基于生物質的蛋白質N-糖基定性與定新技術本論文研究內容涉及分析化學、化學生物學等二級學科屬交叉學科研究領域。主要在生物質譜技術的基礎上,發展針對蛋白質型糖基化修飾定性與定量研究的創新性技術與方法,以準確高效地揭示蛋白質糖基化修飾的多方面信息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位點、糖鏈等。糖基化修飾是生命活動中最廣泛最復雜也是最重要的蛋白質翻譯后修飾之一,不僅影響著蛋白質的空間構象、生物活性、運輸和定位,且在分子識別、細胞通信信號轉導等特定生物過程中發揮著至關重要的作用糖蛋白根據其糖鏈結構及糖基化位點的不同可分為三大類蛋白糖蛋白和GPI錨定蛋白,其中又以N-糖蛋白分布最為廣泛。據推斷,有超過的蛋白質都發生了糖基化修飾,但是現有數據庫中只有約10%的蛋白質被注釋為糖蛋白,說明絕大多數糖蛋白尚未被發現。糖基化研究仍處于起步階段,缺乏高效的、成熟的技術手段。在后基因組時代,基于對蛋白質高通量統性研究的蛋白質組學迅速興起。而以軟電離為基礎的生物質譜技術為蛋白質組學的快速發展提供了有力工具。近年來,生物質譜技術同樣被應用于糖基化修飾的研究主要包括糖基化位點的鑒定和糖鏈結構的解析等方面,而針對糖蛋白糖鏈進行大規模研究的糖蛋白質組學和糖組學也隨之應運而生而,糖鏈屬非模板合成其結構極其復雜且呈二維結構,同時糖鏈離子化效率低分異構體多在質譜分析上仍存在諸多技術瓶頸。可見,糖基化領域的進一步發展亟待方法學上的新突破。本論文以生物質譜技術為基礎,從定性研究和定量研究兩方面,展了針對蛋白質N-糖基化修飾研究的新技術與新方法,致力于建立高效用的糖基化解析策略解決當今糖蛋白質組學與糖組學所面臨的技術難題。本論文工作的主要貢獻如下：成功將糖苷內切酶(Endo)應用于大規模、高通量的N-糖基化位點質譜鑒定,與傳統的肽糖酰胺酶(PNGase)形成互補并利用這兩種酶切路線,從大鼠肝臟組織中鑒定到大量尚未被發現或證實的N-糖基化位點(2)首次發現酶促N-糖18O標記反應,并基于此反應發展了酶促糖鏈還原末18O標GREOL技術,有效用于糖鏈的質譜相對定量,彌補了定量糖組學領域的一項技術空白(3)通過條件優化,首次實現了酶促N-糖鏈的完18O標記并基于此反應創新性地發展了酶18O4標記技術,成功用于糖鏈、糖肽非糖肽的一步定量分析,在一次實驗中實現了蛋白質糖基化的全方位定量解析發展了硼氫化鈉輔助的酶促N-糖鏈18O技術與18O+D雙標記技術,不僅大大增加了酶促糖鏈18O標記的穩定性更通過雙標記使糖鏈質量差異增加到3Da,大大降低了同位素峰重疊效應的影響針對上述幾點本論文分別從以下幾方面進行了闡述：基于糖苷內切酶(Endo)肽N-糖酰胺酶(PNGase)互補的大規模N-糖基化位點鑒定：蛋白質糖基化位點的大規模鑒定是糖蛋白質組學定性研究的重要內容。PNGaseF是目前普遍使用的鑒定糖基化位點的酶,該酶會使糖基化位點的天冬酰胺去氨基化并發生+0.98Da的質量變化以此作為標簽,即可質譜鑒定糖基化位點然而,高通量高效率的質譜分析難以兼顧靈敏度與分辨率這使得0.98Da質量差異的精確分辨在大規模的分析中難以得到保證。同時,天冬酰胺與天冬氨酸之間自然相互轉換也時有發生影響了糖基化位點鑒定的可信度。與PNGaseF不同,Endo酶切糖鏈后在糖基化位點上保留最后一個GlcNAc,形成203Da質量差異,以此為標簽鑒定的準確性大大提高。然而,目前Endo尚被應用于大規模的糖基化位點鑒定。本論文將EndoH與傳統PNGase結合對大鼠肝臟組織的高甘露糖型和雜合型N-糖基化進行大規模位點鑒定,成功將EndoH應用于高通量、大規模的糖基化位點鑒定。