抗生素雜質研究與控制—基本思路與策略1雜質

任何影響藥物純度的物質統稱為雜質。

－原料藥中不屬于原料藥的任何成分。

－制劑中不屬于原料藥或輔料的任何成分。無治療作用、影響藥物穩定性和療效、甚至對人體健康有害…Fanconi征候群現象—差向四環素、脫水四環素以及脫水差向四環素

N-甲基硫四唑(MTT)—引起血液凝固疾病及戒酒硫樣反應β-萘酚—腎粘膜的刺激性…有關物質—與藥物具淵源關系的物質工藝雜質、降解物、輔料雜質…不確定性雜質—交叉污染、外源性污染物（如灰塵等）、非正常渠道加入的物質…--GMP控制2

抗生素雜質的一般特點化學合成有機化學反應原子間的作用（共價鍵生成和斷裂）反應釜取代、加成、置換…“直接”控制溫度、壓力、時間…

精細、準確、直接生成物反應母液--工藝雜質、中間體、副產物…

微量、可追蹤微生物發酵生化反應、酶化學反應生命過程（初級代謝、次級代謝）細菌體細胞生長、發育、代謝和繁殖“間接”調制營養、生長環境、培養時間…復雜、宏觀且細微、間接生成物發酵液--雜質、組份、異構體…

復雜、微量、難控制來源復雜、難以預測—微生物發酵3—半合成抗生素起始物為微生物發酵產物—純度低組份復雜活潑基團較多—羥基、氨基、醛基…保護脫保護不穩定結構單元—內酯環、內酰胺環…大多存在構型問題…多種副產物、降解物、組分…雜質譜分析較為復雜、難以預測和控制。4抗生素雜質的一般特點組成復雜、監控困難發酵母液—目標物濃度很低，而生產物料含量高且復雜菌體細胞培養基各種蛋白質膠狀物色素高價金屬離子其它代謝物同系物異構體…天然化合物—分子結構復雜，平面結構、立體構型不穩定降解聚合…5抗生素雜質的一般特點活性（毒性）高、須嚴格控制發酵產物共性雜質—殘存蛋白、色素、高價金屬離子…過敏性、抗原活性高毒性金屬雜質的分類控制…特定雜質—同系物、異構體以及半合成副產物…類似主成分的活性預期之外的不良反應…6抗生素雜質的一般特點7雜質含量控制高純度低純度雜質控制純度控制雜質含量、種類各種潛在雜質雜質譜控制強調通過主成份純度，間接控制其余雜質強調雜質含量、個數的直接控制各種潛在雜質的系統控制雜質控制的兩次飛躍藥理毒理研究結果

雜質控制限度確定

數據積累和分析

臨床試驗結果

分析方法的建立與驗證雜質研究與控制的基本思路與策略雜質譜系統分析8各種潛在雜質及其可能的來源基于QbD理念的雜質控制策略

雜質譜分析9依據文獻報道（國內外藥典等）鎖定基本雜質依據制備工藝，分析潛在的工藝雜質基于結構特征，分析可能的降解產物通過強制降解試驗，驗證降解產物的存在與檢出與原研市售品的雜質情況對比研究，明確雜質異同…雜質來源的分析論證

—雜質譜分析的切入點1011起始原料空間構型原料藥工藝發酵菌株起始原料活潑基團●起始原料組分與純度特定副反應特定工藝雜質特定結構單元頭孢菌素C-3位水解開環降解差向異構化順反異構化酯類水解發酵工藝半合成工藝發酵工藝提取精制制劑工藝過程輔料影響工藝過程工藝雜質降解產物抗生素雜質譜分析基本路徑

