第四章抗體制藥2023/2/11掌握：單克隆抗體的制備原理、方法及基本過程；單克隆抗體藥物靶標的選擇；基因工程抗體的類型。熟悉：噬菌體抗體庫技術的原理和基本過程；單鏈抗體、雙特異抗體的制備方法；轉基因動物表達抗體的方法。了解：抗體藥物的發展趨勢。學習要求:第一節概述第二節單克隆抗體及其制備第三節基因工程抗體及其制備第四節噬菌體抗體庫技術第五節轉基因動物表達抗體第六節抗體治療藥物2023/2/13內容第一節概述一、基本概念抗體（antibody，Ab）：指能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白IgAb化學結構上的概念生物學功能上的概念2023/2/14抗體工程制藥：利用基因工程、細胞工程和轉基因動植物技術生產抗體藥物的過程。2023/2/15免疫球蛋白（抗體）的基本結構1、重鏈和輕鏈重鏈可分為α、δ、ε、γ、μ鏈；輕鏈可分為κ、λ型。抗體的類型由重鏈類型決定，上述重鏈分別對應了IgAIgDIgEIgGIgM2、可變區和恒定區

重鏈和輕鏈N端第一個結構域為可變區（variableregion,V區)，輕鏈其余的1個及重鏈的3-4個結構域為恒定區；

V區存在3個高變區也稱互補決定區(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4個骨架區（frameworkregion,FR1~4).三個高變區共同組成Ig的抗原識別部位，形成與抗原決定基互補的表位。

2023/2/172023/2/18多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質，對其產生的抗體也是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體。單克隆抗體：針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產生的、高度特異、均一、來源穩定、可大量生產的抗體。多抗與單抗傳統抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結B細胞多克隆抗體制備過程1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開單克隆抗體制備過程疾病的診斷和治療：診斷:檢測與某些疾病相關的抗原，輔助臨床診斷。臨床治療：如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，對器官移植排斥反應有顯著抑制作用，用作免疫抑制劑。作為載體制備導向藥物（Antibodydrugconjugates,ADC）治療腫瘤。2023/2/111抗體的應用需解決的問題：鼠源性單克隆抗體的免疫原性（HAMA）；完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度；延長半衰期。其他2023/2/112基本消除了單克隆抗體的鼠源性（免疫原性）,鼠源氨基酸只占完整抗體分子的1/80~1/3，只保留同抗原特異性結合的活性。制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。2023/2/113基因工程技術為解決問題提供了可能二、抗體工程發展歷程及趨勢1890年，Behring和北里柴三郎發現白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β）球蛋白、丙種（γ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1976年，SusumuTouegava（利根川進）揭示了抗體多樣性的遺傳學基礎。1984年報道了人—鼠嵌合抗體多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體2023/2/1142023/2/115整體水平抗體生成技術細胞工程抗體生成技術

基因工程抗體生成技術多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術

噬菌體抗體庫技術Ig基因轉基因小鼠抗體真核表達技術商業化的抗體藥物2023/2/1162023/2/1FDA批準的抗體藥物全抗體37個（至2014.10月）抗體片段3個ADC3個（1個已撤市）雙特異抗體2個Fc融合蛋白7個鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda2014年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癬TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957結腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/2013年14個抗體藥物銷售過10億美元2023/2/119110.265.687.7683.867567.51生物藥物專利懸崖Pharmaceuticals2012,5,1393-1408生物技術藥物研發熱浪涌向中國重磅化藥銷售Pharmaceuticals2012,5,1393-1408第二節單克隆抗體及其制備2023/2/122一、抗體分子的結構與功能二、單克隆抗體的制備

(1)Fab段2個抗原結合片段

fragmentwithantigenbinding

(2)Fc段1個可結晶片段

fragmentcrystallized

Porter木瓜蛋白酶

(1)F(ab’)2段1個

結合顆粒性抗原出現凝集反應

(2)Fc’段1個

無生物學活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗體分子的結構與功能

（1）、輕鏈（lightchain，L鏈）

214個氨基酸殘基，24KD。分為：κ與λ

2個亞型。（2）、重鏈（heavychain，H鏈）

450-550個氨基酸殘基，55-75KD。分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈。

IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。

2、重鏈和輕鏈3、可變區和恒定區（1）可變區（Variableregion，V區）

L鏈N端1/2處（VL）110個aa;

