ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T2835—2022PCR發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局2023-01-082022-12-08DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國二連海關(guān)、內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理評審查驗中心。本文件主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、常鴻、包勇敢、荊文魁、騰克、趙治國。DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。DB15/T2835—2022每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法范圍本文件規(guī)定了馬駑巴貝斯蟲PCR法和實時熒光PCR檢測方法。本文件適用于馬屬動物馬駑巴貝斯蟲病的分子生物學(xué)診斷。（GB/T6682 GB/T27403 1Ct1Ct值 cyclethreshold實時光 PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴(kuò)增過程。聚合鏈反應(yīng) polymerasechainreaction；PCRDNA（deoxyribonucleicacidDNA經(jīng)過DNADNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribonucleoside）DNA25～30106。馬駑貝蟲 babesiosiscaballi下列術(shù)語和定義適用于本文件。縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR:（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]GB/T6682DNACTAB。2。。蛋白酶K溶液(20mg/mL)。三氯甲烷。異丙醇。75%乙醇。Taq酶。dNTP（2.5mmol/L）。PCRbuffer。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）（50bp～500bp）。實時熒光PCR預(yù)混液。DNAB。DNA。空白對照：ddH2O。引物及探針:見表1。Tris-HCl2。。蛋白酶K溶液(20mg/mL)。三氯甲烷。異丙醇。75%乙醇。Taq酶。dNTP（2.5mmol/L）。PCRbuffer。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）（50bp～500bp）。實時熒光PCR預(yù)混液。DNAB。DNA。空白對照：ddH2O。引物及探針:見表1。表1 馬駑貝蟲測物探針檢測方法引物/探針序列（5’-3’）擴(kuò)增片段PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′實時熒光PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′探針（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′PCRPCR法DNAADNADNA，DNAPCR法DNAADNADNA，DNADNAA260/A2801.7～1.9PCRPCR反應(yīng)體系為50L，體系組成見表2。38 使用添加EDTA抗凝劑的采樣管無菌采集血樣。高速臺式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm）。（3000rpm）天平（感量0.01g）。單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7 DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022表2 PCR增應(yīng)系成試劑名稱貯備液濃度反應(yīng)體系體積L10×Buffer(含Mg2+)－5Taq酶5U/L0.25dNTP2.5mmol/L5上游引物（F）10mol/L2下游引物（R）10mol/L2模板－2ddH2O－補(bǔ)足至50檢測過程分別設(shè)陰性對照、陽性對照和空白提取對照。PCR預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5L～8LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合點樣。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并記錄。質(zhì)控對照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實驗：200bp200bp200bp200bp200bpPCRPCR實時熒光PCR檢測DNA同7.1.1操作。PCR4反應(yīng)體系體積為25L，見表3。表3 熒光量PCR增應(yīng)系組成試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積LPCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5上游引物（F）101下游引物（R）101探針（P）101模板—2ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25檢測過程分別設(shè)陰性對照、陽性對照和空白提取對照。預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40個循環(huán)。在58℃時收集熒光信號值。質(zhì)控對照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實驗：Ct40.0；Ct40.0；Ct35.0。，2Ct40.0，2Ct35.01Ct35.0～40.0DNAPCRCtCt40.09防止交叉污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。5附錄A（資料性）溶液配制及提取方法CTAB將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。DNA64000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～65064000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC77附錄B（規(guī)范性）馬駑巴貝斯蟲的目標(biāo)擴(kuò)增序列CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCT