細菌耐藥性的形成機制生物被膜（五）

五抗菌藥物的使用與細菌耐藥性的形成

人類提取這種抗生物質即抗生素（可能含有抗生素產生菌的耐藥基因）人類開發新抗生素細菌不斷受到選擇壓力抗生素與細菌不斷在新基礎上相互作用自然界抗生現象細菌產生抗生物質細菌自我保護

細菌基因突變或獲得耐藥基因細菌對所接觸的抗生素產生耐藥性

細菌不斷發生變異

細菌發展為高耐藥菌與多重耐藥菌基因突變獲得外源基因耐藥菌的播散誘導篩選抗生素的生產和廣泛應用為細菌耐藥埋下了伏筆。細菌是如何形成耐藥性的？主要內容一、細菌的遺傳物質二、細菌耐藥性形成的遺傳機制三、細菌適應性耐藥四、抗菌藥物在細菌耐藥性形成中的作用6一、細菌的遺傳物質71、細菌染色體bacterialchromosome由一條超螺旋的閉環dsDNA分子組成，附著在橫隔中介體或細菌膜上。染色體無組蛋白包繞，不形成核小體結構。細菌染色體上的基因為連續的，無內含子，轉錄后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻譯成多肽。8AmapoftheE.coligenome,showingselectedgenes.?2003JohnWileyandSonsPublishers9例：E.coli的染色體2001年10月15日完成了E.coliK12菌株的基因組全序列測定。DNA雙鏈長約1333um總共4639221bp，4279個蛋白質編碼基因，115個編碼rRNA和tRNA的基因。（GenBank編號:U00096）是菌體長度的1000倍，可以想象這樣長的DNA鏈，在不到1μm的核區空間內，一定是以十分精巧的空間構建盤繞在細胞內。

?2003JohnWileyandSonsPublishers102、質粒(plasmid)：質粒是存在于染色體以外的遺傳物質，細胞質中的閉合的環狀dsDNA。

約1Kb～250Kb大質粒：含幾百個基因小質粒：含幾十個基因11質粒的基本特性能自我復制，自主復制編碼細菌某些特定性狀

可自發消除

可在細菌間轉移

相容性和不相容性緊密型質粒松弛型質粒并非細菌生長所必需，但有利于細菌的生存。接合性質粒非接合性質粒12致育質粒（fertilityplasmid，F質粒）耐藥質粒毒力質粒（virulenceplasmid，Vi質粒）

編碼毒力相關因子，如ST質粒細菌素質粒如Col質粒代謝質粒（降解質粒）幾種重要的質粒13致育質粒（fertilityplasmid，F質粒）編碼性菌毛接合型質粒有三個主要功能區自主復制區、轉移基因群區、重組區F＋菌（雄性菌）F—菌（雌性菌）14

耐藥性質粒

（drug-resistanceplasmid）編碼細菌耐藥相關性狀接合型耐藥質粒，稱R質粒，可通過接合方式在細菌間轉移的耐藥質粒。非接合型耐藥質粒，稱r質粒，不能通過接合方式在細菌間轉移的耐藥質粒。15耐藥決定子（編碼耐藥性）R質粒由兩部分構成耐藥轉移因子（編碼菌毛）16細菌基因組中可移動的基因元件轉座因子整合子在細菌細胞內移動173、轉座因子transposableelement是指基因組中能夠改變自身位置的一段DNA片段。（jumpinggene）位置的改變：轉位行為的意義：能使DNA發生插入突變和廣泛的基因重排。→變異和進化。染色體質粒18插入序列（insertionsequence,IS）最小的轉座因子，＜2kb。包含轉位酶基因、反向重復序列轉座子（transposon,Tn）＞2kb，攜帶轉位酶基因，耐藥性基因、抗金屬基因、毒素基因等。與細菌的多重耐藥性有關。

