第九章凝膠過濾及離子交換層析介質

第一部分凝膠過濾層析

第一節概述凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography,GF或GFC）是20世紀50年代前后發展起來的一種按分子大小進行分離的純化手段。在眾多分離計劃中被廣泛采用，不同的文獻中采用了多種不同的稱謂:凝膠層析（gelchromatography）排阻層析（exclusionchromatography）分子篩層析（molecularsievingchromatography）立體排阻層析（stericexclusionchromatography）體積排阻層析（sizeexclusionchromatography,SEC）凝膠過濾層析

第一節概述凝膠過濾具有的優勢:（1）凝膠介質不帶電荷，具有良好的穩定性，分離條件溫和，回收率高，重現性好；（2）通常情況下，溶液中存在各種離子、小分子、去污劑、表面活性劑、蛋白變性劑等不會對分離產生影響，層析還能在不同pH、溫度下進行；

（3）應用范圍廣，能分離的物質相對分子質量的覆蓋面寬，從幾百到數百萬，因此既適用于分子量較低的寡糖、寡肽、聚核苷酸等生物小分子的分離，也適用于蛋白質、多糖、核酸等大分子物質的純化；（4）設備相對簡單、易于操作、分離周期短、連續分離時層析介質不需再生即可反復使用。

凝膠過濾層析

第二節原理一、凝膠過濾的概念不同的溶質因不同程度進入介質而在液相中停留的時間不同,凝膠的孔徑和溶質分子大小的關系決定了層析時該溶質在層析柱中的保留時間，不同的物質因保留時間不同而分離.

凝膠過濾層析

第二節原理凝膠色譜分離原理凝膠過濾層析

第二節原理凝膠過濾分離蛋白質的過程（1）蛋白質混合物上柱；（2）開始洗脫，小分子蛋白質進入凝膠顆粒內，大分子蛋白質被排阻在顆粒外；（3）小分子蛋白質被滯留而移動慢，大分子蛋白質移動快，大小不同的蛋白質分子開始分開；（4）大小不同的蛋白質分子完全分開；（5）大分子蛋白質已被洗脫，而小分子蛋白質仍在層析柱內。凝膠過濾層析

第二節原理二、生物分子的相對分子質量、分子大小和形狀每一種特定的凝膠介質都有特定的分子量分級范圍，分級范圍是凝膠介質的重要參數。根據其分級范圍，可以將溶質分子分為三類：1.分子量大于分級范圍上限的分子被稱為全排阻分子，它們完全被排阻在凝膠顆粒網孔外，從顆粒間隙中通過，所受阻力最小，流程也最短，首先從層析柱中被洗脫下來；凝膠過濾層析

第二節原理2.分子量低于分級范圍下限的分子被稱為全滲透分子，它們完全進入凝膠顆粒網孔內部，洗脫時所受阻力最大，流程也最長，最后從層析柱中被洗脫；3.分子量在分級范圍內的分子被稱為部分滲透分子，它們依據分子大小不同程度的進入凝膠顆粒內部的，是該凝膠介質的有效分離對象。如果兩種物質分子量均大于凝膠介質分級范圍的上限，或者均小于分級范圍下限，它們就無法通過層析而分離。凝膠過濾層析

第二節原理在生物大分子的分離中，決定該分子在層析時的保留時間長短即洗脫快慢的因素不僅僅是相對分子質量，分子形狀的影響也很大。有著相同分子量，但是形狀不同的分子，其保留時間不同。一般來說，分子量相同情況下，不對稱程度增加會使分子更容易被阻擋在凝膠顆粒的網孔之外，導致保留時間變短。

凝膠過濾層析

第二節原理三、凝膠過濾的有關理論問題㈠凝膠介質的多孔結構和凝膠柱的體積參數凝膠過濾介質是由多聚物交聯形成的具有三維網狀結構的顆粒。凝膠柱的體積參數包括：總柱床體積（totalvolume,Vt），是凝膠經溶脹、裝柱、沉降，體積穩定后所占據層析柱內的總體積；外水體積（outervolume,V0），是柱中凝膠顆粒間隙的液相體積的總和；內水體積（innervolume,Vi），是存在于溶脹后的凝膠顆粒網孔中的液相體積的總和；凝膠體積（gelvolume,Vg），又稱支持物基質體積（matrixvolumeofthesupport,Vs）或干膠體積，是凝膠顆粒固相所占據的體積，凝膠過濾層析

第二節原理根據凝膠床的組成，總柱床體積等于外水體積、內水體積與凝膠體積之和：Vt=V0+Vi+Vg

凝膠柱體積參數示意圖凝膠過濾層析

第二節原理㈡洗脫體積和分配系數洗脫體積Ve定義為自樣品加至層析柱上部開始，至洗脫組分達到最大濃度（對映洗脫峰峰頂）時流經層析柱的洗脫液的體積.

凝膠過濾層析

第二節原理凝膠過濾洗脫曲線示意圖（組分A為全排阻分子，組分B為部分滲透分子，組分C為全滲透分子）凝膠過濾層析

第二節原理所示層析圖譜中，樣品由三種組分組成。組分A為全排阻分子，分子量大于凝膠分級范圍上限，不能進入凝膠網孔，經凝膠顆粒間隙被洗脫，該組分的洗脫體積Ve等于外水體積V0（Ve=V0）。組分C為全滲透分子，分子量小于凝膠分級范圍下限，完全滲透進入凝膠網孔內，在正常洗脫條件下，與凝膠間不存在吸附作用時，此類組分的洗脫體積是最大的，等于外水體積V0與內水體積Vi之和（Ve=V0+Vi）。組分B為部分滲透分子，分子量處于凝膠分級范圍內，是此類凝膠能有效分離的物質。根據組分B的分子量，該組分能以一定程度進入凝膠網孔之中，其洗脫體積Ve處于組分A與組分C之間（V0<Ve<V0+Vi）。凝膠過濾層析

第二節原理凝膠過濾層析是一種分配過程，凝膠顆粒內部吸附的溶劑為固定相，流經層析柱的洗脫劑為流動相，樣品的洗脫過程就是溶質分子在兩相中不斷分配平衡的過程，而某種物質的洗脫體積Ve的大小取決于該物質在流動相和固定相之間的分配系數Kd，其關系式為：Ve=V0+Kd·Vi

Kd的值與被分離物質的分子量和分子形狀、凝膠顆粒間隙和網孔大小有關，與層析柱的長短、粗細無關。凝膠過濾層析

第二節原理對所有全排阻分子，由于Ve相同，凝膠過濾層析時兩兩之間無法實現分離，對所有全滲透分子同樣如此。如兩種物質都是部分滲透分子但分子大小不同，其Kd值不同因而Ve也不同，可實現分離，這種部分滲透分子之間的分離稱為分級分離。而不同類別分子之間，即在上圖中組分A與組分B，或組分A與組分C，或組分B與組分C之間的分離稱為組別分離。凝膠過濾層析

第二節原理當凝膠與被分離組分存在相互作用的情況下會出現Kd>1的情況。這種相互作用包括：（1）疏水作用（2）親和作用（3）離子間的靜電作用

凝膠過濾層析

第二節原理㈢凝膠過濾的分辨率層析分離常采用分辨率（RS）來描述兩種物質之間分離效果的好壞。分辨率定義為兩個洗脫峰峰頂對映的洗脫體積之差比上兩峰在基線上峰寬的和的平均值。式中，Ve1和Ve2——洗脫峰1和峰2的洗脫體積；Wb1和Wb2——洗脫峰1和峰2的峰寬。RS是相鄰兩個洗脫峰相對分離程度的衡量標準。凝膠過濾層析

