗體相作用的性質。2/2/202313

1．全抗原與半抗原

全抗原：同時具有免疫原性和抗原特異性的物質。

半抗原(Hapten)：只能與特異抗體作用但不引起機體免疫應答的物質。

人工完全抗原：藥物(半抗原)本身不具免疫原性，只有當它們與某些大分子的載體物質(如蛋白質或多肽)共價結合后，才具有免疫原性。這種小分子半抗原和大分子載體物質結合后所形成的全抗原。2/2/2023142．人工抗原的制備(1)載體(carrier)的選擇：作為載體應考慮藥物與載體結合后其免疫活性是否高、溶解度是否大、對化學反應合有機溶劑導致的變形作用有足夠的抵抗力、價廉易得

載體的本質是蛋白質－動物血清蛋白最常用。

牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)(2)半抗原的選擇藥物本身必須具有合適的活性官能團，如-COOH，－NH2，－OH，－C＝O等。2/2/202315(3)載體與半抗原的結合①碳二亞胺法

利用碳二亞胺為縮合劑，將藥物分子中的羧基與蛋白質分子中的氨基相連形成肽鍵2/2/202316②混合酸酐法2/2/202317③戊二醛法④琥珀酸酐法2/2/202318⑤重氮化的對氨基苯甲酸法2/2/2023193．人工抗原的鑒定鑒定的目的：測定人工抗原（藥物）與蛋白質的結合比光譜分析法化學分析法放射性同位素法2/2/202320(1)光譜分析法

結合物水解后，光譜法測定水解藥物和蛋白質的含量，從而推算出它們的分子結合比。(2)化學分析法利用三硝基苯磺酸鈉或二硝基酚，測定蛋白質與半抗原結合前后游離氨基數目的差別。反應出蛋白質與藥物的結合程度，可求出結合物中藥物的含量。(3)放射性同位素標記法在制備人工抗原時，在已知量的藥物中加入定量的放射性同位素標記藥物，然后通過測定結合物中的放射性強度，便可計算出加入的標記藥物的總量中已與蛋白質結合的比例。2/2/2023214．標準抗原(Standardantigen)標準抗原:在免疫測定中用來制作標準曲線或制備標記抗原用的藥物標準品，是免疫分析的定量依據。蛋白質、多肽類可使用純度較低的產品，但一般不應低于90％，尤其是其中不能含有化學結構相類似的干擾雜質，否則會使樣品的測定結果偏高。2/2/202322(二)特異抗體的制備及鑒定1．特異抗體(SpecificAntibody)特異抗體:（高度特異性）是指抗原(免疫原)作用于機體產生免疫反應，在血清中產生的能與該抗原特異性結合的免疫球蛋白。在免疫球蛋白中，免疫球蛋白G(IgG)含量最高(約占70％)，是免疫分析中最常用的抗體。2/2/2023232．抗體的制備單克隆抗體(MonoclonalAntibody，McAb)：將預先免疫過的小鼠脾細胞與體外培養的骨髓瘤細胞，經細胞融合技術而得到的雜交瘤細胞。該瘤細胞通過體外培養，可大量復制，產生出特異的結構相同的均質抗體，此即單克隆抗體。多克隆抗體(PolyclonalAntibody)的制備是將抗原直接免疫動物而得到。抗體：單克隆抗體和多克隆抗體(抗血清)兩大類2/2/202324(1)免疫原的制備免疫原(Immunogen)：人工將抗原制成能刺激機體引起體液及細胞免疫反應的物質。水劑：抗原中加入一定量的無菌生理鹽水所制成的免疫原。福氏完全佐劑(Freund’sCompleteAdjuvant)：其制法是：取羊毛脂一石蠟油(1：3)混合，高壓滅菌，等體積地與一定濃度的抗原混合，按3mg/ml的量加入卡介苗，研磨或于無菌注射器中對拉，使之成為油包水的程度(放入冰水中不擴散)即可。福氏不完全佐劑在福氏完全佐劑中去掉卡介苗。2/2/202325(2)免疫接種動物