雜質譜概念的引入，進一步厘清了抗生素雜質研究與控制的基本思路

以終為始以源為始

避免了高風險雜質失控

被動控制主動控制實現了雜質的根本控制

個別控制系統控制全面掌控各種潛在雜質12雜質譜分析—由“以終為始”到“以源為始”案例：基于雜質譜分析，四個具有遺傳毒性警惕結構的潛在雜質需要高度關注，但最初建立的分析方法未全部檢測到，鑒于其風險程度，重新建立針對性方法檢出，在毒理學評估基礎上，進行了嚴格控制（雜質對照品法，ppm水平）。基本化學原理：所有“苯胺”在后續步驟中都會發生反應；因此，所有潛在的遺傳毒性中間體都會發生反應。四種都具有相同苯胺官能團，導致潛在的遺傳毒性確定毒理學關注的限度（閾值）（TTC=1.5μg/天）torcetrapib的TTC是25ppm13案例：FLQMS有關物質的研究與控制

改進：普通C18柱、等度洗脫特定C18柱、梯度洗脫

結果：檢出兩個高含量雜質。Minutes04812162024283214雜質譜分析—由“被動控制”到“主動控制”進一步的研究：新檢出兩個超鑒定限雜質結構研究與工藝控制建立LC－DAD－MS方法對新檢出的兩個超鑒定限度雜質進行了結構推斷。雜質譜分析--從雜質結構及制備工藝入手分析其來源。從反應條件與雜質含量的關聯性研究為切入點，研究確定了工藝控制要素，在過程控制階段從根本上把控產品質量。15超鑒定限度雜質的結構推斷493.9,

493.847A452.1452,268B471.2,471.347

16

雜質A的來源分析6-APA在特定條件下擴環生成7-ADCA，成為6-APA物料中的一種雜質。7-ADCA在后續反應中與氟氯酰氯生成雜質A17雜質A的工藝控制措施控制思路：由于雜質A來源于起始物料6-APA，嚴加6-APA的雜質控制水平可以從源頭上降低該雜質的水平。研究數據：具體措施：從供應商中選用質量符合7-ADCA小于等于##%的6-APA作為起始原料，有效控制氟氯西林鈉產品的雜A質水平。批號6-APA中7-ADCA含量（%）雜質A含量(%)1628Q0.842.844123D2.023.981206E1.152.972435U0.1020.0740896B0.080.0681402R0.260.24318

雜質B的來源分析6-APA與氟氯酰氯生成氟氯西林酸，氟氯西林酸在堿性條件下降解，生成雜質B。

[OH-]，H2O氟氯西林酸雜質B6-APA氟氯酰氯19雜質B的工藝控制措施控制思路：氟氯西林酸與異辛酸鈉成鹽過程中，局部堿性過強，降解產生雜質B—控制異辛酸鈉的流加程序和攪拌速度，避免因局部過堿。研究數據：具體措施：控制攪拌轉速##轉/分鐘，以##L/h流速繼續流加剩余異辛酸鈉溶液，當流加到##分鐘時，調整攪拌轉速到##轉/分鐘，流加結束后，控制異辛酸鈉殘留##%，檢測合格后繼續以##轉/分鐘的攪拌轉速攪拌##小時，結晶結束。批號成鹽及結晶工藝雜質B含量(%)0235QCY-1-JJ-22.310865YCY-3-JJ-24.671108TCY-1-JJ-12.850287BCY-2-JJ-20.0240965WCY-2-JJ-30.05620

有效控制雜質的基本思路與策略

在雜質譜分析指導下，從雜質產生的源頭入手，優化制定合理的物料控制、生產過程控制措施和包裝貯藏條件，從根本上優化控制雜質產生的因素，實現雜質的有效控制。21

22雜質譜分析—由“個別控制”到“系統控制”

23分析方法系統適用性專屬性檢測限EP7.0符合雜質A不出峰，其它峰都能相互分離。雜質B、雜質F為0.05%；左氧氟沙星、雜質E為0.025%；雜質C為0.015%。USP34符合左氧氟沙星、雜質G為0.02%；雜質B、雜質C、雜質E、雜質F為0.01%。JP16符合雜質A不出峰，雜質B與E峰之間的分離度為0.85，兩峰之間不能完全分離。/申報標準符合雜質均能出峰且能相互分離。雜質A、雜質B的檢測限為0.006%；左氧氟沙星、雜質E的檢測限為0.003%；雜質C、雜質F的檢測限為0.002%。分析方法的選擇與驗證