第二節原理分辨率Rs的定義凝膠過濾層析

第二節原理分離兩種物質時分辨率取決于這兩種組分的洗脫體積和峰寬。而決定組分洗脫體積和峰寬的因素包括兩種組分的分子大小，凝膠柱的選擇性和柱效。選擇性是一個系統分離大小不同組分的能力，習慣用相對保留值來表示，定義為：=（Ve2－V0）/（Ve1－V0）Ve1和Ve2——組分1和組分2的洗脫體積；V0——層析柱的外水體積。凝膠過濾層析

第二節原理柱效用在特定實驗條件下層析柱的理論塔板數N來表示通常表示為每米層析床所包含的理論塔板數，其計算公式：

Ve——組分的洗脫體積；Wh——洗脫峰半峰高（h1/2）時對映的峰寬。柱效還可用一個理論塔板的高度H來表示：H＝L/N式中L為柱長。凝膠過濾時柱效的好壞取決于層析柱的填充效果，凝膠顆粒的尺寸，柱長，流速等因素，良好的裝柱操作，較細的介質，較長的層析柱都有利于提高柱效。凝膠過濾介質的種類

⑴多糖類骨架的介質：多糖類主要為纖維素，葡聚糖及瓊脂糖。這類介質具有親水性及與生物大分子的相容性，可允許生物大分子透過而不發生變性。具有軟基質，壓力降大，不易操作。四、凝膠過濾介質的種類(2)合成大分子骨架的介質吸取多糖類骨架親水性的優點，克服其易受微生物侵襲的缺點，開展了合成有機小分子骨架的研究。選用高親水性單體，經共聚反應并控制孔結構出現了一些合成骨架的介質。（3）由天然大分子與合成高聚物構成混合骨架的介質：這種骨架既可增加介質的剛性及抗微生物侵蝕性，又使介質具有與生物大分子的相容性。凝膠過濾常作為下游的最終精細純化步驟，例如：肽，多糖，酶，重組蛋白，單抗及大蛋白。針對：樣品已純化部分。凝膠過濾操作，通常上樣量的體積越小，分辨率越高。凝膠過濾注意事項最終精細純化步驟：例如肽與酶蛋白。裝柱過程——不要分層。避免凝膠吸附生物大分子。選擇分離范圍與分子量接近的介質。處理量大的樣品，選擇粒徑較大，流水速度快的介質。處理量小，需要精細分離的樣品，選擇粒徑小且分辨率較高的介質。四、凝膠過濾介質的主要品種（一）葡聚糖系：葡聚糖凝膠是一種微網孔凝膠，在凝膠層析中使用最廣泛的一種層析介質。商品名稱Sephadex.⑴結構：Sephadex

是以氯代環丙烷進行交聯的葡聚糖珠狀凝膠，交聯度影響凝膠的孔結構，依據孔徑不同G型凝膠產品。G后面的數字為孔徑越大，排阻極限越大。G-10<700,G-25<1000-1500,G-200<5000-80000⑵性能：①溶脹性Sephadex系以干態供應，使用之前需要溶脹（沸水浴加速溶脹）工作范圍：工作范圍（Mr)=(G-數目）X吸水量X10200X20X10=40000Sephadex是以氯代環氧丙烷交聯的葡聚糖珠狀凝膠。G后數子越大表示孔徑越大，排阻極限越大。②化學穩定性：Sephadex不溶于一切溶劑，在水，鹽溶液，堿和弱酸溶液中均為較穩定。因糖苷鍵在強酸中可發生降解作用所以只能接觸強酸的稀溶液。在0.1mol/L鹽酸中1-2h,在0.02mol/L鹽酸中經6個月無明顯變化，要避免使用氧化劑。③物理穩定性：pH中性濕態珠體可經受120℃，30min高壓滅菌而不影響色譜性能。④機械強度：Sephadex凝膠的機械強度，取決于交聯度。高交聯度的凝膠為G15。G15為剛性，G25及G50也能承受一定的壓力。⑶主要用途：孔徑較小的凝膠（如G10，G15，G25，G50）主要用于脫鹽，肽與其他小分子的分離，孔徑較大的凝膠用于蛋白質與其它大分子的分離。

DNA級的Sephadex適用于DNA或低聚核苷酸分離。⑷衍生系①SephadexLH系：在葡聚糖結構中引入羥丙基就成為LH系列產品，以G-25為母體的衍生物為LH20，以G50為母體則為LH60，經改性后LH系介質具有更廣泛的用途，適用于脂類，甾類，脂肪類，激素，維生素及其它小分子的分級分離。

這類介質除水溶液外，還適用用于極性有機溶劑及水有機溶劑的混合物中。②LH系列的主要用途用于有機溶劑中的凝膠過濾。廣泛用于吸附色譜及分配色譜：適合于其他凝膠難以處理的樣品。排阻極限與原母體凝膠相同。LH20對芳香多環化合物的吸附能力大于LH60，而LH60因為有較大的固定相體積而更適合于分配色譜。⑶SephasorbHPultrafine

該產品也是羥丙基化衍生物，交聯度極高，粒徑分布窄（10-23um),由于它的剛性及狹窄的粒徑范圍，使其即可用于中壓液相色譜，也可以用于HPLC；由于它的選擇性及惰性，使其廣泛用于（如醛，酮，酚和核苷酸等）分離，又因為中等極性，所以可以用于正相色譜，也可以用于反相色譜。

HPLC----多肽及小分子中壓液相色譜----蛋白質。

（二）瓊脂糖系瓊脂糖系凝膠都是經過純化的瓊脂糖制備的，其中僅含有極少量的帶電荷基團。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時可凝膠化的特點，可較為方便地制成珠狀物。在凝膠過程中先由單獨的多糖鏈形成雙螺旋，然后聚集成膠束。⑴Bio-GelA系：該產品由美國Bio-Rad公司生產的產品，為非交聯瓊脂糖凝膠（使用溫度限制），受熱時，凝膠解體，使用溫度范圍2-30℃,適用pH范圍4-13。

⑵Sepharose系：①非膠聯結構，不能高壓滅菌，僅限制2-40℃。根據瓊脂糖含量不同有3種型號，含量為2%,4%,6%的分別為2B，4B6B。

②SepharoseCL是瓊脂糖珠體與2，3-二溴丙醇反應后具有共價交聯鍵的產物。交聯結構大大提高了珠體的熱穩定性及物理化學穩定性，對孔結構無明顯影響。交聯后的凝膠在還原條件下，經堿水解后以去除硫酸根，減少常帶基團。因此，這類介質的非特異性吸附比其母體更小。這種凝膠在中性條件下可以經120℃消毒，其色譜、性能不變，可以用離子交換及親和吸附劑的母體。

