青霉素生產的培養基優化的具體實驗方法

培養基優化的基本原理一個批發酵(流加發酵):可以分為生長期和產物形成期兩個階段。第一階段:控制菌體的生長,目的是使長好的菌體能夠處于最佳的產物合成狀態,即如何控制有利于微生物催化產物合成所需酶系的形成.。第二階段:控制產物的合成;找出影響反應速度變化的主要因素并加以控制使產物的形成速度處于最佳或底物的消耗最經濟。生產青霉素的菌種目前，國內青霉素生產菌按其在深層培養中菌絲的形態分為絲狀菌和球狀菌兩種。根據絲狀菌產生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產黃青霉菌。青霉素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發酵發酵液預處理及種子加濾提取及精制成品檢驗成品包裝前體發酵階段提取階段前體物質

前體：某些化合物加入到發酵培養基中，能直接被微生物在生物合成過程結合到產物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入而有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136青霉素產生菌的生長過程分生孢子發芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期青霉素發酵培養基成分：碳源：青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液進行流加。氮源：可采用玉米漿（0.3%-0.4%）、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機氮源，及醋酸銨（提供氮源，同時提供碳源）、氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機氮源。前體：為生物合成含有芐基基團的青霉素G，需要在發酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它們對青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次流加方式加入。無機鹽：包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對青霉素有毒害作用，應嚴格控制發酵液中鐵含量在30ug/mL以下。青霉素發酵培養基基本配方乳糖----------22.5g,葡萄糖----------7.5g,醋酸銨----------8.0g,Na2SO-----------40.5g,MgSO4?7H2O----------0.25g,FeSO4?7H2O----------0.1g,CuSO4?5H2O----------0.005g,MnSO4?7H2O----------0.02g,CaCl2?2H2O----------0.05g,ZnSO4?7H2O----------0.02g,苯乙酸---------1.0g,蒸餾水---------1000ml,pH6.5121℃滅菌20min碳源PK：乳糖比葡萄糖更優越青霉素的生物合成，受糖分解代謝產物的阻遏，如合成青霉素的?；D移酶就會被阻遏。在青霉素發酵過程中，被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌體生長，但抑制青霉素的合成。被緩慢利用的乳糖，水解成單糖的速度正好符合青霉素生產期合成青霉素的需要，而又不會產生高濃度的分解產物來抑制青霉素的合成，是生產青霉素的優越碳源。但是，由于乳糖價格較貴，成本較高，故在生產實踐中常通過間隙或滴加葡萄糖的方法控制培養液中糖的含量，以符合菌體生長和青霉素生物合成的需要。這樣，在青霉素的生產中，降低了生產成本的同時，又提高了青霉素的產量。青霉素培養室

培養基優化步驟：1、發酵培養基的配制:按照正交表配制50ml。(三組:每組配制一種培養基,各接種一瓶,250ml三角瓶裝液量為50ml)2、搖瓶培養:從一級斜面菌株接種到三角瓶液體培養基,25℃200rpm培養6-7天,可進行青霉素的效價測定。3、金黃色葡萄球菌菌懸液的制備:將37℃培養16-18h的斜面菌種,用0.9%生理鹽水洗下，菌懸液稀釋至波長650nm透光率為20%的溶液,需要12ml。4、生測平板的制備:生測培養基400ml,加入適當稀釋的金黃色葡萄球菌后,制成3*6+2個平板。5、青霉素發酵液效價的測定:發酵結束后5000rpm離心5min．每個被測樣品用3套平皿進行測定；37℃培養18-24h后,量取抑菌圈直徑的大小。6、填正交實驗表格,確定最優培養基配方。正交實驗表特點（1）任何兩因素之間的都是全面實驗，從而保持了可比性。即任何兩個因素的各種不同水平的搭配在實驗中都出現了，并且出現了相同的次數。（2）任一因素個水平的重復次數相等。（3）絕大多數正交表中各列是等價的，可以任意取用。因此，正交表的實驗結果非常易于分析，以至于不需要進行復雜的統計計算，就可直接求出各因素影響的大小、效應的變化趨勢等。針對三因子進行正交實驗乳糖----------22.5g

或葡萄糖----------7.5g醋酸銨----------8.0g苯乙酸---------1.0g青霉素培養基因子水平表

因子水平乳糖/葡萄糖醋酸銨苯乙酸120/10g7.0g0.7g222.5/7.5g8.0g1.0g325/5g9.0g1.3g設計適合的正交表由于是三因子三水平，可選用L9(34)將乳糖/葡萄糖、醋酸銨、苯乙酸分別安排在第2、3、4列，第1列為空列。為了優化產青霉素的培養基，即比較各培養基產生的青霉素的含量，就可以確定最佳優化培養基成分。本設計方案用抑菌圈大小來間接測定青霉素產量。

正交實驗表：

列號試驗號12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）123456789123123123111222333123231312132213321k1k2k3極差R

列號試驗號12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k1k2k3極差R實驗分析一：試驗的目的試驗的目的：

產黃曲霉的效價，需要測定抑菌圈大小。從試驗中可以看出：

乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸銨各自在水平一的時候抑菌圈最大。正交實驗結果的統計分析方法分為：極差分析法和方差分析法兩種。極差分析法：也稱直觀分析法，優點是直觀、簡單，適用范圍廣，因此在正交設計中最常用；缺點是分析結果較粗糙，當實驗結果存在混雜現象時，往往給出錯誤結論。方差分析法：優點是可通過統計分析的方法排除實驗誤差的干擾，得出比較科學的實驗結論；缺點是計算復雜；在多因子實驗中主要用于判斷因子的主次。

列號試驗號12乳糖/葡糖糖3醋酸銨4苯乙酸抑菌圈（g/L）1234567891231231231112223331232313121322133212.1481.9391.71.7531.8981.9281.851.6491.528k11.9291.9081.858k21.8601.741.701k31.6761.8161.906極差R0.2530.1680.205實驗分析二：比較因子極差大小在試驗選擇的水平范圍內。極差可以直接反映各個因素選取的水平變化對優化目標影響的大小。極差越大，說明該因子的水平變動時，實驗結果的變動越大，即該因子對實驗結果的影響越大，從而可以按極差的大小來決定因子的主次順序。本實驗各因素極差的比較重，可根據極差的大小順序排除因素影響的主次順序：乳糖/葡萄糖>苯乙酸>醋酸銨實驗分析三：

確定最優的培養基配比

k1、k2、k3反映了因子各水平對實驗結果的影響，因而最大的k值對應于最好的水平乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸銨各自在水平一的時候抑菌圈最大。本實驗較適宜的配比為：

乳糖