抗性基因轉座因子的種類ISIS轉位酶基因19常見的轉座子轉座子攜帶耐藥或毒素基因Tn1Tn2Tn3AP（氨芐青霉素）Tn4AP、SM（鏈霉素）、Su（磺胺）Tn5Km（卡那霉素）Tn6KmTn7TMP（甲氧芐氨嘧啶）、SMTn9Cm（氯霉素）Tn10Tc（四環素）Tn551Em（紅霉素）Tn971EmTn1681大腸埃希菌（腸毒素基因）

Integronsaregeneticelementthatcanintegratebysite-specificrecombination,andexpressgenecassettes,usuallyantibioticresistancegenes.StokesHW，HallRM．ANovelfamilyofpotentiallymobileDNAelementsencodingsite-specificgeneintegrationfunctions：integrons．Microbial，1989．具有位點特異性重組功能，能捕獲和整合外源基因，并可啟動所攜帶基因的表達的DNA片段。4、整合子（integron，In）細菌基因捕獲和表達的遺傳單位具有位點特異性重組功能，能識別并捕獲移動性基因盒(常攜帶耐藥基因)；可啟動所攜帶基因的表達。又稱整合子—基因盒系統

integron-genecassettessystem可存在于質粒、轉座子或染色體上。整合子（integron，In）225’3’intIgene2gene1整合子結構示意圖attIABCP1P2P5′3′geneRYYYAACGTTRRRYattCattC5’端保守區（5CS）3’端保守區（3CS）中間的可變區域：1個或多個基因盒組成5CS：intI基因編碼整合酶integrase，催化基因盒整合至具有同源性的短序列（attI或attC）之間外源基因整合位點attI

兩個啟動區域

P1、P2根據intI基因的不同，可將In分為六類整合酶啟動子可變區啟動子由3個ORF組成

qacE1編碼季胺類化合物耐藥性

sul1編碼磺胺類藥物耐藥性

ORF5

功能不明3CS：25基因盒（genecassettes）：可移動的小分子DNA，有由一個結構基因和一個特異性重組位點attC組成attC的兩端為7個bp的回文序列目前發現的基因盒攜帶的基因絕大多數為

耐藥基因。geneattC基因盒有兩種存在形式：

geneattCgeneattC整合狀態的線性分子游離狀態的環狀分子attIintIPantPintIntegrasegene+resistancegene1Int+resistancegene2IntR1R2R1R1SchematicrepresentationofthemodelforcassetteexchangeandexpressionTheepidemiologyofintegrons整合子類型1類整合子 2類整合子 3類整合子 超級整合子

菌種

腸桿菌科 腸桿菌科 銅綠假單胞菌霍亂弧菌

銅綠假單胞菌 不動桿菌屬 粘質沙雷菌 假單胞菌屬 不動桿菌屬 銅綠假單胞菌 木糖氧化產堿桿菌黃單胞菌屬 霍亂弧菌 惡臭假單胞菌亞硝化單孢菌屬 空腸彎曲菌 肺炎克雷伯菌 谷氨酸棒狀桿菌 糞腸球菌 基因盒相關耐藥β內酰胺類耐藥 氨基糖苷類耐藥 β內酰胺類耐藥 ???? A,C,D類β內酰胺酶 3″2腺苷酰基轉移酶 氨基糖苷類耐藥

B類β內酰胺酶 鏈絲菌素耐藥 6-轉乙酰酶

氨基糖苷類耐藥 轉乙酰酶

6′－轉乙酰酶 磺胺耐藥

3－轉乙酰酶 A類和

2－腺苷?；D移酶 二氫葉酸還原酶

3－腺苷?；D移酶 氯霉素耐藥 轉乙酰酶 非酶作用機制 磺胺耐藥

A類和B類二氫葉酸還原酶 利福平耐藥

ADP-核糖基轉移酶 紅霉素耐藥 季銨類化合物耐藥整合子的移動整合子存在于質粒、轉座子或染色體上，可隨轉座子在染色體和質粒間移動；可隨質粒在細菌間轉移?；蚝锌梢员磺谐驼?。在細菌耐藥播散中發揮重要作用。在細菌多重耐藥的形成中發揮重要作用。30中國人獸共患病學報，2006,22(9)。中國抗生素雜志，2007年12月第32卷第12期