H鏈N端1/5-1/4處（VH）118個aa。HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3

骨架區（frameworkregion,FR）高變區（hypervariableregion,HVR）

互補決定區（complementarity-determiningregion,CDR），

（2）恒定區（constantregion，C區）

L鏈C端1/2處，105個aa;H鏈C端3/4-4/5處，331-431個aa。

在同一種屬動物中是比較恒定的,是制備第二抗體進行標記的重要基礎。4、功能區鏈內二硫鍵折疊成球形區稱為功能區，約由110個aa組成。（1）L鏈：2個，VL，CL各1（2）H鏈：

IgG，IgA，IgD：4個（V區1個，C區3個）

IgM，IgE：5個（V區1個，C區4個）

（3）功能區的作用：（a）VL和VH：結合抗原決定簇（FV區）（b）CL和CH：具有同種異型的遺傳標記（c）CH2：結合補體（d）CH3：結合Fc受體

單核細胞，巨噬細胞，粒細胞，B細胞，

NK細胞

5、抗體基因結構2023/2/127人類編碼Ig的基因分別位于不同的染色體重鏈（Heavychain)基因：位于14號染色體；輕鏈基因：κ鏈基因位于2號染色體；λ鏈基因位于22號染色體。每條肽鏈的編碼基因可分為V區和C區兩大部分。V區的基因是由不同的基因片段拼接而成的重鏈V區：由V、D、J片段拼接；輕鏈V區：由V、J拼接。C區拼接決定了抗體的類別（

μ、γ、α、δ、ε）胚系重鏈的基因結構：(a)鼠(b)人重鏈的VDJ重組2023/2/129輕鏈基因胚系及重排后結構抗體類別轉換2023/2/131V區功能：識別并特異性結合抗原C區功能：激活補體系統：抗體與抗原結合形成復合物可通過啟動C1q激活補體經典途徑及補體旁路途徑；介導免疫細胞活性：抗體的調理作用；ADCC作用；介導超敏反應。穿過胎盤和黏膜：IgG是唯一能從母體通過胎盤屏障轉運到胎兒體內的抗體；IgA合成的主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染的主要物質。2023/2/1325、抗體的功能2023/2/133抗體功能（C區）-ADCC2023/2/134抗體功能（C區）-CDC2023/2/135IgG4、IgA、IgE二、單克隆抗體及其制備2023/2/136抗原與動物免疫細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養篩選陽性克隆與克隆化雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的純化單克隆抗體制備原理37單克隆抗體制備的基本技術1、抗原與動物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原；制備特定抗原的單克隆抗體，要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。可以用化學合成：地高辛多數抗原物為混合物用整個腫瘤細胞做為免疫原，經過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細胞而不存在于正常細胞上的表面標志分子的單克隆抗體。免疫動物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫方法：體內免疫和體外免疫(體外致敏淋巴細胞)。

體內免疫法：

適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用8～12周齡雌性鼠。

顆粒性抗原（細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，追加免疫1～2次。可溶性抗原：按10～100μg抗原/小鼠與福氏完全佐劑和滅活的分枝桿菌等量混合后注入腹腔內，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細胞分裂。二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養

基本方法：脾細胞（1*108）與骨髓瘤細胞（2*107~3*107）混合，在PEG作用下誘導融合(2min)，用培養液將PEG融合液緩慢稀釋。骨髓瘤細胞：SP2/0、P3.653，為缺陷性。PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑；常用濃度為40%~50%，相對分子質量4000為佳。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合細胞融合的步驟：將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1～10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置60秒再于5分鐘內邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用再靜置10分鐘。可生產有用抗體的

淋巴細胞

若與

癌細胞融合，則形成穩定而可培養的細胞株。癌細胞可培養生長漿細胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養生長產生專一性抗體一個Bcell只產生一種抗體細胞融合液中如何去除脾-瘤以外的融和細胞？