家兔不僅對抗原的免疫反應較好，而且產生的抗體也較均一，是首選的免疫動物。

羊、豚鼠

微量免疫法的免疫抗原量在微克級內，常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10mg左右，大量免疫法的免疫抗原量在50～100mg。2/2/202326(3)抗血清的獲得

采血時應注意無菌操作，盡可能將血放人面積較大的無菌容器中，先室溫凝固30min左右，再放人30℃溫箱約2h使凝固，最后放入4℃冰箱過夜。次日吸取血清，將血塊用無菌的玻璃棒輕輕撥離并搗碎，在4000－10000r/min離心20min，即得抗血清。大動物免疫羊部分采血家兔等小動物殺死動物一次性放血。2/2/2023273．抗體的鑒定(1)滴度(Titer)滴度又稱效價或工作稀釋度。滴度用免疫反應液中抗體(實指抗血清)的稀釋度表示，稀釋倍數越大，表示滴度越高。測定滴度可采用標記抗原法。RIA法測定抗血清的效價為例首先將抗血清用空白血清按比例稀釋，然后精密吸取各稀釋抗血清等量，分置若干支試管中，再于各試管中分別加入定量的放射性同位素標記藥物(設放射性強度為T)，溫育。待反應達到平衡后，于反應液中加人分離劑(如沉淀劑)，分離與抗體結合的標記藥物(沉淀部分)，測定各管中沉淀的放射性強度(B)，并計算各管中標記藥物的結合百分率(B/T％)。2/2/202328當抗血清稀釋度足夠低時，其結合率趨于極值，該值稱為“過量抗體結合率”(標記藥物全被結合)，如圖中曲線的AB段，可用來衡量標記藥物的質量。自AB段以后，隨著抗血清稀釋倍數增大，其標記藥物的結合率逐漸降低，實際工作中多采用結合率為50％時(C點)的抗血清稀釋度(D點)。2/2/202329(2)活度(Avidity)活度：抗體與相應抗原的親和力(Affinity)。活度可反映出抗體分子和抗原分子之間的結合能力。活度高，表明形成抗原一抗體結合物的速度快而解離小。抗體活度高低與免疫分析方法的靈敏度密切相關，它主要表現在劑量反應曲線的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，測定效果越好。2/2/202330(3)特異性(Specificity)特異性：抗原和抗體的結合能力與其它結構相類似的干擾物的結合能力的比較。如果抗體與抗原的結合能力越強，而與其它類似結構的干擾物結合能力(稱為交叉反應)越弱，則說明抗體的特異性越強。2/2/202331三、方法分類1．按標記物的種類分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)(3)化學發光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CIZIA)(4)熒光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay，FIA)2/2/202332熒光免疫分析法底物標記熒光免疫分析(Substratelabeledfluorescenceimmunoassay，SLFM)熒光偏振免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)熒光淬滅免疫分析(FluorescentQuenchingImmunoassay，FQM)熒光增強免疫分析(FluorescentEnchancementImmunoassay，FEIA)時間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TRFIA)2/2/202333

2．按是否加入分離劑分(1)均相免疫分析(Itomogeneouslmmunoassay)在某些免疫分析中，當抗原一抗體反應達到平衡后，反應液中結合的標記藥物與游離的標記藥物之中有一種不產生信號或信號消失，因此無需將反應液分作兩相，即可在均相溶液中進行測定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測定技術(enzymemultipliedimmunoassaytechnique，EMIT)。(2)非均相免疫分析(heterogeneousimmunoassay)在某些免疫分析中，當抗原一抗體反應達到平衡后，只有在反應液中加入分離劑，將游離標記藥物和結合標記藥物分開之后，才能測出各自部分的標記藥物濃度。否則，測定的是兩者的總濃度。由于這種信號的測定需將反應液分成液-固兩相后，才能分別測定，故稱為非均相免疫分析。如放射免疫測定(Radioimmunoassay，RIA)2/2/202334第二節放射免疫分析放射性同位素標記抗原F與B的分離技術放射免疫測定儀標準曲線的制備與樣品測定步驟方法評價應用舉例2/2/202335放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)：利用放射性同位素的測量方法與免疫反應基本原理相結合的一種同位素分析技術。特點：靈敏度高、特異性強、樣品用量少、標記物容易制備以及放射性強度容易檢測2/2/202336一、放射性同位素標記抗原