③Superose:由珠狀瓊脂糖兩次交聯而制備的新型凝膠為Superose.瓊脂糖先與含有雙環多氧基及多環氧基的混合長鏈交聯劑進行第一階段交聯。然后，再與含有雙功能基的短鏈交聯劑進行第二次交聯得到產品。經兩次交聯后大大提高了介質的剛性，并進一步增加了其物理化學的穩定性。用0.01mol/LHCl及0.1mol./LNaOH在40℃處理兩周，色譜性能無明顯變化，還可經受70%甲酸處理。

Superose是適用于高流速的高效的高效凝膠過濾介質，有Superose6及Superose12型號，其中含有瓊脂糖分別為6%和12%。⑶聚丙烯酰胺系：Bio-GelP是丙烯酰胺與N，N-亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的親水性凝膠，其中含有極少的游離電荷，羧基含量<3.0umol/g

干膠，因此，非特異吸附性很小。這類合成高聚物結構穩定，不受微生物侵蝕，120℃消毒，30min不變性。改變交聯劑用量可控制不同孔徑，得到不同的排阻極限的系列產品。⑷Superdex系列產品：Superdex

是最新的凝膠過濾介質，是將葡聚糖以共價結合到高交聯的多孔瓊脂糖珠體上，形成的復合凝膠。瓊脂糖的高交聯骨架為保持提供了較高的物理化學穩定性，葡聚糖為介質提供了良好的穩定性。

特點：凝膠為剛性珠體，適合于高流速且分辯率較高，制備級分離效率可達到15000-3000塔板/米。粒徑24-44um的為制備級，均適用于HPLC系統。

極低的非特異性及極高的蛋白質回收率。SuperdexPeptide優良的化學穩定性pH適應范圍為1-14可在極性有機溶劑如70%乙腈水溶液中進行分離。在70%甲酸溶液中分離疏水性的多肽，同樣也可以用于堿性溶液。⑸Toyopearl聚乙烯醇系：以交聯聚乙烯醇為骨架的凝膠過濾介質。

Toyopearl為多孔的三向網狀結構，大分子鏈上含有豐富的羥基，骨架為高親水性，還可以進行化學改造，而得到含有多種功能的離子交換劑及親和吸附劑的載體。該系統凝膠與生物大分子有相溶性，作為固定化生物催化劑已獲得廣泛應用。

Toyopearl系的主要性能：①具有優良的物理化學穩定性，不溶于水及有機溶劑，不受微生物的侵蝕。

②由于該系列為合成高聚物，純度較高，大分子鏈中幾乎無帶基團，其非特異性吸附可忽略不計，蛋白質回收高。③該系為半剛性凝膠，適合于高流速，高生產效率的工業規模應用，有較長的使用壽命，120℃反復消毒，色譜性能不受影響。

⑹Ultrogel系

UltrogelA是瓊脂糖凝膠，瓊脂糖含量為2%，4%，6%分別命名為A2，A4，A6。

Ultrogel

AcA是聚丙烯酰胺與瓊脂糖混合骨架的凝膠，它具有較窄的粒徑分布及孔徑分布，為剛性珠狀，具有優良的化學物理穩定性。⑺Bio-BeadS-X系(疏水性凝膠)

Bio-BeadS-X系列是美國BioRad公司的產品，為多孔苯乙烯-二乙烯苯共聚物。其適用于疏水性物質及非水溶液。以二乙烯苯含量控制孔徑，但也受到洗脫劑的影響，在芳香族溶劑中其溶脹度大，排阻極限也增大，在醇類中，骨架不溶脹，孔徑小，排阻極限也小。多孔玻璃珠其他載體凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計一、凝膠過濾介質的選擇㈠分離目標和凝膠過濾介質的特性根據分離樣品的數量和目的，生化分離過程分為分析型和制備型分離。分析型分離中樣品的量較少，分離目的包括目標分子純度測定，分子量測定，分子量分布分析，獲取微量的目標分子等。制備型分離涉及樣品的量相對較多，分離目的包括對樣品進行脫鹽和緩沖液交換，去除混合物中的某些雜質，實驗室小規模的獲取目標物質，以及工業化制備某種物質等。

凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計凝膠顆粒大小有粗、中、細、超細等，其顆粒直徑依次減小。一般情況下，粗規格的凝膠適合于對數量較多的樣品進行分離，中規格的凝膠適合于少量、微量樣品的制備，常規分析和測定，而細和超細規格的凝膠則適合于微量和極微量樣品的分析。凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計為了成功地分離樣品，必須根據樣品特性和分離目的合理地設計出分離純化實驗方案。在設計實驗方案時，應當考慮的因素主要包括凝膠過濾介質或預裝柱的選擇，洗脫劑的選擇，層析柱尺寸的控制，以及層析過程中有關參數的確定。凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計㈡選擇性曲線和分離范圍待分離物質的分子大小是決定選用何種介質的最重要因素，絕大多數情況下，所選凝膠的分級范圍應當涵蓋目標分子的大小。只有在這種情況下，介質才能對目標分子和其他大小不同的雜質分子表現出不同的選擇性（α），從而進行有效分離。凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計而凝膠的選擇性是由基質的性質和結構所決定的，與流動相無關，即凝膠過濾分離效果的好壞主要取決于介質，因此介質的選擇十分關鍵。凝膠介質的選擇性曲線對于指導凝膠的選擇很有幫助。選擇性曲線是凝膠的重要參考指標，一般是通過溶質的有效分配系數Kav對溶質的分子大小作圖得到。有時也可以用溶質的洗脫體積Ve對分子大小作圖.

凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計㈢樣品和洗脫劑的特性在分子量相同的情況下，分子形狀不同的物質分配系數和洗脫體積相差很大。每種介質的選擇性曲線都有針對球狀蛋白和針對葡聚糖兩種，應根據目標分子的形狀更接近球狀蛋白還是線形的葡聚糖來確定其適合哪種選擇性曲線，進而決定介質類型。

在目標分子的分子量或分子形狀未知的情況下，一般可以先選擇分級范圍較寬，有著較高排阻限的介質來進行分離.凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計二、洗脫劑的選擇

凝膠過濾層析中所用流動相即洗脫劑通常不對選擇性產生影響，從理論上講，如果所分離物質不帶電荷，可以直接用蒸餾水進行洗脫，實際操作時，當對較大體積的樣品進行脫鹽實驗時，也的確有用蒸餾水洗脫的例子。然而絕大多數情況下人們考慮用緩沖液而不是蒸餾水來作為洗脫劑。凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計選擇緩沖液時首先要考慮的是在純化過程中維持合適的pH，在此pH下目標分子穩定性良好。大多數凝膠過濾在中性pH附近進行，此時建議使用緩沖能力在pH6~8的水相緩沖系統，此環境對多數生物分子及介質都是適宜的。有的凝膠介質本身會帶有少量的負電荷，這會對按分子大小分離的凝膠過濾層析結果產生影響，為了排除這種影響，洗脫劑通常需要具有一定的離子強度，通常0.15mol/L的離子強度足以排除溶質與介質之間任何的離子作用。

凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計三、層析柱的選擇層析柱應當具有以下特點：（1）柱壁材料結實、化學惰性，能夠承受一定的操作壓力，在常規的層析條件下保持穩定，不與樣品及洗脫劑發生相互作用；（2）層析柱的入口和出口部分的死體積盡可能小，低于柱體積的0.1%，這樣可以使樣品的稀釋程度最小化，同時防止已經分離的樣品區帶在柱下端重新混合；

凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計（3）柱內有設計合理的凝膠床支持物，既能有效的支撐凝膠床，又不易被堵塞，保證液流能夠均勻的通過；（4）容易拆卸，方便清洗，最好配件具有通用性。實驗室常用的凝膠過濾柱的內徑大多在4~16mm，而柱長大多在25~100cm。

凝膠過濾層析

第三節實驗方案設計四、選擇預裝柱對于高分辨率凝膠介質，其粒度往往較細，要獲得好的柱效填充技術非常重要。為了確保此類介質的高分辨特性，很多公司將自己的部分層析介質制成預裝柱后出售，由于采用了優良的材料，合理的層析柱結構設計和良好的裝柱技術，這些層析柱在耐用性、清洗效果、柱效等很多方面要優于自裝柱。當然，其價格相對來說比零售介質更貴。

凝膠過濾層析

第三節層析技術

當實驗方案設計完成后，就需要著手對選擇好的凝膠介質、層析柱、洗脫劑、樣品等進行準備，裝柱，平衡，加樣，洗脫，樣品檢測并收集，層析柱的清洗和再生，這些方面統稱為層析技術。凝膠過濾層析

第三節層析技術一、凝膠的準備如果介質是以已溶脹好的形式出售的，此類介質一般也無需預處理，使用前靜置使介質沉降，傾去上清液，按濕膠∶洗脫劑（v/v）=3∶1的比例添加洗脫劑，攪勻后即可裝柱。

如果介質是以固態干膠形式出售的，在使用前需要進行溶脹。溶脹是介質顆粒吸水膨脹的過程，膨脹度（得水值）與基質種類、交聯度及洗脫劑種類等有關。為了填充一根選定的層析柱需要稱取多少量的干膠是可以計算的：干膠用量（g）＝πr2h/膨脹度（床體積ml/g干膠）

凝膠過濾層析

第三節層析技術二、裝柱㈠填充過程裝柱質量的好壞直接影響到分離效果，填充得不好的層析柱會導致柱床內液體流動不均勻，造成區帶擴散，大大影響分辨率，也會對層析流速產生影響。

裝柱過程應避免在通風和日光直曬的環境中進行，以防溫度改變造成層析柱內產生氣泡。層析柱應在支架上垂直放置。裝柱之前先用洗脫劑將層析柱底部死空間內的空氣排空.

凝膠過濾層析

第三節層析技術將已處理好的介質放置在燒杯中，倒掉過多的液體，大致使得沉降介質：上清液（v/v）=3∶1。介質太稠在裝柱時容易有氣泡產生，而介質太稀則很容易在柱中形成多個界面，造成很差的填充效果。將介質懸液輕微攪拌混勻，利用玻棒引流盡可能一次性將介質傾入層析柱，注意液體應沿著柱內壁流下，防止有氣泡產生.凝膠過濾層析

第三節層析技術㈡填充質量的評估裝柱完成后，在進行層析之前應當對裝柱情況進行檢查，簡單的方法是將柱子對著亮光，利用透過光檢查柱床是否規整，是否有氣泡或界面存在。

也可以通過對有色物質進行層析并觀察區帶情況來實現，觀察有色區帶通過凝膠床時的變化情況可以檢驗填充效果，填充良好的凝膠柱在洗脫時區帶保持均勻、平穩的向下移動。

凝膠過濾層析

第三節層析技術㈢柱的平衡

平衡的目的是為了確保層析柱中凝膠顆粒網孔和間隙中的液體與洗脫劑在組成、pH和離子強度等方面達到完全一致，這樣在加樣和洗脫過程中就能使待分離組分始終在所需的溶液環境中，有利于目標分子活性的保持和層析行為的穩定性。人們通常采用2~3個床體積的洗脫劑通過層析柱來確保其完全達到平衡。

凝膠過濾層析

第三節層析技術三、樣品和洗脫劑的準備洗脫劑配制時采用的試劑應當是分析純，而所用的水應當為純水。洗脫劑配制完畢在使用前，最好對其進行過濾。層析前樣品如果是固體，可以將其溶于一定體積的洗脫劑中，如果是液體樣品，則可以直接加樣。為了延長介質的使用壽命和保持高的分辨率，樣品中同樣必須無顆粒狀物質存在。凝膠過濾層析

第三節層析技術樣品的黏度是影響上樣量和分離效果的一個重要方面.如果樣品黏度過高是由于濃度造成的，用洗脫劑或水稀釋樣品可以達到降低黏度的目的；如果黏度是樣品中核酸等雜質引起的，可通過添加大分子聚陽離子化合物如聚乙酰亞胺或魚精蛋白硫酸鹽將其沉淀，或添加核酸內切酶來降低黏度，但這些物質無疑會成為額外的雜質。如果樣品黏度非常高的話，也可以通過往洗脫劑中添加蔗糖或葡聚糖增加洗脫劑的黏度來補償。凝膠過濾層析

第三節層析技術四、加樣

當層析柱準備好且平衡完成，樣品和洗脫劑準備完畢后,就可以開始加樣和洗脫了。加樣過程是將一定體積的樣品添加至層析柱頂端，并使其進入凝膠柱。凝膠過濾層析

第三節層析技術㈠加樣量的選擇在進行層析時樣品的添加量主要受分辨率的限制，因為分辨率Rs與樣品體積/柱體積之比有關，樣品體積/柱體積的比值增大會導致分辨率下降。對于分析型分離和難度比較大的分級分離，樣品體積/柱體積之比必須很小，此時加樣體積應為床體積的0.5-5%,更小的加樣比例并不能進一步改善分辨率。對于具體實驗的加樣量，需根據樣品組成和性質，凝膠介質及想得到的分離程度來確定。

凝膠過濾層析

第三節層析技術㈡加樣方法和注意事項加樣是將一定體積的樣品溶液添加至柱床的床面，依靠重力或泵提供的壓力使樣品進入床面的過程。在加樣過程中樣品溶液應盡可能均勻添加至床面，這樣在柱床的橫截面上樣品能夠均勻進入，另外要防止液流破壞床面的平整性，否則會造成區帶形狀變差，洗脫峰變寬，從而對分辨率產生很大影響。凝膠過濾層析

第三節層析技術加樣的方法有多種，如果采用的是成套液相層析系統，一般都提供標準的加樣方法，如通過進樣器或注射器等，最終利用泵將樣品溶液加入柱床。對于不帶有可調接頭的傳統填充柱，常見的加樣方法有排干法和液面下加樣法。凝膠過濾層析

第三節層析技術排干法是加樣前先將層析柱上口擰開，讓床面之上的液體靠重力作用自然排干，當床面剛好暴露時將層析柱下端閥門關閉。閥門的關閉時機必須選擇恰當，過早關閉床面上仍留有少量液體會對樣品產生稀釋作用，關閉過晚會導致床面變干。用吸管將樣品輕輕鋪加到床面上，注意不能破壞床面的平整，以免造成區帶的扭曲和傾斜，然后打開柱下端閥門，受重力作用樣品溶液進入床面，當樣品剛好完全進入時關閉閥門。最后用洗脫劑充滿層析柱內床面上端空間，擰緊層析柱上口，即可以用恒流泵泵入洗脫劑開始洗脫。

