阿司匹林抗氧化作用

機制的探討主要內容研究背景實驗目的作用機制實驗方法、實驗分組、實驗操作、檢測指標

統計學分析預期結果可行性分析研究背景阿司匹林是臨床常用的抗炎`抗血栓藥物,其作用主要是通過抑制前列腺素的合成及環氧化酶的激活而實現的.最新的研究顯示阿司匹林還具有對抗過氧化物的損傷`保護血管內皮細胞完整性的功能,其作用可能與誘導某種保護性基因表達,抑制活性氧的反應,特別是阻止鐵介導的氧自由基形成有關.而近期發現鐵蛋白可以快速結合細胞內游離鐵,阻止其通過Fenton反應產生羥自由基對細胞的氧化損傷.因此,本研究欲證實阿司匹林的抗氧化作用是通過影響內皮細胞鐵代謝`增加鐵蛋白表達而實現的.阿司匹林的抗氧化作用機制鐵蛋白：鐵蛋白是一種貯存鐵元素的可溶性蛋白質，鐵蛋白占體內儲存鐵的三分之一，是檢測人體體內是否缺鐵最靈敏的一項指標。也是檢測肝臟是否存在疾患的重要指標之一，也是常見的乙肝（乙型病毒性肝炎）檢查項目之一鐵蛋白是鐵的貯存蛋白，體內游離的二價鐵可通過Fenton反應催化產生OH造成細胞的氧化損傷。由于鐵在生物體內的含量較其他金屬元素的總和還多得多，因此。它被看作是這類反應的主要催化因子。而鐵蛋白與鐵有很高的結合力，lmol的鐵蛋白可結合4500mol的鐵，貯存在鐵蛋白中的鐵是三價形式，已喪失催化活性。因此，鐵蛋白被看作是鐵的生理性螫合劑，具有封閉隔離游離鐵與活性氧分子的反應，是過氧化反應的抑制劑-。而發現阿司匹林具有誘導鐵蛋白表達的作用，對于解釋其在各種炎癥及心血管疾病中良好的預防和治療效果將有重要得意義。阿司匹林的抗氧化作用機制Fenton反應過氧化氫與催化劑Fe2+構成的氧化體系通常稱為Fenton試劑。在催化劑作用下，過氧化氫能產生兩種活潑的氫氧自由基，從而引發和傳播自由基鏈反應，加快有機物和還原性物質的氧化。Fenton試劑一般在pH3.5下進行，在該pH值時羥基自由基生成速率最大。氧自由基的作用：氧自由基的過氧化殺傷，主要是破壞細胞膜的結構和功能，破壞線粒體，斷絕細胞的能源，毀壞溶酶體，使細胞自溶。同時它對人體的非細胞結構也有危害作用，可以使血管壁上的粘合劑遭受破壞，使完整密封的血管變得千瘡百孔，發生漏血、滲液，進而導致水腫和紫癜等等。說明阿司匹林是通過調節細胞鐵代謝增加可用于清除鐵的蛋白apo-ferritin(膜脫鐵鐵蛋白)的合成這類鐵蛋白由于處于未飽和狀態與Fe3+有極高的親和性抑制了Fenton反應能有效地阻斷氧自由基的產生而達到抗H2O2損傷的作用實驗目的探究阿司匹林抗氧化作用的機制；學習內皮細胞的原代與傳代培養的方法；觀察不同濃度的阿司匹林在抗H2O2

損傷內皮細胞過程中誘導鐵蛋白(Fn)表達的情況；培養我們的科研探討的思維、團結協作和互相交流的能力。實驗材料I型膠原酶、TritOnX-100、Ferritin、Apo-ferritin、阿司匹林、消炎痛、水楊酸鈉均為Sigma公司產品；內皮細胞生長因子、Ⅳ型膠原包被的6孔培養板為Roche公司產品；細胞因子及內毒素(LPS)為北京邦定公司產品;M199培養液(GIBC0BRL公司)；小牛血清、胰蛋白酶、30%H2O2、兔抗人Ⅷ因子血清等為國產制品。實驗方法人臍靜脈內皮細胞的培養及鑒定,使用膠原包被的6孔培養板并加入內皮細胞生長因子(10ng/ml)進行臍靜脈內皮細胞原代培養。待細胞長滿2/3板底并融合成單層時進行傳代,接種于22mm×11mm蓋玻片上。倒置顯微鏡觀察細胞呈鋪路石樣鑲嵌單層排列,鑒定使用辣根過氧化物酶法(PAP法)檢測Ⅷ因子相關抗原。實驗分組實驗分組使用傳2~3代的內皮細胞進行實驗,分為對照組和實驗組。