耐藥基因

IR轉位酶基因

IR插入序列（IS）

IR轉位酶基因

IRSul1intI1attI1耐藥基因

attcqacE△1ORF5整合子整合子與轉座子的比較：

IR轉位酶基因

IR轉位子（Tn）：整合子與轉座子的比較：整合子是缺陷轉座子：整合子缺少轉座基因，不能啟動自身轉移（只能移動基因盒），基因盒不以反向重復序列為界整合子是轉座子的變體：整合子可以啟動耐藥基因的表達，移動的基因盒更廣泛、攜帶的基因盒更多。整合子在細菌多重耐藥的形成、耐藥基因的播散中發揮重要作用。33溶原性細菌溫和噬菌體前噬菌體prophage:整合在細菌基因組中的噬菌體基因組轉座噬菌體34溫和噬菌體能整合到細菌染色體的任一位置，能改變細菌的某些生物學性狀。如大腸埃希菌溫和噬菌體Mu（mutatorphage，誘變噬菌體）。可作為生物誘變劑，研究細菌變異的工具。5、噬菌體基因組二、細菌耐藥性形成的遺傳機制

固有耐藥性（intrinsicresistance）

特點舉例獲得耐藥性（acquiredresistance）產生的方式基因轉移的方式基因轉移的元件及介導的耐藥（一）固有耐藥的遺傳機制由種屬特異性決定，有些微生物具有一些獨特的結構或代謝，對藥物天然不敏感。如支原體無細胞壁結構，對β內酰胺類抗菌藥物天然不敏感；常見革蘭陰性桿菌外膜上的孔蛋白通透性極低，對氨芐青霉素耐藥率為100％。嗜麥芽寡養單孢菌產生金屬β內酰胺酶及絲氨酸活性酶（兩者均為可誘導酶），對亞胺培南和氨曲南耐藥率為100％。（二）獲得性耐藥的遺傳機制1.

基因突變2.獲得外源基因基因突變是自發的、隨機的，自發突變率低：10-10～10-7或10-16～10-10耐藥突變株的形成是自發突變加上藥物選擇的結果。由基因突變引起的耐藥性，一般對一種或兩種相類似的藥物耐藥。突變若發生在染色體上，則可代代相傳。突變若發生在質粒上，則可細菌間廣泛傳播。1、基因突變染色體上的基因能否轉移到質粒上？

基因突變引起的耐藥

喹諾酮類抗生素耐藥：染色體上編碼DNA回旋酶的gyrA基因、qnrA基因突變，引起DNA回旋酶A亞基變構，使其對quinolones的親和力降低。近期報告質粒攜帶該突變基因norA基因高表達，其介導的主動泵蛋白表達增多，使quinolones在菌體內積蓄減少。近期報告金黃色葡萄球菌有質粒攜帶norA基因，有可能造成耐藥性的迅速蔓延和擴散。研究論文Tapasll的研究：

9株淋球菌：其中4株氟喹諾酮耐藥耐藥菌株均存在GryA基因91位點上絲氨酸（Ser）→苯丙氨酸（Phe）的突變，而所有敏感菌株則無一突變。Onodera的研究：對氟喹諾酮耐藥的淋球菌GryA基因上的另外兩個位點的突變：Ser83→Phe，天冬氨酸（Asp）87→甘氨酸（Gly）。gyrA基因突變使DNA回旋酶對quinolones的親和力降低。TapasllJMetal.SexTransmDis,1996;23(5):425基因突變引起的耐藥

β內酰胺類抗生素耐藥ESBLs：主要由β-內酰胺酶基因(TEM和SHV等)點突變而來，已報道的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs多于25種。