凝膠過濾層析

第三節層析技術五、洗脫技術當加樣完畢并且樣品進入層析柱后，應當立即用洗脫劑對樣品進行洗脫，以防樣品在層析柱中擴散。通常洗脫過程以一個恒定的流速使洗脫劑通過層析柱，而這個恒定流速由靜水壓或者泵來控制。凝膠過濾層析時可采用的最大流速受到多種因素的限制，其中最為關鍵的因素是介質的強度，流速不能超出該介質的最大流速限制.凝膠過濾層析

第三節層析技術采用較大流速的情況出現在組別分離和大規模制備型分離時，前者由于很容易達到所需分辨率，采用高流速可有效縮短分離時間，后者對分離速度、生產效率有著比較高的要求，而對分辨率的要求相對較低，因此這兩種情況可在不超過介質最大流速和背景壓的情況下盡量采用高流速。在分析型分離時對分辨率的要求較高，因此通常會采用相對較低的流速。

凝膠過濾層析

第三節層析技術六、樣品的檢測、收集和處理樣品進行層析時，各組分的分離情況，目標分子的洗脫情況等都反映在層析圖譜中，在層析圖譜中，橫坐標是時間或洗脫液體積，縱坐標是檢測器的讀數。

根據樣品中組分性質的不同，有多種不同的檢測器可供選擇。最常用的是紫外（UV）檢測器，可以在兩到三個固定的波長如280nm，254nm，214nm下測定洗脫液的吸光度.

凝膠過濾層析

第三節層析技術一般來說人們需要獲得分離后的樣品，因此需要收集通過層析柱的洗脫液。對于最簡單的樣品分離，可以采用手工收集的方法，觀察到層析圖譜中出現洗脫峰時開始收集，到洗脫峰結束時終止收集。液相層析系統一般都配置了分部收集器來對樣品進行收集。收集的模式可以有多種，常用的是按規定的時間或洗脫液體積進行分部收集，也可根據檢測器檢測到的洗脫情況，按洗脫峰進行收集。凝膠過濾層析

第三節層析技術七、凝膠過濾介質的再生、清洗和貯存

理論上來說，在洗脫劑具有一定離子強度的情況下，樣品中所有組分都應當在一個柱體積內被洗脫，當洗脫液體積超過一個柱體積時洗脫即可停止.但實驗中通常會使用1.5~2個柱體積的洗脫劑來完成洗脫過程。在清洗方法上，最為常規的是采用堿洗，根據介質的pH穩定范圍（短程）不同，用0.1~0.5mol/L的NaOH溶液對介質進行清洗除去污染物。

凝膠過濾層析

第三節層析技術浸泡在溶液中的層析柱和介質在很少使用的情況下容易出現微生物生長的現象，尤其是葡聚糖和瓊脂糖類型的凝膠介質，易于感染會分泌糖苷酶的微生物，導致基質聚合物中的糖苷鍵降解而破壞了介質的結構。因此，無論是層析柱還是介質，在長期不使用時，不建議浸泡在對于微生物生長來說營養豐富的緩沖液如磷酸鹽緩沖液中，另外，在其浸泡的溶液中添加適當的抑菌劑是必須的。凝膠過濾層析

第四節應用實例

凝膠過濾層析可以應用于多種情況，例如對樣品進行脫鹽和緩沖液交換，測定目標分子的相對分子量，測定多聚物的分子量分布，測定親和過程的平衡常數，當然還有對樣品進行分析型或制備型的分離，等等。

凝膠過濾層析

第四節應用實例一、脫鹽脫鹽是指將鹽類等小分子物質從樣品中除去,從而得到僅剩大分子物質的樣品溶液.與透析法相比,凝膠過濾脫鹽具有樣品處理量大,操作時間短,不影響生物大分子活性等突出的優點。脫鹽過程屬于組別分離,目標分子和鹽類等在分子大小上存在很大的差異,很容易達到所需分辨率,因此對于介質和層析柱的效率要求較低.選擇合適粒度的介質，使層析過程的背景壓力較低,目標分子在外水體積V0被洗脫,小分子在一個柱體積內被完全洗脫,即能達到脫鹽要求。

凝膠過濾層析

第四節應用實例脫鹽過程的目的是為了除去樣品中的鹽類等小分子，當然在此過程中人們不希望引入其他小分子雜質，因此脫鹽時可以直接采用蒸餾水作為洗脫劑，以避免引入緩沖鹽等組分。脫鹽操作既可以在很小的規模上對微量樣品進行，也可以在很大規模上進行。

凝膠過濾層析

第四節應用實例

層析柱：85040mm

i.d.，介質SephadexG-25，樣品：O，血紅蛋白；X，NaCl。加樣體積：A＝10ml，B＝400ml。用凝膠過濾對大體積樣品脫鹽

凝膠過濾層析

第四節應用實例三、相對分子質量的測定凝膠過濾層析是常用的測定生物分子相對分子質量的方法。與其他一些分子量測定方法如電泳技術相比，凝膠過濾法能夠在很寬的pH、離子強度、溫度范圍內測定天然非變性條件下生物分子的分子量，并且測定過程較為簡單，不受目標分子帶電狀態的限制，因而在實驗室中被廣泛使用。凝膠過濾層析

第四節應用實例依據公式:凝膠過濾法測定分子量的基礎是公式Kav=a－blogMr即有效分配系數Kav與溶質分子量的對數logMr之間線性關系，也就是介質的選擇性曲線的線性部分。對于特定的凝膠柱，由于外水體積和柱體積是恒定不變的，根據公式可知，Kav=（Ve－V0）/（Vt－V0）在一定分子量范圍內，洗脫體積Ve與logMr之間也存在線性關系。由于選擇性曲線是呈現S型的，在選擇性曲線的兩端，并不是理想的線性關系，因此在測定分子量時，目標分子的有效分配系數必須滿足0.1<Kav<0.9，這也是所選介質的工作范圍。凝膠過濾層析

第四節應用實例具體做法:利用上述線性關系，人們通過將幾種已知分子量的物質加樣至層析柱，分別測出洗脫體積Ve，同時計算出這些分子相應的logMr值，并以Ve對logMr作圖，即得到該層析柱的分子量標準曲線。然后在相同的條件下對需要測定分子量的物質進行層析，測出其Ve值，根據標準曲線即可求出該物質的分子量。凝膠過濾層析

第四節應用實例凝膠過濾層析蛋白質分子量標準曲線

凝膠過濾層析

第四節應用實例五、混合物的分級分離㈢分離多糖多糖與蛋白質、脂類形成的糖蛋白、脂多糖在細胞的識別、分泌以及在蛋白質的加工和轉移等方面起著不容忽視的作用。近20年來，人們進一步發現多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面具有重要的生物活性作用，因而糖生物學的研究逐漸成為生命科學領域研究的熱點，而在多糖的分離純化和分子量分布分析中，凝膠過濾層析的應用也被廣泛地報道。凝膠過濾層析

第四節應用實例具體實例:從醫用真菌Phellinus

linteus的子實體中純化一種酸性蛋白聚糖的方法。首先通過熱水抽提、過濾、有機溶劑沉淀、透析和凍干等一系列過程得到粗多糖，然后用陰離子交換層析和凝膠過濾層析結合使用純化其中的酸性組分。