實驗操作在培養的內皮細胞中加入0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林,孵育24小時后收獲細胞測鐵蛋白含量；僅用1mmol/L的阿司匹林處理細胞,分別在4、8、16和24小時收獲細胞測定鐵蛋白含量；用0.1mmol/L的去鐵胺及50umol/L的FeCl3預先孵育細胞6小時后加入1mmol/L的阿司匹林,24小時后收獲細胞測鐵蛋白含量。實驗操作以上各對照組加入等體積的M199液培養相同時間后收獲細胞測鐵蛋白。最后將濃度分別為0.1mmol/L、1.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林及1.0mg/ml的Ferritin(已飽和鐵)、1.0mg/ml的apo-ferritin(去鐵蛋白)加入細胞中預先孵育8小時后,再加入濃度為0.5mmol/L的H2O2,對照組僅加入0.5mmol/L的H2O2,孵育24小時。實驗結束時用倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化,計數活細胞數,測上清夜中MDA含量及細胞LDH釋放率。檢測指標細胞內鐵蛋白濃度(OD)細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率培養液中丙二醛(MDA)細胞存活率細胞內鐵蛋白濃度使用鐵蛋白ELISA試劑盒,取胞漿蛋白質懸液50ul,按說明書進行操作,并在450nm波長的酶標儀上讀取OD值。以各標準品的OD值為縱軸,鐵蛋白濃度為橫軸,繪制鐵蛋白濃度標準曲線。培養液中細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率

LDH采用常規生化法,分別將測得的培養液中LDH及細胞裂解懸液中LDH值通過下列公式計算LDH釋放率,以校正因為各組細胞數的差異而對培養液中LDH值的影響。公式如下:

培養液中MDA采用常規生化法,按試劑盒(晶美公司)說明書操作細胞存活率

0.5%臺盼藍染色細胞,死細胞被染成淡藍色,而活細胞拒染,分別計數活細胞和死細胞數目,根據以下公式計算細胞存活率:

統計學分析

測定結果以表示,統計學分析采用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗.

預期結果不同劑量的阿司匹林誘導內皮細胞鐵蛋白的表達：鐵蛋白表達的量與阿司匹林濃度之間顯示出劑量依賴的關系。不同處理時間阿司匹林誘導鐵蛋白的表達：鐵蛋白的表達隨AS處理時間的延長而逐漸升高,兩者間有時間依賴關系。細胞內鐵對阿司匹林誘導鐵蛋白表達的影響：去鐵胺(DFO)能消除AS誘導鐵蛋白增加的作用,鐵蛋白濃度下降，比單用AS(1.0mmol/L)組鐵蛋白濃度低；加入FeCl3后鐵蛋白增加，具有明顯促進AS誘導鐵蛋白增加的作用。預期結果阿司匹林誘導內皮細胞抗H2O2

氧化損傷的作用：正常細胞加入0.5mmol/L的H2O2孵育24小時后細胞絕大部分死亡,LDH釋放率及MDA明顯增高；但加入0.1mmol/L的AS能抵抗H2O2的損傷作用,細胞存活率及LDH釋放率及MDA與損傷組比較有顯著性差異，且隨AS劑量的增大,抗H2O2損傷的作用增強。Ferritin(已飽和鐵)組對細胞無保護作用,而未含鐵的apo-ferriein則對細胞有明顯保護作用,其結果類似0.1mmol/L的阿司匹林?？尚行苑治霾牧系目尚行员緦嶒炇褂玫乃幤?培養基質均為實驗常用品,容易獲得方法的可行性1.人臍靜脈內皮細胞的培養及鑒定:Jaffe內皮細胞培養方法及辣根過氧化物酶法(PAP法)鑒定均是實驗室常用方法,操作已很成熟.2.實驗分組