24中試及商業化產品雜質檢出情況樣品批號雜質名稱DCC/p>

DC-0404-10070021107A05雜質B（RRT:0.3）未檢出未檢出0.02%未檢出未知雜質1（RRT:0.4）0.03%0．03%0.03%0．03%雜質C（RRT:0.5）未檢出0.02%未檢出0.02%雜質H（RRT:0.8）0.02%未檢出未檢出未檢出雜質E（RRT:0.9）0.08%0.07%0.05%0.06%雜質F（RRT:1.5）0.02%0.02%0.02%0.02%未知雜質2（RRT:1.7）0.03%0.03%0.03%0.03%雜質A（RRT:1.9）未檢出0.02%未檢出未檢出總雜質0.16%0.15%0.13%0.14%

25質量標準--各種雜質的系統控制雜質各稱EP7.0USP34JP16ChP2010本品申報標準雜質控制限度雜質A消旋體≤0.2%//≤0.3%≤0.1%雜質B消旋體≤0.2///≤0.1%雜質C消旋體≤0.2%≤0.3%//≤0.1%雜質D消旋體≤0.2%///≤0.1%雜質E消旋體≤0.2%≤0.3%/≤0.2%≤0.2%雜質F消旋體≤0.2%≤0.3%//≤0.1%雜質G/≤0.8%≤0.4%≤1.0%≤0.5%雜質H/≤0.3%//≤0.2%任何未知雜質≤0.1%≤0.1%≤0.1%≤0.1%≤0.1%總雜質≤0.5%（異構體除外）≤0.5%≤1.0%（異構體除外）≤0.5%（異構體除外）≤0.5%抗生素雜質控制的基本思考總體思路：雜質譜與生產要素

生產菌株、工藝要素與雜質和組分針對性的關聯性研究發酵后合成路線的長短、起始物的復雜性—發酵起始原料及有關物質（組份）、合成副產物、合成中間體和降解產物等

起始原料內控—含量、組份及分布、有關物質（特定雜質、非特定雜質及總雜質）關鍵中間體內控—明確的雜質和單個未知雜質及總雜質

組分與雜質活性成分的一部分，還是應該被認為是雜質新抗生素與仿制抗生素探索性研究∮對比性研究

2627各種潛在的和實際存在的雜質的研究論證：根據雜質譜分析，產品將出現何種雜質？組分與雜質工藝雜質與降解產物毒性雜質與一般雜質生產過程中如何針對性控制或去除？效果如何？質量標準中的分析方法雜質可接受性的依據文獻依據試驗依據相關論證標準控制的雜質—哪些？限度？每個明確的已知雜質每個明確的未知特定雜質基因毒性與一般毒性雜質特定雜質與非特定雜質…任何非特定雜質（≤鑒定限度）總雜質28新抗生素—探索性研究的基本思路28

雜質限度：根據其來源、類別、結構信息等因素，必要的毒理學研究乃至臨床研究中各批次試驗樣品的雜質組成情況綜合考慮，針對性控制。

與母體化合物結構并不密切相關的雜質—參照化學合成藥物雜質限度要求。CFDA0.15%與母體化合物結構密切相關的雜質—適當放寬。EMA0.50%與母體化合物結構密切性—DAD、LC-MS、…2930抗生素雜質限度類別報告限度（%）鑒定限度（%）界定限度（%）原料藥制劑原料藥制劑原料藥制劑半合成抗生素0.05※(≤2g);0.03※※0.10.10（或1mg）※；0.05※※0.20.15（或1mg）※；0.05※※0.2發酵單組份抗生素0.100.150.150.20.150.2發酵多組分抗生素0.100.150.150.20.50/0.150.50/0.15※日劑量≤2g，※※日劑量>2g，（）取最小值原料藥雜質限度