凝膠過濾層析

第四節應用實例從Phellinus

linteus的子實體中提取的粗多糖中純化酸性蛋白聚糖

DEAE-纖維素離子交換層析，橫坐標為分部收集時的分部號，縱坐標O.D.值經DNS顯色后測出；對離子交換后的活性分部進行SepharoseCL-4B凝膠過濾層析，O.D.值經DNS顯色后測出。第二部分離子交換層析

第一節概述離子交換層析（Ion-exchangechromatography，簡寫IEC）是發展最早的層析技術之一。古代人們使用沙石來凈化飲用水就是利用了離子交換的原理;

目前，離子交換層析已成為蛋白質分離純化中最常用的手段.離子交換層析

第一節概述離子交換層析具有特點：（1）分辨率高，（2）交換容量高，有利于放大分離規模和在工業生產中應用，（3）應用靈活，（4）分離原理比較明確，（5）操作簡單易行，離子交換層析

第二節相關理論一、離子交換基本原理

帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團進行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離。離子交換層析

第二節相關理論離子交換色譜中所進行的離子交換過程（以陽離子交換樹脂為例）離子交換層析

第二節相關理論離子交換層析的本質:目的物與離子交換劑的結合能力首先取決于溶液pH，它決定了目的物的帶電狀態，此外還取決于溶液中離子的種類和離子強度。起始條件，溶液中離子強度較低，上樣后，目的物與交換劑之間結合能力更強，能取代離子而吸附到交換劑上；洗脫時，往往通過提高溶液的離子強度，增加了離子的競爭性結合能力，使得樣品從交換劑上解吸.離子交換層析

第二節相關理論其它作用力：疏水相互作用和氫鍵.目的物與離子交換劑發生結合主要依靠相反電荷之間的離子鍵，但實際上此過程中還可能存在其它的作用力，常見的就是疏水相互作用和氫鍵。疏水相互作用主要出現在使用帶非極性骨架的離子交換劑時，例如聚苯乙烯樹脂.

氫鍵主要出現在使用以親水性高分子為骨架的離子交換劑，如以Sephadex或Sepharose為基質的離子交換劑.離子交換層析

第二節相關理論離子交換劑由水不溶性基質和共價結合在基質上的帶電功能基團組成，帶電功能基團上還結合有可移動的與功能基團帶相反電荷的反離子（又稱平衡離子）。反離子可被帶同種電荷的其它離子取代而發生可逆的離子交換.離子交換劑的類型

離子交換劑的分類可以依據其基質成分或功能基團來進行.按功能基團分為強陽、強陰、弱陽、弱陰四種類型.按基質構成分為離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換瓊脂糖等。離子交換樹脂離子交換樹脂的結構帶有活性基團的網狀高分子聚合物骨架活性基團酚醛樹脂聚乙烯樹脂交聯劑酸性基團堿性基團—SO3H—COOH—N+R3—NR2Ionexchangeresins特殊基團常見的離子交換功能基團類型名稱英文符號功能基團陰離子交換劑二乙基氨乙基DEAE－OCH2CH2N+H(C2H5)2季銨基乙基QAE－OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3季銨基Q－OCH2N+(CH3)3三乙基氨乙基TEAE－OCH2CH2N+(C2H5)3氨乙基AE－OCH2CH2NH3+陽離子交換劑羧甲基CM－OCH2COO－磺丙基SP－OCH2CH2CH2SO3－磺甲基S－OCH2SO3－磷酸基P－OPO3H2Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead106Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----107Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--108Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++109Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------110

離子交換層析

第二節相關理論1．上樣階段，此時離子交換劑與平衡離子結合；（平衡階段）2．吸附階段，混合樣品中的分子與離子交換劑結合；3．開始解吸階段，雜質分子與離子交換劑之間結合較弱而先被洗脫，目標分子仍處于吸附狀態；4．完全解吸階段，目標分子被洗脫；5．再生階段，用起始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次使用。離子交換層析一般步驟離子交換層析

第二節相關理論無機離子與交換劑的結合能力與離子所帶電荷成正比，與該離子形成的水合離子半徑成反比。也就是說，離子的價態越高，結合力越強，價態相同時，原子序數越高，結合力越強。在陽離子交換劑上，結合力強弱順序為：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+在陰離子交換劑上，結合力強弱順序為：F-－<Cl－-－<Br－-－<I－-－

離子交換層析

第二節相關理論離子交換的分辨率離子交換的效果常用兩個目標峰的分辨率（RS）來描述。分辨率定義為兩個洗脫峰峰頂對映的洗脫體積之差比上兩峰在基線上峰寬的和的平均值。式中，VR1和VR2——洗脫峰1和峰2的洗脫體積；Wb1和Wb2——洗脫峰1和峰2的峰寬。洗脫體積和峰寬應使用相同的體積單位表示。離子交換層析

第二節相關理論RS是相鄰兩個洗脫峰相對分離程度的衡量標準.假設兩個相鄰洗脫峰面積相等，RS＝1.0時，兩峰實現主體分離；若達到完全分離，要求RS≥1.5。需指出的是，一個完全分離的洗脫峰在很多時候并不意味著是單一組分，當分離參數改變后，往往又能分開成為若干個峰。不同分辨率下的分離效果

離子交換層析

第二節相關理論一個純化系統能夠達到的分辨率取決于該系統的選擇性、效率和容量，這是柱層析中的三個最重要的參數。RS的解析表達式為：㈠容量因子一般來說，容量因子k’的取值與可交換分子在固定相（離子交換劑）和流動相（緩沖液）中的分配性質、層析溫度及固定相和流動相的體積比有關，而與柱尺寸和流速無關。

離子交換層析

第二節相關理論㈡柱效率柱效率用在特定實驗條件下層析柱的理論塔板數N來表示，通常表示為每米層析床所包含的理論塔板數.柱效率下降會導致層析時區帶變寬，也就是洗脫峰的峰寬變大。

離子交換層析

第二節相關理論㈢選擇性選擇性是一個系統分離不同蛋白峰的能力，習慣用相對保留值α來表示，從對分辨率的影響上來看，好的選擇性往往比高的柱效率更為重要.離子交換層析

第三節方案設計和層析技術一、離子交換劑的選擇二、緩沖液的選擇和層析條件的確定三、層析柱的尺寸四、離子交換劑的準備五、樣品的準備六、加樣七、洗脫技術離子交換層析

第三節方案設計和層析技術在選擇了采用離子交換技術后，要想獲得好的分離效果，需要考慮的問題包括：1.分離的規模有多大，采用何種分離模式；2.選用什么樣的離子交換劑；3.何種規格的層析柱；4.選用何種緩沖液，起始條件如何確定；5.采用何種方法洗脫等。只有在這些問題都得到解決之后，才能設計出初步的實驗方案并付諸實施。離子交換層析

第三節方案設計和層析技術1.分離的規模有多大，采用何種分離模式

關于分離的規模和選用的模式。對于分析型分離和實驗室小規模制備型分離，一般采用常規的柱層析技術；而對于大規模工業化分離，可以有柱層析、膨脹床吸附、分批分離等多種模式可供選擇。

離子交換層析

第三節方案設計和層析技術2.離子交換劑的選擇為了能滿足快速分離的要求，所選擇的介質應當能夠在承受高的流速的前提下有著較低的背景壓力。由于樣品的數量大，高的有效交換容量是必需的，因此介質應當具有大孔型的結構和較高的取代程度。此外，該介質還必須能夠滿足原位清洗（CIP）的要求，對于大規模的層析柱，每次分離后將介質倒出清洗和再生，然后重新裝柱將是難以想象的。離子交換層析