利用凝集素ConA親和富集、兩種切糖酶酶切、檢測分析的路線,共從大鼠肝臟組織中鑒定到1063非冗余的高甘露糖型與雜合型糖基化位點及相應560個非冗余的N-糖蛋白,其中大部分糖基化位點為首次發現為大鼠蛋白數據庫提供了大量新的糖基化修飾信息。該部分的研究意義與創新性如下：(1)首次將Endo用于大規模的N-糖基化位點鑒定證明了Endo應用于高通量糖蛋白質組學研究的可行性；(2)將PNGaseF與EndoH兩種酶切技術路線獲得的結果相結合,得到了更大的N-糖基化位點數據集其中包括大量尚未在大鼠中發現的N-糖基化位點與N-糖蛋白,顯示了兩種酶的非交蓋性與互補性(3)Endo酶切方法不僅提供了糖基化位點的糖鏈亞型結構還提供了糖基化位點的核心巖藻糖信息,對糖基化位點特異性與不均一性研究、核心巖藻糖化糖蛋白研究都具有重要意義；(4)對Endo與PNGase兩類酶在位點鑒定中的不同優勢與特點進行了深入分析與討論,簡而言之,PNGase可以獲得更多的鑒定結果,而Endo獲得的結果可信度更高；(5)分析了Endo酶切方法存在的問題與不足,為進一步的深入優化與改進提供了方向。糖苷內切酶(Endo)催化N-糖鏈18O標記及其在定量糖組學中的應用：隨著糖蛋白質組學的發展,針對蛋白質糖基化修飾的相對定量研究受到越來越多的關注,對探索生理病理過程中糖基化修飾的變化、尋找潛在的疾病標志物具有重要意義。高通量的糖鏈定量即定量糖組學,致力于研究不同生理病理條件下的復雜樣本中糖鏈在結構類型、組成以及連接、構象精細結構上的相對量的變化。與定量蛋白質組學類似,基于質譜的穩定同位素標記也是定量糖組學研究的有效手段和發展方向,目前建立的標記技術包括還原末端標記、全甲基化標記和代謝標記。酶促18O標記是定量蛋白質組學中一項重要的標記定量技術。酶促’8O標記的最大優勢在于其成本低廉、操作簡單、標記效率,因為標記反應在酶解過程中進行,除H218O外,不涉及任何額外的反應試劑,沒有額外的反應步驟,也不會產生副反應而,酶促18O標記在定量糖組學領域仍是一項空白。而在使用Endo進行進一步的研究工作時我們發現,當在H218O中進行Endo酶切時,釋放的N-糖鏈還原末端會被穩定地標記上一個原子。基于此反應本論文發展了酶促糖鏈還原末端18O標記GREOL(glycanreducing-end18Olabeling)技術,并創新性地建立了酶促糖鏈同位素標記定量策略。Endo酶促反應使所有酶切釋放N-糖鏈都可以穩定地標記上一個原子,且適用于所有Endo亞型基于該反應的GREOL術經質譜分析與去卷積修正后,在至少兩個數量級范圍內顯示出良好的線性與重復性及較高的檢測靈敏度,可有效應用于定量糖組學。利用該技術的特點,我們還實現了一些分子量相同而結構類型不同的N-糖鏈同分異構體之間的定量分辨了進一步證明GREOL對定量在復雜生物樣品中的可靠性,我們還將該技術應用于肝細胞肝癌相關定量血清糖組學研究。該部分的研究意義與創新性如下：首次發現在H218O反應體系中Endo在酶切釋放N-糖鏈的同時,穩定地在N-糖鏈還原末端引入一個18O原子,標記效率為100%(2)基于該反應建立了酶促同位素18O標記定量的GREOL技術,首次將酶促同位素標記應用于糖鏈的質譜相對定量彌補了定量糖組學領域的一項空白；(3)深入探討了Endo酶促18O標記的反應機理并建立了針對該標記的質譜數據去卷積修正方法,最大程度地避免同位素峰重疊造成的影響,使GREOL定量展示出良好的線性、重復性和靈敏度；(4)利用技術,首次實現了一些糖鏈同分異構體的定量分辨,使相對定量不再局限于相同結構的糖鏈之間,為定量糖組學研究提供了嶄新的視角用GREOL技術,發現肝細胞肝癌相關的血清N-糖鏈中,雙鏈復雜型糖鏈、平分型GlcNAc構水平、唾液酸水平均呈上調趨勢,提示肝癌的發生發展同這些結構的定量改變關系密切為進一步的功能研究找潛在的診斷標志物奠了基礎N-酰胺酶(PNGase)催化的一步標記及其在蛋白質N-糖基化定量研究中的應用與相比,傳統酶切的是糖鏈末端與糖基化位點間的酰胺鍵,其反應機制與糖苷酶完全不同。