31某原料藥日最大用量為0.5g，與母體結構不密切雜質報告限度=0.05%

鑒定限度=0.10%

界定限度=0.15%

或1.0mg（TDI）1)考慮響應因子問題33雜質譜復雜、難以充分純化、治療時間有限對于國內外藥典和同類品種標準已明確控制的毒性雜質或降解產物，應進行相應的研究與控制。現有技術無法鑒定超鑒定限度雜質，至少提供相關結構信息表明其歸屬：母體化合物、某側鏈…，并作為特定的未知雜質使用適當的分析標識進行識別和控制。全新抗生素新結構雜質—尚應基于毒理學乃至臨床研究提供的相關信息不同種類抗生素限度也不盡相同改善純化、降低雜質含量—可能比提供安全性資料更便捷

抗生素雜質限度要求的相關考慮33考慮生產工藝與分析方法的正常波動、產品的穩定性選擇工藝相對成熟、多批數、批量接近商業化生產的樣品雜質的限度：平均值+3×SD在雜質的安全性（毒理、臨床研究）得到充分驗證前提下雜質的標準控制限度：

仿制抗生素—對比性研究的基本思路35分析方法：結合產品雜質譜，與ICH成員國藥典收載的檢測方法進行檢測能力和樣品測定結果的對比研究，優選專屬性好、靈敏度高，能夠充分檢出相關雜質的檢測方法。分離技術（如HPLC法）與質譜分析（或二極管陣列檢測）相結合或使用分析標識物（如雜質對照品），以便從色譜行為、UV特征、分子量及分子碎片特征等信息共同把握其物質一致性。分析方法的定量限不應高于(≤)報告限度。

3637對照藥—仿制研發的基礎和標桿以列表形式，采用多種檢測手段，如DAD、LC-MS等技術手段逐個進行對比，對樣品與原研品進行所有雜質種類、含量及分布的比較和分析。

特定雜質中國藥典、ICH成員國藥典規定控制的同品種特定雜質，須進行相同的研究與控制。非特定雜質與原研產品相同的雜質，含量不超過質量標準（藥典等）規定或原研產品—可接受。相同雜質如超出標準規定，或出現原研產品中沒有的新雜質—按照新抗生素雜質研究的思路與策略，消除或降低其含量，或進行安全性求證，制定合理限度。

38對比研究遺傳毒性：泛指各種因素（物理、化學因素）與細胞或生物體的遺傳物質發生作用而產生的毒性。致突變性：與DNA相互作用產生直接或潛在的影響，使基因突變（bacterialreversemutation（Ames）試驗）致癌性：具有致癌可能或傾向（需要長期研究！）警示結構特征遺傳毒性物質：很低濃度時即可造成人體遺傳物質的損傷，進而導致基因突變并可能促使腫瘤的發生。甲磺酸奈非那韋（Viracept）的故事38遺傳毒性雜質：雜質控制中的重點關注

ICHQ3A(R2)ImpuritiesinNewDrugSubstances,2006ICHQ3B(R2)ImpuritiesinNewDrugProducts,2006EMA：GuidelineontheLimitsofGenotoxicImpurities，2006EMA：QuestionsandAnswersontheCHMPGuidelineonthelimitsofgenotoxicimpurities,2008FDA:GuidanceforIndustry:GenotoxicandCarcinogenicImpuritiesinDrugSubstancesandProducts:RecommendedApproaches.Draft,200839遺傳毒性雜質相關的指導原則

ICHM7DraftconsensusguidelineassessmentandcontrolofDNAreactive(Mutagenic)impuritiesinpharmaceuticalstolimitpotentialcarcinogenicriskCurrentStep2version，

2013年2月6日始，征求意見至2013年4月

最終發布時間？40提供了一個可用于遺傳毒性雜質鑒別、分類、定量分析和控制的可行性框架限制潛在的致癌風險提供安全性評估和質量風險控制的理念對ICHQ3A和Q3B的補充41

ICHM7藥物研發過程中，遺傳毒性雜質的可接受水平是多少?上市產品遺傳毒性雜質的可接受水平是多少?是否可以采用毒理學關注閾值(TTC)來規定遺傳毒性雜質的水平?