在體內藥物分析中，常采用放射性同位素。放射性同位素是指能自發放射出射線而變成其它元素的不穩定同位素。放射性同位素在發生核衰變時，會發射出α-射線，β-射線及γ-射線。用相關儀器檢測產生的射線，即可用于于定量分析。2/2/2023371．放射性強度放射性強度(嚴格說應為放射性活度)：每秒鐘放射性同位素的原子核發生的衰變數(desintegrationper-second，dps)，其單位為貝可(Bq)。1貝可相當于每秒1次核衰變，即lBq=1dps。1居里是指每秒鐘放射性同位素發生3.7×1010次核衰變。2/2/2023382．放射性比度放射性比度或稱比放射性或比活性：放射性同位素單位重量或體積中所含的放射性強度。

mci×g-1或mci×ml-12/2/2023393．放射性化學純度(放化純度)

放化純度是指供使用的放射性藥物中所需要的標記藥物的放射性強度占總放射性強度的百分比。一般實驗要求放化純度大于90％。2/2/202340(二)標記抗原(IabeledAntigen)

標記抗原又稱放射性標記藥物，供標記的藥物通常應是待測藥物的純品。標記抗原的純度決定RIA的特異性，而標記抗原的放射性比度則決定RIA的靈敏度。因此，標記抗原是RIA測定技術中最關鍵的成分。2/2/2023411．對標記抗原的一般要求①有高的放射性比度；②標記后抗原仍具有原來的抗原性；標記物穩定性要好，不致因輻射引起化合物分解。2/2/2023422．標記放射性同位素的選擇125I的特點是：①化學性質活潑，易于標記；②標記物在衰變中放出的γ－射線能量較高，易于測定；③標記物的放射線半衰期相對較短，須經常標記；④碘原子的半徑較大，標記后可改變藥物的化學結構或掩蓋藥物分子的特異功能基團，易使藥物分子的抗原性受到影響。3H的特點是：①用3H標記后的藥物可獲得較高的放射性比度；②標記后的藥物的抗原性不會受到影響，因為氫原子的半徑較小，且3H只是與藥物分子的1H發生交換，不涉及化學元素的改變③3H的半衰期很長，可達12～16年；④3H發射出的β射線能量較低，須采用價格較貴的液體閃爍計數器才能測定其放射性強度。2/2/202343(三)標記方法1．125I標記抗原的制備取代反應將其標記在藥物或藥物的衍生物上。用碘標記時一般采用氧化法，常用的氧化劑有H2O2及氯胺T等，目前應用最多的是氯胺T。氧化法是指先用氧化劑將放射性碘離子(I-)氧化成游離的放射性碘分子(I2)，然后再進行標記。大分子藥物可直接采用放射性碘標記。小分子物質一般先將藥物制成含酪氨酸、組氨酸或含酚基的衍生物，然后再進行標記，使藥物分子中的氫被帶正電荷的放射性碘取代。2/2/2023442．3H標記抗原的制備H標記可分為定位標記和非定位標記兩種方法。非定位標記通常采用氣體曝射法，即將藥物與氚(3H)氣密封在一起，放置幾天或幾周，使3H與藥物分子的1H發生交換定位標記采用特殊的合成路線，即先將3H引入藥物分子結構中的指定位置，制成含有不飽和雙鍵的標記藥物前體，然后再對雙鍵部位進行催化加氚。這種制備3H標記物的方法稱為定位標記.2/2/2023452/2/202346二、F與B的分離技術游離的標記藥物(F)和結合的標記藥物(B)1、沉淀法2、吸附法3、固相法4、雙抗體法2/2/202347(一)沉淀法用蛋白沉淀劑將抗體沉淀，從而可使與蛋白(抗體)相結合的藥物也一起沉淀下來，而游離的藥物由于未與蛋白結合，便留在于溶液中。常用的沉淀劑：硫酸銨、亞硫酸氫鈉、乙醇、異丙醇。方法：在免疫反應達到平衡后的反應液中加入一定量的飽和硫酸銨溶液，使最終濃度為1.6－2.0mol/L(約40％－50％的飽和度)，立即混勻，在4℃條件下反應20～30min后，離心，分離沉淀物，用40％的硫酸銨飽和溶液洗滌沉淀，然后測定放射性強度。優點：快速、簡便、價廉。缺點：不能使F和B完全分離，沉淀物對放射性標記抗原有非特異性吸附，因而空白值較高。2/2/202348(二)吸附法