第三節方案設計和層析技術3.緩沖液的選擇和層析條件的確定作為固定相的離子交換劑選擇好以后，還需要確定作為流動相的緩沖液，這里包括緩沖物質的種類，起始緩沖液的pH和離子強度，極限緩沖液的pH和離子強度等。離子交換層析

第三節方案設計和層析技術一般的原則是，進行陽離子交換時，選用緩沖離子為陰離子的緩沖物質；進行陰離子交換時，選用緩沖離子為陽離子的緩沖物質。當然這并不是絕對的，但是當選用的緩沖離子與功能基團帶相反電荷時，應特別注意在上樣前確保層析系統與起始緩沖液之間在pH和離子強度上都達到平衡。在此前提下，選用何種類型的緩沖物質取決于層析時的pH條件，后者又與目的物的等電點有關。確定了起始pH以后，根據緩沖物質的pKa值，選用pKa與起始pH很接近的物質作為緩沖成分。

離子交換層析

第三節方案設計和層析技術以上確定緩沖液的方法是建立在目的物的等電點已知的基礎上的，但在更多情況下，人們對目的物的性質未必清楚，此時緩沖液及起始pH的確定可以通過試管小試法確定.

離子交換層析

第三節方案設計和層析技術具體操作如下：（1）準備10支15ml試管；（2）每管加入0.1g基于交聯葡聚糖的離子交換劑或1.5ml基于瓊脂糖或纖維素的離子交換劑；（3）配制一系列濃度為0.5mol/L的不同pH的緩沖液，相鄰兩種緩沖液的pH相差0.5個單位，如果使用陰離子交換劑，這個系列的緩沖液pH分布在5～9，如果使用陽離子交換劑，這個系列的緩沖液pH分布在4～8;離子交換層析

第三節方案設計和層析技術（4）各取10ml上述不同pH的緩沖液分別加入10支試管中用以平衡交換劑，混合一段時間后棄去上清液，再分別加入10ml新鮮緩沖液，反復10次后可以使試管內的交換劑在pH上完全與緩沖液達到平衡;（5）再用10ml低濃度的同一pH的緩沖液洗滌各試管中的交換劑，反復5次可確保試管內的交換劑在離子強度方面與起始緩沖液保持一致；（6）各支試管中加入相同數量的樣品，混合放置5～

10min；（7）使離子交換劑沉降，分析上清液中目的物含量，結果如圖所示。離子交換層析

第三節方案設計和層析技術試管法確定起始pH和離子強度A．確定起始pH為7.0；B．確定起始鹽濃度為0.15mol/L，洗脫鹽濃度為0.3mol/LAB離子交換層析

第四節方案設計和層析技術確定起始緩沖液的離子強度時，多數情況下人們直接采用由緩沖物質提供離子強度的方法，即不額外往緩沖液中添加非緩沖鹽，緩沖物質的濃度（一般為0.02～0.05mol/L）決定了離子強度，只要起始pH選擇合適，在此離子強度下目的物完成能夠與交換劑結合。另外，多數情況下在完成吸附后，人們通過增加洗脫液離子強度的方式將目標蛋白從層析柱上洗脫下來，洗脫緩沖液就是由起始緩沖液添加特定濃度的非緩沖鹽組成，而非緩沖鹽所需的濃度同樣可以通過試管小試法確定。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術選擇緩沖液時除了考慮緩沖物質成分、pH和離子強度外,有時還需要注意其它一些問題。當離子交換后的洗脫組分需要進行冷凍干燥時，應考慮選用揮發性的緩沖物質，以盡可能少的將雜質成分帶入最終產品中。如果是大規模工業化分離，緩沖液的用量往往是非常大的，緩沖物質的價格也是必須考慮的問題，應當在pKa值相近的幾種緩沖物質中選用最廉價的。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術在有些情況下，離子交換的緩沖液中還會添加一些其它的化合物，其作用主要有：增加目的物的溶解度、提高層析分辨率、保護待分離物質等。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術三、層析柱的尺寸離子交換層析通常選用短的層析柱，即高徑比小的層析柱,典型的離子交換柱高度在5～20cm，高徑比一般小于5。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術四、離子交換劑的準備

選擇好離子交換劑后，進行離子交換層析前，必須先將離子交換劑準備好，這包括離子交換劑的預溶脹和清洗、裝柱以及用起始緩沖液平衡層析柱直至流出液在pH和離子強度方面與起始緩沖液一致。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈠離子交換劑的預處理Source系列、MonoBeads系列和MiniBeads系列等細顆粒介質通常產品供應商已經將其制成預裝柱出售，使用前不需預處理，直接用起始緩沖液平衡后即可加樣。基于瓊脂糖的Sepharose系列和Bio-GelA系列離子交換劑，以及DEAE-Sephacel交換劑是以液態濕膠形式出售的，一般也無需預處理，使用前傾去上清液，按濕膠∶緩沖液（v/v）＝3∶1的比例添加起始緩沖液，攪勻后即可裝柱。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術基于Sephadex的離子交換劑以固態干膠形式出售，使用前需要進行溶脹。溶脹過程通常應將交換劑放置在起始緩沖液中進行，完全溶脹在常溫下需1～2天，在沸水浴中需2個小時左右，而且在高溫下溶脹還能起到脫氣的作用。在溶脹過程中應避免強烈攪拌.基于纖維素的離子交換劑也是以干態形式出售的，使用前需要進行溶脹。也需要先傾泌除去細的顆粒，然后用酸堿輪流洗滌，洗滌時所使用的酸堿濃度大于纖維素交換劑，一般可用2mol/L的NaOH和HCl進行處理。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈡裝柱裝柱是層析技術的一個重要環節，裝柱質量的好壞直接關系到分離效果.裝柱之前首先用緩沖液將層析柱底部死空間內的空氣排空，將預處理好的離子交換劑放置在燒杯中，傾去過多的液體，大致使得交換劑∶上清液（v/v）=3∶1，輕微攪拌混勻，利用玻棒引流盡可能一次性將介質傾入層析柱，注意液體應沿著柱內壁流下，防止有氣泡產生.