由質粒介導AmpC酶：與連續的基因ampC、ampR、ampG、

ampD有關。調節基因的突變率高。由染色體或質粒介導金屬酶：IMP、VIM、NDM-1金屬酶基因。

染色體和質粒介導異煙肼（isoniazed）是前體藥物，可被結核分枝桿菌內過氧化氫酶一過氧化物酶激活，進而可抑制細胞壁分枝菌酸的生物合成。過氧化物酶基因

katG

突變代謝標記和蛋白質組學研究發現與異煙肼作用有關的結核分枝桿菌分子包括InhA,AcpM,KasA,AhpC,Ag85復合物等。這些分子可能是異煙肼的靶標。已經發現至少有5種不同基因的突變與異煙肼耐藥性相關(katG、inhA、ahpC、kasA和ndh)。結核桿菌耐藥與基因突變結核桿菌耐藥與基因突變利福平(rifampin)耐藥株：

RNA聚合酶B亞基的編碼基因rpoB突變鏈霉素(streptomycin)耐藥株：核糖體蛋白編碼基因rpsL

或16SrRNA編碼蛋白突變吡嗪酰胺耐藥株：吡嗪酰胺→吡嗪酸（毒性）編碼吡嗪酰胺酶的基因pncA突變乙胺丁醇(ethamabutol)耐藥株：乙胺丁醇的靶位阿拉伯糖基轉移酶（細胞壁合成）阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因embB

操縱子突變結核菌耐藥基因突變檢測液芯關于耐藥基因轉移元件形成的推測：單個基因自發突變耐藥基因其mRNA逆轉錄產物作為基因盒被細菌染色體上的整合子捕獲多個耐藥基因被捕獲，形成多重耐藥

轉座子轉位至質粒，導致R質粒的形成整合子兩端插入IS轉變為轉座子多重耐藥菌株的形成？耐藥基因的廣泛播散？由基因突變引起的耐藥性，一般僅對一種或兩種相類似的藥物耐藥。巴斯德學院細菌學家的解釋：耐藥基因可以由染色體轉移到質粒，由質粒轉移到染色體，由一個質粒轉移到另一個質粒，

由一個細菌轉移到另一個細菌。這是基因的傳染病。獲得外源耐藥基因是微生物發生耐藥性變異的主要原因。利于播散穩定遺傳細菌間基因的友好分享細菌間基因轉移與重組：2、獲得外源耐藥基因供體菌受體菌耐藥基因基因轉移：外源性的遺傳物質由供體菌轉入某受體菌細胞的過程?；蛑亟M：轉移的基因與受體菌DNA整合在一起。重組使受體菌獲得供體菌的某些性狀。同源重組：發生在緊密相關的DNA之間（取代）非同源重組：發生在無關的DNA之間（插入）

根據DNA片段的來源與轉移的方式的不同，

細菌間基因轉移與重組方式有四種：轉化(transformation)

轉導(transduction)接合(conjugation)溶原性轉換（lysogenicconversion

）前噬菌體噬菌體lysogenicconversion噬菌體（染色體或質粒DNA）供體菌transduction

性菌毛（質粒，或染色體DNA）供體菌conjugation直接攝?。懵禗NA）供體菌transformation基因轉移載體或方式基因來源

方式基因的轉移和重組方式的比較

轉化(transformation):游離的耐藥基因DNA片段：

抗生素產生菌的耐藥基因片段耐藥菌溶解后釋放出的耐藥基因片段，耐藥基因直接進入敏感菌（感受態時）內，與敏感菌的基因發生重組，使敏感菌成為耐藥菌。常見于G-菌間。52

轉導(transduction)

53供體菌受體菌轉導噬菌體供體菌DNA噬菌體DNA普遍性轉導(generalizedtransduction)供體菌任何DNA片段都可能被誤裝入噬菌體內，而被轉入受體菌中（10－6）

，故稱普遍性轉導。借助于噬菌體將耐藥基因轉移給敏感菌，由于噬菌體有特異性，且通過噬菌體傳播的DNA量很少，因此耐藥性的轉導現象僅能發生在同種細菌之間，通常僅能傳遞對一種抗菌藥物的耐藥性。是金黃色葡萄球菌耐藥性轉移唯一的方式。

轉導(transduction)

55接合(conjugation)接合是細菌的遺傳物質（主要是質粒DNA）通過性菌毛從供體菌轉移至受體菌的方式。能通過接合轉移的質粒稱為接合性質粒，如F質粒和R質粒。