吸附法是利用固體吸附劑能在反應液中吸附游離抗原的原理而使F與B分離。常用的吸附劑：右旋糖酐包裹的活性炭(DextronCoatedCarbon，DCC)、纖維素、硅酸鹽等。2/2/202349原理：DCC是利用活性炭的強吸附性和右旋糖酐的分子篩作用，使小分子的游離藥物能通過分子篩的網眼被內層的活性碳選擇性吸附，而與抗體相結合的藥物由于分子體積大則不能通過網眼而被留在液相中。方法：當免疫反應達到平衡后，于反應液中加入DCC吸附劑，待吸附達平衡后，離心。離心后的結果正好與沉淀法相反，上清液中是與抗體相結合的標記藥物(B)，而沉淀中則是游離的標記藥物(F)。優點：快速、簡便缺點：如藥物一抗體結合物的離解常數較高時，測定結果不穩定。2/2/202350(三)固相法原理：通過物理涂敷或化學結合方法將抗體結合在不溶性固相載體表面，待抗原與抗體形成結合物(B)后就附在固相物上，而游離的抗原(F)則仍留在反應液中，從而實行分離。該法實質上是一種固相免疫測定法(solid-phaseimmunoassay)，其固相本身就是一些特異的免疫吸附劑。常用的固相載體：葡聚糖凝膠、聚苯乙烯、纖維素、試管等。2/2/202351方法：采用試管固相法，即將抗體直接附著于試管底部的內壁上，測定時于試管中加入樣品和試劑，當放射免疫反應達到平衡后，結合物就附在管壁上，游離抗原則留在液相中。通過離心或采用簡單傾去法便可將兩相分離。優點：簡便、快速、實用。缺點：有時難以獲得重復的結合率，其次是固相載體本身也有可能吸附游離標記藥物，導致結果誤差增大。2/2/202352(四)雙抗體法分離原理：藥物(半抗原)與抗體結合后，雖然分子量增大，但還不足以生成沉淀而處于“溶解”狀態，這種抗體通常被稱為第一抗體，它可通過將抗原注入家兔、豚鼠等動物體內免疫獲得。然后再將第一抗體作為新的抗原注入羊、馬、牛等較大動物，則可免疫獲得第二抗體(抗一抗體)。當往第一抗體的反應液中加入第二抗體后，第一抗體能與第二抗體結合使分子量增大，從而生成沉淀。離心后與抗體結合的標記藥物(抗原-第一抗體-第二抗體結合物)處在沉淀中，而游離的標記抗原則留在上清液中。2/2/202353優點：分離效果好，適用范圍廣。缺點：抗體的制備有一定難度，且操作流程較長。2/2/202354三、放射免疫測定儀