解決方法：選擇性培養基(HAT）

HAT培養基篩選雜交瘤細胞HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。m核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶胸腺嘧啶核苷激酶葉酸拮抗物2023/2/146選擇性培養方法：將融合的細胞懸浮于HAT的培養液，加入到96孔板內每2~3天換液一次。換液時吸去1/2~2/3培養液，加入等量的新鮮培養液。7天內:用HAT培養液，殺死瘤-瘤融合細胞后，第7~14天:改用HT培養液，14天以后:用普通的RPMI1640完全培養液。從融合后8~9天就可對所有克隆生長孔的培養上清進行抗體檢測，篩選出產生抗體的陽性克隆。大量細胞在HAT培養基中死亡，單個或少數雜交瘤細胞不易存活？解決辦法：飼養細胞小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞最適的條件下,105個脾細胞形成1個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在HAT培養液中相繼死亡，單個或少數的雜交瘤細胞多半不能存活，加入飼養細胞才能使其繁殖。原因:飼養細胞能釋放某些生長刺激因子能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性小鼠腹腔巨噬細胞還能清除死亡細胞，故應用較多。三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克隆：產生特定抗原的抗體產生細胞:占所有脾細胞的5%微量、快速、特異、敏感、簡便，并一次能檢測大批標本的方法。檢測方法：免疫酶技術；免疫熒光技術；放射免疫技術；FACS2023/2/150ELISA1、精制破傷風毒素抗原（）吸附（約10g/ml，4℃，3h）洗滌2、加雜交瘤培養上清液（）（4℃，1h）3、加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（）（4℃，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風抗體的篩選2023/2/152（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法應盡早克隆化:含不分泌細胞,多株分泌細胞,染色體易丟失克隆化：單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養過程。其中每個細胞的生物學特征和功能完全相同。一般3次克隆化，才能達到100%孔內均為抗體陽性細胞克隆。常用的克隆化方法有：有限稀釋法、軟瓊脂法、流式細胞法。2023/2/153有限稀釋法：通過適當的稀釋達到分離單個細胞進行培養的目的：雜交瘤細胞懸液稀釋，加入到96孔細胞培養板，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。例：取出陽性孔內的細胞進行計數；用培液將其稀釋到例如每毫升內10個細胞；如果在96孔板內每孔加0.1ml，其機率將為每孔內落入一個細胞；加入一定數量的飼養細胞，經過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔；據檢測的陽性結果再次進行克隆化。2023/2/154軟瓊脂法：培養液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠細胞分裂后形成小球樣團塊，用毛細吸管將小球吸出團塊打碎后移入96孔板繼續培養可吸出大量克隆細胞進行培養，因初代細胞很不易增殖，所以該法容易成功。2023/2/155

四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定（一）雜交瘤細胞鑒定：鼠脾細胞染色體數:40，端著絲粒;小鼠骨髓瘤細胞染色體:SP2/0細胞為62~68，NS-1為54~64，中部和亞中部著絲點;雜交瘤細胞的染色體數目:親本細胞數目總和，多數為端著絲粒，少數標志染色體;染色體數目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；

Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養液的稀釋度表示

表位測定：競爭抑制法親和性測定：測定親和常數K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量：常用westernblot（二）抗體性狀鑒定五、單克隆抗體的制備（1）體外培養法：可獲得10g/ml的抗體；多采用RPMI1640培養液，添加10%~20%胎牛或小牛血清。（2）動物體內誘生法：可獲得5~20mg/ml的抗體。目前多采用2023/2/158體內誘生法：因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自BALB/c小鼠，所以應選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。可于注入細胞的幾周前，預先將具有刺激性的有機溶劑降植烷（pristane）注入腹腔內，以破壞腹腔內膜，建立雜交瘤易于增殖的環境。優點：操作簡便，經濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株2023/2/159小結六、單克隆抗體的純化動物體內誘生法制備單克隆抗體具體純化方法及過程1、澄清和沉淀處理離心1000g×5min：去除殘留的小顆粒物質（小鼠腹水中含有紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質等）；0.2m的微孔濾膜過濾：除掉污染的細菌、支原體和脂質；用飽和硫酸銨沉淀抗體：50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2023/2/1621.名詞解釋：抗體；免疫球蛋白；多克隆抗體；單克隆抗體2.單克隆抗體有哪些不足？如何改造？3.大量制備單克隆抗體的方法主要有哪些？4.制備單克隆抗體的一般流程是什么？（如何制備雜交瘤細胞？）思考題2023/2/163第三節基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。目的：保留天然抗體的特異性和主要生物活性，去除或減少無關結構及鼠源單抗不足；賦予抗體分子新的生物活性。原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩定區（C）。內容1、人-鼠嵌合抗體（ChimericAntibody）2、人源化改型抗體（HumanizedAntibody）3、單鏈抗體4、單域抗體與分子識別單位5、雙功能抗體6、抗體融合蛋白2023/2/165基因工程抗體的類型人-鼠嵌合抗體改型抗體（人源化抗體）FabFv單鏈抗體單域抗體最小識別單位抗體融合蛋白2023/2/166單域抗體最小識別單位單鏈抗體小分子抗體1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區與人抗體的恒定區融合而得到的抗體。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉染細胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略構建嵌合抗體過程：鼠源單抗的可變區基因連到包含有人抗體恒定區基因并構建到表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細胞人-鼠嵌合基因工程抗體2人源化改型抗體(Reshapingantibody)鼠單克隆抗體V區的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發展出CDR移植技術。

