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發(fā)布發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023-01-082022-12-08ICS67.120.01CCSICS67.120.01CCSB45內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T2833—2022PCRReal-timePCRmethodfordetectionofcanislupus-derivedmaterialsDB15/T2833—2022DB15/T2833—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。本文件由中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本文件起草單位:中華人民共和國(guó)二連海關(guān)。本文件主要起草人:王伊琴、陳少博、包勇敢、楊帆、荊文魁、蘇日娜、張志峰、常鴻、寇福軍、趙治國(guó)。DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022DB15/T2833—2022115 下列縮略語適用于本文件。CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR(polymerasechainreaction)TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris:三(羥甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]4 縮略語Ct值 cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)光 PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過程。下列術(shù)語和定義適用于本文件。狼源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍本文件規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中狼源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。(0.15ng/L。(GB/T6682 GB/T27403 22DNA提取DNADNADNAA260/A280在1.7~1.9PCR實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)7.2.1 反應(yīng)體系體積為25.0L,見表1。實(shí)時(shí)熒光PCR儀(加熱速率10℃/s以上)。高速臺(tái)式離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速12000rpm)。(3000rpm)天平(感量0.01g)。單孔道微量移液器:0.5L~10L、10L~100L、20L~200L、100L~1000L。7 GB/T6682上游:5′-CCGTACTCTAGCTTACATA-3′;下游:5′-GAGACCTTCCAGATGAAA-3′;5′-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3′。DNA。Tris-HCl(pH8.0NaCl。。K20mg/mL)75PCRDNA,B。DNA。ddH2O。6 表1 狼源成實(shí)光PCR檢測(cè)法反體系試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積LPCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5上游引物(F)10.01.0下游引物(R)10.01.0探針(P)10.01.0模板—2.0ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25.0檢測(cè)過程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白提取對(duì)照。7.2.2 94℃,3min94℃,1060℃,1060℃時(shí)收質(zhì)量控制質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿足以下條件,否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn):Ct35.0;Ct35.0;Ct28.0。結(jié)果判定,2Ct28.0,2Ct28.01Ct28.0~35.0DNAPCRCtCt28.0結(jié)果表述檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。3444000rpm/min~5000r/min離心10min。1m)EP2m管0301200rm10min。600L~650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl(2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min,12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。,6015s~20s(。100LTEbuffer或DEPC附錄A(資料性)溶液配制及提取方法CTAB將5gCTAB,20.45gNaCl,3.03gTris,1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中,用鹽酸調(diào)pH8.0后,定容至250mL,115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl,定容至100mL,115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl,定容至400mL,115℃高壓15min。DNA0.5g~11.5mL~3.5mLCTAB12L~20L根據(jù)CTAB265℃至少1h(CTAB,1mL10。55附錄B(規(guī)范性)狼源性成分的目標(biāo)擴(kuò)增序列142bpCCGTACTCTAGCTTACATAACTCAG
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