一類是γ計數器(γ-Counter)，其所用的閃爍體是碘化鈉等固態閃爍晶體，為提高其發光效率，還在晶體內加入有0.1％－0.5％的鉈作為激活劑，該儀器適合測定125I、131I等同位素發射出的能量較高的β-射線。

一類是液體閃爍測量儀(LiquidScintillationCounter)，由于該儀器放出的β射線能量低、射程短，不可能穿人和激發固態閃爍晶體，而只能在特定的閃爍液中進行，由β-射線激發液體閃爍劑而產生閃光現象。該儀器適合測定3H、14c等同位素發射出來的β-射線。2/2/202355(一)測量原理

液體閃爍測量儀是利用放射性同位素標記藥物所發射出的β-射線能作用于閃爍液而發出熒光(閃光)，該熒光與放射性藥物在單位時間內的核衰變次數有關，通過檢測閃爍次數便可求出待測組分含量。2/2/2023561．溶劑作用：溶解閃爍劑和放射性樣品；同時還起著吸收和轉移β-射線能量的作用。條件：溶劑分子必須具有高度共軛的雙鍵，只要受到能量低的β-射線的輻射，其π電子就能躍遷至激發態。一類是烷基苯類，甲苯、對－二甲苯、1，2，4－三甲苯等，主要適用于脂溶性藥物的測定。另一類是醚類，1，4－二氧六環，適用于水溶性藥物的測定。種類2/2/2023572．閃爍劑作用：接受激發態溶劑分子退激時所釋放的能量→激發態→基態→發射出閃爍的熒光(光子)→光電倍增管→光電轉換測量系統記錄。要求：性能穩定、閃爍效率(閃爍劑放出光子的能量)高、淬滅耐受性好、發光衰減時間短。常用的閃爍劑有：對聯三苯(TP)、2，5－二苯基噁唑(PPO)、2－苯基－5－(4－聯苯基)－1，3，4－噁－二唑(PBD)等。2/2/202358(二)儀器簡介2/2/2023591．計數瓶計數瓶(或稱閃爍杯)：一個具蓋的玻璃或塑料小瓶(10～20m1)，用于盛裝樣品和閃爍液。當放射性藥物分子與閃爍液接觸時，溶劑吸收放射能量并轉給閃爍劑，閃爍劑將吸收的能量轉變為光能(熒光)，熒光透過計數瓶壁，進入光電倍增管。2/2/2023602．光電倍增管光電倍增管：光陰極、倍增極和陽極構成。進入光電倍增管的熒光(光子)通過光陰極表面的透明面板后，直接撞擊光陰極，光陰極吸收光子能量后隨即發射出光電子，光電子經數個倍增極依次放大，使電子數劇增。這些電子最后被陽極收集，產生一個電壓脈沖，并由記錄器記錄下來2/2/2023613．記錄器