CDR移植:即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體（humanizedantibody)。

經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變

結合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現在已有數百種人源化抗體。（美國正式上市的28種治療性單抗中多數是人源化抗體）

人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。

定點突變法是將人的可變區基因克隆，根據鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區基因的CDR序列變為鼠抗體的CDR序列，然后表達出改型抗體。研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列（FR）進行操作。單鏈抗體(singlechainFv,scFv)P154:由一段彈性連接肽（linker）把可變區重鏈（VH）與輕鏈（VL）相連而成，具有親代抗體全部抗原結合特異性的最小功能結構單位。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，具有一定彈性和蛋白酶抗性，常用的連接肽是(GGGGS)3它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。

3單鏈抗體（ScFv）Fv由于其結合是非共價結合，故Fv不穩定,在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到單鏈抗體。分子小，保持完整抗原結合位點，易進入組織；易于進行分子改造，融合毒素、酶、藥物等構成雙功能抗體。免疫原性低；可在大腸桿菌中表達；缺乏Fc段，不與非靶細胞（Fc受體陽性細胞）結合，易進入組織，偶聯成像可用于診斷；體內半衰期短易從血循環中清除；親和力和穩定性較完成抗體低；因只能與抗原結合，不能激活補體激活細胞免疫（CDC）及抗體依賴細胞毒效應（ADCC）。2023/2/175單鏈抗體（ScFv）特點

單鏈抗體的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;

從雜交瘤細胞系構建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區基因VH,VL，將二者連接成ScFv基因，再組裝到適當的表達載體上。ScFv的基因構建

單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式:

一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。但需進行變性復性，使其形成正確的立體結構，恢復抗體活性;

二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。重組ScFv的表達雙價及多價ScFv2023/2/178連接肽（linker）較短時，同一ScFv分子內VH與VL不能相互配對，分子間的VH，VL功能區配對成一個二價的二聚體，也可構成三聚體或多聚體。

抗體的VH、VL約為完整分子的1/12,只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

4、單域抗體和分子識別單位VH分子識別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。即雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。5、雙（多）功能抗體

Hollinger等將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質粒中,構建成雙鏈抗體的表達質粒,目前報道的表達質粒均為雙順反子。表達后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結,形成雙特異性抗體。雙功能抗體實例

能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發分子結合,激活效應細胞,實現對腫瘤細胞的殺傷和裂解。與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。Catumaxomab2023/2/183多功能抗體

6、抗體融合蛋白將抗體片段（V區或C區）連接到與抗體無關的其他蛋白上，創造出抗體相關分子，稱為抗體融合蛋白（antibodyfusionprotein）。分類：Fv抗體融合蛋白：抗體的Fv與其他生物活性蛋白結合，主要用于導向治療領域。Fc抗體融合蛋白：抗體Fc段與某些有黏附或結合功能的蛋白質融合而獲得的融合蛋白。2023/2/185Fv-抗體融合蛋白抗體與毒素、酶、細胞因子等生物活性分子融合達到特異殺傷腫瘤細胞目的。抗體與毒素偶聯：綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素（II期）；抗體與酶蛋白融合：也稱為抗體酶（abenzyme），前體藥物療法（ADEPT）；抗體與細胞因子融合：IL-2，免疫介導療法；2023/2/186Fc-抗體融合蛋白具有與特定蛋白（ProteinA,ProteinG）結合的特點，便于檢測與純化；Fc介導的抗體效應功能，如：ADCC、CDC及免疫調理作用；延長蛋白在血液中的半衰期；實例：CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;VEGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023/2/1872023/2/188思考題一、名詞解釋1、可變區2、恒定區3、互補決定區4、功能區5、人—鼠嵌合抗體6、改形抗體7、Fab抗體8、Fv抗體9、單鏈抗體（scFv）10、單域抗體11、雙特異單鏈抗體（bisFvs）二、簡答1、簡述抗體的結構與功能、抗體多樣性的遺傳學基礎。2、基因工程抗體有哪些類型？其特性有何不同？3、抗體融合蛋白有哪些類型，特征和設計策略是什么？試舉例說明。4、多價抗體特點？2023/2/189