由接合傳遞的耐藥性也叫感染性耐藥，接合轉移不僅可在同種菌之間進行，也可在屬間不同種菌之間進行，通過接合方式，一次可完成對多種抗菌藥耐藥性的轉移。主要出現在G－細菌中，特別是在腸道菌。57例：F質粒的接合致育質粒F＋菌F—菌Hfr菌（高頻重組株）：染色體上帶有F質粒基因的細菌F’：帶有染色體基因的F質粒Hfr菌株高頻重組菌F′質粒：帶有染色體基因的F質粒接合：F＋×F－→F＋，F＋→Hfr×F－→Hfr×F－受體菌獲得供體菌染色體部分基因的重組子F′×F－→F′，F′

受體菌獲得供體菌染色體的基因Hfr菌株：染色體上帶有質?；騀′質粒：帶有染色體基因的F質粒染色體耐藥基因質粒耐藥基因在細菌間及染色體和質粒之間的轉移耐藥基因

在細菌內的移動及在細菌間的轉移耐藥基因在細菌之間的轉移基因元件：游離DNA、質粒、染色體片段

耐藥基因在染色體和質粒中間的轉移基因元件：轉座因子、整合子，質粒攜帶耐藥基因的基因轉移元件（游離DNA片段、質粒、轉座子、整合子、染色體）通過轉化、轉導、接合等方式由供體菌轉移到受體菌中，細菌以此獲得外源性耐藥基因，形成耐藥株或多重耐藥株。耐藥基因也因此在細菌間廣泛傳播。供體菌受體菌耐藥基因耐藥基因的轉移細菌間基因的友好分享GeneticelementscarryingmobilegenesinbacteriaGenecassetteIntegronTransposonPlasmidIntegration/excisionChromosomeIntegration/excisionPhageinfectionProphageIntegration/excisionLysisDNA耐藥株被篩選，并由劣勢菌成為優勢菌三、細菌的適應性耐藥

沒有特定的基因改變，變異發生在轉錄水平，即耐藥表型突變。耐藥基因的調控機制群體感應系統：生物被膜的形成

抗菌藥物誘導的耐藥表型突變-內酰胺類抗生素：

誘導

-內酰胺酶產量增加激活金葡菌mecR1基因，產生PBP2a，

對甲氧西林等-內酰胺耐藥四環素，氯霉素等：

誘導大腸桿菌marA基因表達，多重耐藥。耐藥基因的調控機制

大腸桿菌主動外排系統的表達受Mar操縱子調控。

甲氧西林耐藥性的表達調控基因（mecRI、mecI

）及其輔助基因（femA、femB、femC、femD）。這些基因的協同就使得MRSA對β-內酰胺類具有更高度耐藥性。群體感應系統細菌密度感應系統71群體感應系統

調控細菌生物被膜的形成耐藥表型突變株四、抗菌藥物在耐藥性形成中的作用抗菌藥物壓力是細菌耐藥性形成的主要推手抗生素的誘導作用，提高突變率（基因突變是隨機的）抗生素的篩選作用（表型篩選是定向的）

抗生素雙刃劍殺菌？篩選耐藥株

抗生素的誘導作用提高基因突變率耐藥表型突變株-內酰胺類抗生素

-內酰胺酶產量-內酰胺類抗生素

激活金葡菌mecR1產生PBP2a 對甲氧西林耐藥四環素，氯霉素等

誘導大腸桿菌marA基因表達 多重耐藥耐藥菌株：抗生素耐藥基因突變株的篩選作用長期、不合理使用抗生素：劣勢菌優勢菌敏感菌株：優勢菌劣勢菌自然界的一般情況下：藥物使用劑量增加：

上世紀五六十年代青霉素一次劑量是2萬～4萬單位，現在幾十萬、幾百萬單位。耐藥株的出現：

環丙沙星20年前開始在臨床上應用，當時副作用小、療效好，現在幾乎對60％以上的病人失