用于記錄單位時間內所產生的電壓脈沖數，該脈沖數反映了單位時間內放射性藥物的核衰變次數(閃爍次數)。通常采用每分鐘計數(countsperminate，cpm)，作為放射性同位素藥物的放射性強度。2/2/202362四、標準曲線的制備與樣品測定步驟2/2/202363(一)標準曲線的繪制取標準抗原，用無放射活性的空白血清或血漿稀釋成5－8個系列濃度。加入定量標記抗原，其總放射性(T)應能滿足準確測量的需要。加入定量的已稀釋好的特異抗體，其抗體的量應滿足靈敏度的要求。將標準抗原、標記抗原、特異抗體與緩沖液混勻后，在適當條件下溫育，待反應平衡后測定總計數率(T)。2/2/202364加入分離劑，使結合部分(B)與游離部分(F)分離。測定各管結合部分或游離部分的計數率。標準曲線通常以標準抗原(待測藥物標準品)的濃度為橫坐標，以結合率(B％)為縱坐標作圖。縱坐標B％的計算有兩種方法：一種是將與抗體結合的標記藥物的放射性強度(B)與加入的標記藥物總放射性強度(T)比較，即B％=(B／T)×100％；另一種是用零標準管(不加藥物標準品)的放射性強度B0代替T比較，即B％=(B／B0)×100％。2/2/202365(二)樣品測定步驟下述情況樣品需進行簡單處理：測定方法不夠靈敏，可將被測物適當濃集；測定方法不很專屬，可將被測物與其它干擾物質分離；待測物以綴合物形式存在，可設法使其游離，然后進行測定。2/2/202366例：125I－RIA(DCC沉淀法)測定血清中地高辛濃度待測血清樣品50μl→樣品管中;含不同濃度地高辛標準品的血清50μl→標準曲線各管中;50μl空白人血清→零標準管.各管中依次加入保溫液100μl→抗體溶液100μl→125I標記的地高辛(溶液)100μl搖勻→在室溫(15～25℃)放置30min→γ-計數器測定各管的總計數T(即加人的協I總放射性劑量)→在電磁攪拌(或手搖)下，迅速向各管內加人1ml工作液(全部加完控制在5min內)，搖勻→離心10min(3000r/min)→傾去上清液→γ-計數器測定各管中沉淀的計數F(游離協I地高辛放射性強度)→計算出標準曲線各管和樣品各管的結合率。2/2/2023672/2/202368五、方法評價靈敏度高、特異性強、取樣量少、適用于大批量樣品的測定。需用放射性同位素標記抗原，其放射性對操作人員的健康、對環境的污染都會造成危害，而且還需有專用的同位素實驗室及免疫測定儀器，成本較高，因而使其普及受到限制。2/2/202369六、應用示例固相放射免疫分析試劑盒測定血清中地高辛濃度的方法1．主要試劑2．測定方法2/2/2023703．結果計算(1)標準曲線法以地高辛標準品血清濃度為橫坐標，B標／T(％)為縱坐標，在半對數坐標紙上繪出標準曲線。。以地高辛標準品血清濃度為橫坐標，但用(B標-BNSB)/(B0－BNSB)(％)為縱坐標作標準曲線，當測得血清樣品的(B樣－BNSB)/(B0-BNSB)(％)值后，也可從標準曲線上得到對應的血清藥濃2/2/202371(2)回歸方程計算法以logx為自變量(x為血清中地高辛標準品的濃度)，以logitY為因變量進行直線回歸2/2/202372第三節酶免疫分析法酶標記抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法評價應用示例2/2/202373