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈢選擇預裝柱

很多公司將自己的層析介質制成預裝柱后出售，由于采用了優良的材料，合理的層析柱結構設計和良好的裝柱技術，這些層析柱在耐用性、清洗效果、柱效率等很多方面要優于自裝柱。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈣柱的平衡平衡過程的目的是為了確保離子交換劑上的功能基團與起始緩沖液中的平衡離子間達到吸附平衡。判斷層析柱是否已經達到平衡是通過檢驗柱下端流出的洗脫液與起始緩沖液在pH、電導和離子強度方面是否達到一致，由于在這幾個指標中通常pH最難達到平衡，所以往往檢測洗脫液的pH即可。對于一些弱型離子交換劑，由于本身具有一定的緩沖能力，直接用起始緩沖液是很難將其平衡至起始pH的，此類交換劑在裝柱前就應當用酸或堿將其pH先調節至起始pH，裝柱后再用起始緩沖液進行平衡。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術五、樣品的準備

在任何形式的層析中，樣品中必須無顆粒狀物質存在,因此混濁的樣品在上柱前必須通過過濾或離心除去顆粒狀物質。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術樣品的粘度是影響上樣量和分離效果的一個重要方面，如果樣品粘度過大是由于濃度過大造成的，那么用起始緩沖液稀釋樣品可以達到降低粘度的目的；如果粘度是由樣品中存在的核酸等雜質引起的，可以通過添加大分子聚陽離子化合物如聚乙酰亞胺或魚精蛋白硫酸鹽將其沉淀，或者添加核酸內切酶來降低粘度，但這些物質的添加無疑會引入額外的雜質，在后續分離中必須將其除去。在離子交換層析上樣前必須確保樣品溶液在pH和離子強度方面與起始緩沖液是一致的，這樣才能保證在起始條件下目的物能吸附在離子交換劑上

.離子交換層析

第四節方案設計和層析技術六、加樣㈠.加樣量的選擇理論上，將所使用的離子交換劑的有效交換容量乘上層析柱柱床的體積就可以計算出最大加樣量,但事實上有效交換容量并不是常數.因此，在離子交換層析中為了獲得理想的分離效果，建議加樣時樣品中目的物的含量不應超過其有效交換容量的10～20％。

實踐中有時目的物的含量是未知的，可以通過試管小試法來確定最大加樣量。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術具體的操作:在10支試管中分別加入相同數量的離子交換劑，用起始緩沖液充分洗滌、平衡，然后往10支試管中分別加入數量遞增的樣品溶液，相鄰兩支試管間加樣量的差值是恒定的，充分混合完成吸附，分析上清液中目的物的含量，上清液中不含目的物而加樣最多的試管對應的加樣量即為試管條件下的最大加樣量，根據試管內以及層析柱床離子交換劑的體積可以計算出層析條件下的最大加樣量。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈡加樣方法和注意事項在加樣過程中樣品溶液應盡可能均勻的添加至床面，防止液流破壞床面的平整性，否則會造成區帶形狀變差，洗脫峰變寬。

常見的加樣方法有排干法和液面下加樣法。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術七、洗脫技術多數情況下，在完成了加樣吸附和洗滌過程后，大部分的雜質已經從層析柱中被洗去，然后需要改變洗脫條件，使起始條件下發生吸附的目的物從離子交換劑上解吸而洗脫.離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈠洗脫機制溶質在柱上吸附或交換的量的多少，我們可用吸附平衡常數或稱為分布系數α來表示，其定義可用數學式表示為：α＝被吸附的某溶質量/某溶質總量＝固定相/（動相+定相）吸附平衡常數α的取值在0～1之間，不同α值下，溶質的吸附強度不同，被洗脫的難易程度也會出現變化。若α=0，溶質沒被吸附，可能不帶電或帶相同電荷，在一個柱體積被洗脫，在柱中移動速度等于緩沖液的液速，有：Ve==Vt離子交換層析

第四節方案設計和層析技術若α=1或接近1，目的物可被完全吸附或幾乎完全吸附，溶質的動速等于0，Ve=→∞若α=0.9，溶質90%被吸附，動速=（1－α）流速=0.1流速,Ve==10Vtα動速/液速=1－αVe

10.9950.990.90.80.60.50.40.1000.0050.010.10.20.40.50.60.91∞2001001052.521.61.11不同吸附平衡系數α下溶質所需的洗脫體積

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術離子交換層析

第四節方案設計和層析技術α的影響因素：⑴pH影響到電性與電量，可使α發生變化；⑵離子強度增大，可使α下降，減弱溶質的吸附；⑶溶質的電荷分布，離子交換劑的電荷分布及位阻效應對溶質的α都有影響；⑷溶質的濃度與α則呈反比關系。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術根據上述討論的洗脫機制，要使蛋白質從離子交換劑上解吸而被洗脫，采取的方法有：⑴改變洗脫劑的pH，⑵增加洗脫劑的離子強度，

⑶往洗脫劑中添加特定離子，⑷往洗脫劑中添加一種置換劑，它能置換離子交換劑上所有蛋白質，蛋白質先于置換劑從柱中流出，這種層析方式稱為置換層析。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈡階段洗脫階段洗脫是用一系列洗脫劑進行的同溶劑洗脫，在每一階段，僅僅需要約一個柱體積的洗脫劑將此條件下發生解吸的組分洗脫下來。階段洗脫分為pH階段洗脫和離子強度階段洗脫。pH階段洗脫是用一系列具有不同pH的緩沖液進行洗脫，多數情況下這些緩沖液的緩沖物質是相同的，只是弱酸堿和鹽的比例不同。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術離子強度階段洗脫是使用具有相同pH而離子強度不同的同一種緩沖液進行洗脫，不同的離子強度通常通過添加不同比例的非緩沖鹽來實現，最常用的非緩沖鹽是NaCl，也可通過添加乙酸銨等揮發性鹽的方法來增加離子強度，或直接增加緩沖液中緩沖物質的濃度來增加離子強度.

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術階段洗脫技術簡單易于操作，對于一些層析條件已經清楚的蛋白質往往有著高的分辨率.但階段洗脫有時效果并不理想.

在初次分離目標蛋白時，人們往往先采用連續梯度洗脫，待確定了樣品的特性和洗脫條件后再考慮采用階段洗脫來優化分離效果，縮短操作時間。離子交換層析

第四節方案設計和層析技術

離子強度線性梯度洗脫和階段洗脫分離牛血清蛋白圖譜離子交換層析

第四節方案設計和層析技術離子強度階段洗脫和線性梯度洗脫效果對比離子交換層析

第四節方案設計和層析技術㈢梯度洗脫在進行梯度洗脫時，洗脫緩沖液的離子強度或pH是連續發生變化的，在某一條件下，吸附最弱的組分先被洗脫，在進一步改變洗脫條件后另一種組分被洗脫。洗脫峰的峰寬一般會小于階段洗脫，拖尾現象也會得到明顯的改善甚至完全消除，并且不會造成同一組分被分離成幾個峰的現象，常常能獲得較高的分辨率。梯度洗脫也分為pH梯度洗脫和離子強度梯度洗脫。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術在層析過程中梯度緩沖液可以通過梯度混合器來獲得。它們都是根據連通器原理來產生連續變化的梯度。

鹽濃度梯度曲線可以有不同的形狀，當A1＝A2時，產生的是線性梯度；當A1＜A2時，產生的是凸形梯度；當A1＞A2時，產生的是凹形梯度.離子交換層析

第四節方案設計和層析技術梯度的形狀及產生裝置

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術1.在選擇梯度的形狀時，如果是對目的物首次進行離子交換分離，強烈建議采用線性梯度.2.凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率，對于一份混合樣品，如果開始階段幾個洗脫峰之間能夠很好的分離，而末尾部分的幾個組分吸附能力比較接近時，采用凸形梯度既有利于末尾部分組分的分離.3.凹形梯度有利于改善梯度起始階段的分辨率，如果混合樣品起始部分組分吸附能力比較接近而末尾部分容易分開，采用凹形梯度能達到改善分辨率和縮短分離時間的效果。

離子交換層析

第四節方案設計和層析技術除了梯度的形狀，梯度的高度和斜率也影響著分離的速度和效果。梯度的斜率是指梯度的高度與完成此梯度時所用洗脫劑體積（或時間）的比值。在洗脫過