第四節噬菌體抗體庫技術抗體研究的三個階段：①以1890年Behring發現白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體；②以1975年K?hler創建雜交瘤技術制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表。抗體研究領域的一次技術革命，完全用基因工程技術制備人源化抗體，還能利用基因轉移和表達技術，通過細菌發酵或轉基因動物或轉基因植物大規模生產抗體。在此基礎上發展成抗體工程。Winter創建了噬菌體抗體庫（Repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技術,克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。將蛋白分子或多肽基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使噬菌體表面表達該異源分子，稱為噬菌體展示。將B細胞全套可變區基因克隆，插入絲狀噬菌體表達載體轉化工程菌進行表達，在噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體，即為噬菌體抗體庫（surfacedisplayantibodylibrary）。噬菌體展示抗體庫技術用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因（獲取目的基因）克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面（載體構建）用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。（淘篩和鑒定）使抗體基因以分泌的方式表達，篩選可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人一、基本原理和程序噬菌體抗體庫絲狀噬菌體基因基因編碼產物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復制gIIpIII尾端外殼蛋白，與F因子結合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復制gVIpVI外殼蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外殼蛋白，高度疏水，組裝起始信號gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII啟動子激活蛋白噬菌體表面展示文庫技術的要點外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導系列的緊靠下游隨機克隆入相應載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段用固相化抗原經“親和結合一洗脫一擴增”數個循環直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，1、獲取目的基因：提取RNA，經RT-PCR獲取抗體某一特定基因區段。

2、抗體庫技術的載體：普遍使用噬菌粒（phagemid）載體。

3、淘篩（panning）：用固相化抗原對表達產物的載體進行淘篩，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量擴增。

4、表達與鑒定：目的克隆經過鑒定后，再導入感受態菌珠，進行可溶性表達，其產物用Westernblot分析確定后，就完成了全過程。噬菌體抗體庫技術的基本方法小結二、噬菌體抗體庫技術的特點1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達到或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。2、避開了人工免疫和雜交瘤技術由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術。3、可獲得高親和力的人源抗體在噬菌體抗體庫技術中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。將抗體的基因型和表型緊密聯系起來;可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術;抗體基因篩選的范圍廣;技術穩定、可靠、生產周期短;可規模化生產;適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產。該項技術的優點:

噬菌體抗體庫技術的發展具有很大優越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。

第六節抗體治療藥物

自第一個抗體藥物批準上市以來，已被成功用于治療腫瘤、自身免疫疾病等多種“疑難雜癥”，截止2012年6月，美國FDA批準28種抗體藥物，抗腫瘤占53.8%，免疫性疾病：19.2%、器官移植11.5%、感染性疾病7.7%、心血管疾病3.8%、其他3.8%。商業化的抗體藥物2023/2/11055個靶標的抗體仿制藥開發是熱點:CD20，HER2，EGFR,VEGF,TNF-alpha2023/2/1106VEGFTargetAnti-VEGFStrategyHER2signalingpathwayandAnti-HER2Strategy108CombinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistanceNancyE.Hynes

andHeidiA.Lane.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.NatRevCancer.2005;5:341-354.2013年全球生物藥品銷售額前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、牛皮癬TNF3RemicadeJ&J8.37RA、Crohn’sTNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkin’sLymphomaCD206AvastinRoche/Genentech6.97結腸癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.91乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白細胞減少癥/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35貧血及癌癥化療引起貧血/2013年14個抗體藥物銷售過10億美元2023/2/1110110.265.687.7683.867567.51抗體藥物分類抗體或抗體片段（小分子抗體藥物）抗體融合蛋白抗體偶聯物或免疫偶聯物2023/2/1111抗體與放射性同位素偶聯抗體與抗癌化學藥物偶聯抗體與免疫毒素偶聯一、放射性同位素標記的抗體治療藥物抗體作為放射性同位素的導向載體，體內應用較成功。----同位素標記抗體操作簡便，用量小，可觀測藥物在體分布和藥物動力學。----治療起步階段，人體研究較少。----初步結果證明放射性同位素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。

----同位素來源困難，防護和污染問題1、常用的抗癌藥物

氨甲喋呤(MTX)阿霉素(ADM)絲裂霉素(MMC)環磷酰胺(CTX)新抑癌蛋白(NCS)正定霉素(DOX)-------抗體藥物偶聯物提高體外細胞毒性，對化學療法耐藥的細胞株仍有效。二、抗癌藥物偶聯的抗體藥物抗體-藥物偶聯體由三個部分組成靶向單克隆抗體穩定的連接子高活性小分子藥物抗體-藥物偶聯體是一類新型的腫瘤治療藥物靶向治療：結合單抗的靶向作用和小分子藥物的高活性，選擇性殺傷腫瘤細胞，從