酶免疫分析(EnzymeImmunoassay，EIA)是以酶作為標記物的免疫測定方法。酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基礎上發展產生起來的一種新的免疫分析方法。2/2/202374一、酶標記抗原(一)標記酶的選擇特異性強，酶蛋白分子中應具有足夠的活性基團，以便能與藥物結合。活性要高，即當底物濃度低時，確有較高的催化反應率。酶的活性不易受樣品中其它成分影響，有較好的穩定性。酶的純度要高，且生物體液中應無標記酶、底物、抑制劑及其它干擾物質存在。酶的活性測量方法應簡單、靈敏、精密和快速。酶的來源、純化、供應等應方便、價廉。2/2/202375最常用的標記酶1．辣根過氧化物酶(HRP):約有50％的EIA使用此酶。2．堿性磷酸酯酶(AP):AP標記的結合物性質穩定，其活性可用分光光度計或熒光計測量。3．6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD):通常用于均相EIA。4．β-半乳糖苷酶(β-Gal):適用于均相EIA和非均相EIA。5．蘋果酸脫氫酶(MDH):多用于尿樣的均相EIA。2/2/202376(二)底物的選擇①無色、無毒能溶水；②化學性質穩定、不受光照的影響；③轉化率高，在酶催化下可產生大量的有色物質；④顯色產物的量在一定范圍內與酶的濃度或活性成正比；⑤應有終止酶反應的試劑。2/2/202377常用酶的底物1、辣根過氧化物酶的底物：鄰苯二胺（OPD）、5-氨基水楊酸（5-ASA）、四甲基聯苯胺及其硫酸鹽（TMB/TMBS）2、堿性磷酸酶底物：對硝基酚磷酸鹽溶液（p-NPP）、4-甲基傘酮基-磷酸鹽（4-MUP）3、β-D-半乳糖苷酶底物：鄰硝基苯－β-D-半乳糖吡喃苷（o-NPG）、氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃苷（CPRG）、試鹵靈-β-D-半乳糖吡喃苷（RG）4、葡萄糖氧化酶底物：與辣根過氧化物酶底物相同2/2/202378（三）：酶標記藥物的制備酶標藥物的酶活性和免疫活性決定了酶免疫測定法的靈敏度，因此酶標藥物成為EIA的關鍵。選擇制備方法應注意以下原則：（1）對酶和抗體的活性沒有影響（2）生成的結合物是可溶的、穩定的（3）反應條件易控制（4）制備方法簡單、能重現2/2/202379二、均相EIA均相酶免疫分析(HomogeneousEnzymeImmunoassay)是指酶標抗原(AgE)同抗體(Ab)結合后，所形成的酶標抗原一抗體結合物(AgE—Ab)可使酶的活性發生改變(增強或減弱)，且不需將游離的酶標藥物(AgE)與結合的(AgE一Ab)酶標藥物分開，就可直接通過測定酶活性的變化，求出樣品含量的方法。酶增強(放大)免疫測定技術(EnzymeMultipliedImnunoassay、technique，EMIT)，或稱“結合酶免疫分析法”2/2/202380(一)測定原理2/2/202381

EMIT法通常使用6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)作標記酶，其原理是標記在待測藥物上的G-6-PD在輔酶I參與下能將底物6-磷酸葡萄糖(G-6-P)氧化成6-磷酸葡萄糖酸，而輔酶I本身則被還原成還原型輔酶I(NADH)。在該反應過程中，輔酶I的結構發生了變化，導致NAD與NADH的紫外吸收光譜形狀不同，還原型輔酶I在340nm處有最大吸收，而輔酶I在此波長處則吸收甚小。2/2/2023822/2/202383(二)測定方法

未標記藥物(Ag)＋抗體＋輔酶I(NAD)＋底物(G-6-P)→抗原-抗體結合物Ag-Ab→酶標藥物(AgE)。酶標藥物與未標記藥物互相競爭有限量的抗體(Ab)，當這種競爭結合反應達到平衡之后，則有部分酶標藥物與抗體相結合，從而使結合酶標藥物(AgE-Ab)上的酶活性受到抑制，不能再同底物發生作用，而只有游離酶標藥物(AgE)上的酶才有活性，能作用于底物產生測定信號。如果樣品中待測藥物的濃度越高，則競爭抑制的結果使游離酶標藥物的量增多，亦即酶的活性隨著待測藥物濃度的增加而增強，故有“酶增強免疫技術”之稱。由于游離酶標藥物量的增多，能使更多的NAD參與氧化反應，生成更多的酶反應產物NADH。根據NADH在340nm處有紫外吸收的原理，便可用分光光度計測定吸收度，求出待測藥物的含量。2/2/202384三、非均相EIA非均相免疫分析：指酶標抗原(AgE)同抗體(Ab)結合后，形成的酶標抗原-抗體結合物(AgE-Ab)與游離的酶標抗原(AE)一樣，其標記酶都具酶活性。因此必須將AgE－Ab與游離的AgE分開后，再測定酶活性的變化，以求出待測藥物的含量。酶聯免疫吸附測定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)：將一種反應物固定在固相載體上，當另一種反應物與其結合后，可通過洗滌、離心等方法將液相中未結合的其它物質傾去，然后測定結合在固相上的酶活性。2/2/202385(一)測定原理2/2/202386(二)測定步驟