PNGase首先特異性識別并水解糖鏈還原末GlcNAc與位點Asn之間羰基與氨基形成的共價鍵,將Asn水解為Asp后,末端為氨基的糖鏈部分糖胺)釋放,再在溶液中進一步水解去氨基化,形成末端為羥基的糖鏈于在糖基化修飾研究領域的應用更為廣泛,我們曾嘗試催化糖鏈記的可能性。但研究結果表明,由于去氨基化反應本身是可逆的,即使溶液不含氨,糖胺水解后產生的氨仍會在一定程度上阻止去氨基化的完全發生溶液中仍會保留大量糖胺。剩余的糖胺在之后的純化過程當中發生進一步水解而純化過程中大量使用的普通H216O會使這部分糖鏈帶上16O,造成相當數量的糖鏈被標記為16O,無法用于相對定量。本論文通過進一步改PNGase酶切后溶液值,發現在酸性條件下,糖胺去氨基化可以完全發生,徹底轉變為末端為羥基的糖鏈。基于此現象我們在H218O配置的緩沖溶液中進行PNGase酶切并將酶切后溶液的pH調至酸性最終實現了PNGase催化下N-糖鏈的完全18O標記。在經質譜分析及去卷積修正后該方法在兩個數量級范圍內同樣表現出良好的線性與重復性。基于此,我們進一步將PNGasr酶促糖鏈18O標記、位點標記和trypsin酶促肽18O2標記結合,創造性地發展了18O4記,一次實驗中同時實現糖鏈、糖基化位點和糖肽的相對定量。我們將該技術應用于肝細胞肝癌相關血清蛋白的糖基化定量研究,發現了與肝癌相關的IgG糖肽、糖基化位點和N-鏈的定量改變。18O4標記策略實現了糖蛋白質組學與糖組學的一步定,極大地促進了這兩個領域的發展與融合。該部分的研究意義與創新性如下：通過使糖胺徹底水解,首次實現了PNGase酶促N-糖鏈還原末端180標記反應,記效率幾乎為100%(2)考察了該標記技術用于糖鏈相對定量的準確性、線性、重復性并探討了該技術與的互補性；(3)建立了酶促1804標記定量技術實現一步到位的糖鏈18O標記、糖基化位點18O標記和肽段18O2標記,用于糖鏈、糖肽糖基化位點、非糖肽/蛋白的同時定量用18O4標記定量技術對肝細胞肝癌相關血清進行了N-糖基化定量研究,并發現糖肽與糖蛋白水平并未發生明顯變化,而糖鏈卻呈現諸多改變,其中雙鏈和含平分型GlcNAc的糖鏈明顯增多而單鏈的糖鏈明顯減少,說明蛋白部分與糖鏈部分的定量改變并不一致這為進一步的研究和潛在診斷標志物的發現奠定了基礎。硼氫化鈉輔助的酶促糖鏈18O標記技術與雙同位素標記技術：本論文發展了兩種酶促糖鏈18O記技術,但這些反應僅能在糖鏈上標記一18O原子形成較小2Da子量差異,在質譜分析中易造成較為嚴重的同位素峰重疊現象。雖然該現象可以通過去卷積修正計算最大限度地避免但這還是增加了定量分析的工作量,并且兩組樣品需先分別檢測后才能混合檢測,由此造成的操作誤差也會比較大。除此之外,標記后糖鏈上的仍會同普通水中的16O發生緩慢交換,造成長時間在普通水中儲存的標記糖鏈摻入大量的標記,使定量效果大大折扣。為了解決上述問題,本論文進一步發展了硼氫化鈉輔助的酶促18O標記技術與’8O+D雙標記技術,即在酶促糖鏈18O標記反應完成后向反應體系中加入氘代硼氫化鈉,使糖鏈還原末端發生還原,半縮醛斷開氫形成糖醇結構,并標記上一個氘原子。而還原后的糖鏈不再含有還原末端也不會再同溶液中的氧原子發生任何交換,使18O標記更加穩定。同時,標記的氘原子使兩組樣品的分子量差異擴大到大大降低了同位素峰的重疊程度,使糖鏈酶促定量分析更加簡單、可靠。我們通過實驗考查了該方法的標記穩定性與同位素峰重疊性,均取得了很好的效果。通過氘代硼氫化鈉的輔助標記我們改進了N-糖鏈的酶促18O標記技術進一步推動了該技術在定量糖組學中的廣泛應