計算TTC時，是否可以將多個遺傳毒性雜質合并計算?

哪些是可接受的特殊情況？日攝入量大于TTC的情況?信息參考根據風險級別實施分類管理1類已知的有致突變性和致癌性物質

-致突變和致癌性數據為陽性。基于文獻中報告的動物/人體毒性。現有的公開數據庫，如ToxNet、NTP、InChem、BG‐Chemie、日本現有化學物質數據庫和/或市售數據庫，如VITIC和Leadscope。2類已知的致突變性，但致癌性未知的物質

-致突變數據為陽性，但致癌性未知。如已知的細菌突變Ames試驗結果陽性，但是未報告嚙齒類動物致癌性數據。42433類含警示結構，與API結構無關聯，無致突變性數據

-有警示結構，有潛在遺傳毒性風險。Q(SAR)系統顯示警示結構具有遺傳毒性，但與活性物質結構無關。如果細菌突變Ames試驗陽性，劃為2類，如果細菌突變Ames試驗陰性，劃為5類。4類含警示結構，但與無致突變性的API結構相似-有警示結構，但與原料藥和原料藥結構相似物有關，而細菌突變Ames研究顯示此類物質呈陰性。5類無警示結構，或有充分的數據證明其警示結構無致突變性-沒有警示結構，

沒有遺傳毒性的文獻報告，或在細菌突變Ames試驗陰性，或者有充分的數據證明與警示結構不相關。遺傳毒性警示結構：45A為烷烴基、芳香基或H；X為F、Cl、Br、I；EGW為吸電子取代基：氰基、羰基或酯基等。限度控制1）PDE法（有閾值效應的遺傳毒性雜質）：在超過一定限度時才會產生遺傳毒性。限度確定參照殘留溶劑限度的計算方法，根據相關動物的無可見效應劑量（NOEL）計算其可接受的日暴露量（PDE），再根據藥品的最大日劑量計算出雜質的接受限度。2）TTC法（無閾值效應的遺傳毒性雜質）：引入毒理學關注閾值（TTC）的概念：假設患者終生用藥的癌癥發生概率不超過10萬分之一，從高濃度下進行的致癌性實驗數據線性外推到極低濃度得到的一個理論值。此類雜質，如果每日攝入量低于1.5ug，那么患者因服藥導致癌癥發生的額外風險，可以忽略不計。4546舉例：PDE法—環氧乙烷大鼠TD50為21.3mg/kg按照1/100,000腫瘤發生率，TD50為1/50,000發生率21.3mg/kg÷50,000=0.42μg/kg0.42μg/kg/day×50kgbodyweight=21.3μg/person/dayPDE為21.3μg/person/day某制劑100mg/day,環氧乙烷控制限度應為0.021%（210ppm）。TTC法—甲磺酸酯（甲酯、乙酯等）以TTC1.5ug/日計算。某制劑300mg/日，甲磺酸酯控制限度應為0.0005％（5ppm）。3)引入與Less-Than-Lifetime(LTL)暴露相關的可接受限度：基于TTC可接受的限度為1.5μg/day是假設患者終生服藥的基礎上得出的理論值，在LTL遺傳毒性雜質限度的范圍應為：

1.5μg/day×365days×70years（25,550days）

=38.3mg

設計出平均分配在累積暴露天數中的方法，對于臨床研究和上市藥物不同用藥時間可接受的限度（攝入量）：

474）含有多個遺傳毒性雜質的限度要求：

基于TTC原理，當原料藥中有含有多個遺傳毒性雜質時，按照下所描述的進行限制。