免疫細胞化學第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日什么是細胞化學？檢測和分析細胞的化學組成？細胞打碎，化學成分釋放。不是細胞化學技術第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日什么是細胞化學？在原位檢測和分析細胞的化學組成,保持原有結構和位置第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日細胞化學技術在保持細胞結構完整的條件下，借助細胞中的化學反應在原位確定化學成分的分布及這些成分的分布在細胞活動中的動態變化的技術，用以闡明細胞化學成分、結構和功能的關系。包括酶細胞化學技術、免疫細胞化學技術、放射自顯影技術和原位雜交等。第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.保持細胞、組織的固有形態和結構；2.防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質；3.細胞內蛋白質凝固;4.保持組織或細胞化學成分的某些屬性,如抗原性或核酸雜交活性。固定（Fixation)特點1.原位：怎樣做到組織/細胞的原位？方法：固定劑Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。

Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。

根據組織類型，選擇合適的固定劑

第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日特點2.細胞化學反應及可見性酶細胞化學技術免疫細胞化學技術原位雜交技術放射自顯影酶+底物反應顯色反應抗原+抗體反應顯色反應放射性同位素衰變和射線的釋放反應感光核酸雜交反應顯色反應第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

細胞化學技術主要包括：

酶細胞化學技術免疫細胞化學技術放射自顯影原位雜交技術等第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日定性、定位分析定量分析特點3.細胞化學反應的觀察顯微鏡流式第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日石蠟包埋或冷凍切片（保持原位）組織細胞固定化學反應顯色反應

細胞化學技術通用流程第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日3.技術的靈敏度和特異性、問題的解決（troubleshooting)靈敏度(Sensitivity):是否有信號特異性(Specificity)：信號是否特異2.技術的基本原理1.技術的適用范圍學習和應用細胞化學技術應注意的方面第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

細胞化學技術主要包括：

酶細胞化學技術免疫細胞化學技術放射自顯影原位雜交技術等第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細胞化學技術

是利用免疫化學反應來定位組織細胞中特異大分子的一類技術。Immunocytochemistry免疫組織化學（免疫組化)immunohistochemistry第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.組織細胞中的特異分子均可作為抗原,因而該技術可用來檢測幾乎所有大分子的定位。應用范圍：2.也可用在其他細胞化學技術的顯示反應中。第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日

一、抗原

二、抗體

三、免疫反應的特異性

四、免疫細胞化學反應

五、標記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節免疫細胞化學原理第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日凡能刺激機體產生抗體并能與抗體特異結合的物質稱為抗原。

一、抗原

細胞中具有抗原性的化學成分有：

蛋白質多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白

這些生物大分子都能用免疫細胞化學技術檢測嗎?

從生物學功能來看都包括了哪些物質?第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

酶、受體、抗體、細胞外基質激素、細胞結構蛋白、病原體等它們都可以用免疫細胞化學技術來檢測第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

二、抗體CC*Fab片段：結合抗原決定與抗原結合的特異性（抗體活性）

*Fc片段：結合抗種屬抗體同種型抗原性的抗原決定簇，（“抗原性”活性）

（如:來源于兔的抗體，可被抗兔抗體識別和結合）FcFab2種“結合力”第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日識別一抗的種屬特異性，并能夠因此結合一抗,稱為二抗(抗種屬抗體)。二抗(secondaryantibody)一抗(primaryantibody)

抗原(antigen)

識別特異抗原“一抗、二抗”第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

2類抗體

多克隆抗體—

抗血清，是用提純的抗原免疫動物后從動物血清制備得到的。特點：可自行制備；靈敏度高；特異性？

單克隆抗體—

由單個產生特異抗體的Ｂ淋巴細胞擴增的細胞克隆產生的抗體。特點：特異性高

兼顧靈敏度，特異性第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫反應的特異性表現在：抗原作為一類結構復雜的大分子能刺激機體產生對其特異的抗體并與抗體發生反應

抗體針對某種抗原分子而產生，特異地識別該抗原并與其結合三、免疫反應的特異性

第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

把組織細胞中的特異分子作為抗原,用在顯微鏡下可見的標記物標記特異抗體(或者標記抗原抗體復合物)結合，使免疫化學反應具有可見性,間接地顯示抗原,達到在細胞或細胞器水平定位特異分子的目的。

四、免疫細胞化學反應第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日組織抗原

免疫細胞化學反應原理＋標記抗體標記的抗原抗體復合物免疫反應顯色反應第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

直接法直接標記第一抗體

兩種方法：直接法和間接法

間接法標記第二抗體或復合物第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日直接法與間接法

直接法

組織抗原直接與標記的特異抗體（一抗）反應間接法

組織抗原與未標記的特異抗體（一抗）反應一抗再作為抗原與標記的第二抗體反應★不必對一抗作標記★

標記物多★避免標記造成對抗體與抗原結合的影響

★信號增強第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日五、標記物及其在光鏡和電鏡下的可見性

標記物

使抗體或抗原抗體復合物在各種顯微鏡下可見的物質1.熒光2.酶3.親和物質4.膠體金顆粒第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日

1.免疫熒光技術

2.免疫酶技術

3.免疫親和技術

4.免疫膠體金技術1.熒光2.酶3.親和物質4.膠體金顆粒根據標記物，免疫細胞化學技術可分為：第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術將熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質的定位

（一）免疫熒光技術第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

熒光素：

在激發光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發出較激發光波長更長的可見光（發射光），在顯微鏡下可見，并隨照射停止而消失。

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發光，使受檢標本內的熒光物質發出發射光.（應用熒光染料時都需要知道2個波長：excitationwavelength,emissionwavelength)第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

如:１.異硫氰酸熒光素(

FITC)

ex:490nm,es:520-530綠色

２.四乙基羅達明

ex:570nm,es:595nm明亮的橙色３.四甲基異硫氰酸羅達明ex:550nm,es:620nm橙紅色４.藻紅蛋白(PE)

多種，橙黃-紅色

熒光素

第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日海馬細胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)

黃色？共定位第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日原代培養的小鼠心肌細胞檢測細胞連接及細胞黏附(黏附相關蛋白質-FITC）第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日補充:熒光標記蛋白質技術:

近年大量用于表達重組蛋白的培養細胞，作為外源性蛋白質表達的標記，可用于考察亞細胞定位subcellularlocalization多分子共定位co-localization第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日subcellularlocalization帶標簽的重組蛋白RecombinantproteinRFP-tagGFP-tagco-localizationProtein1.Protein2.mRFP-H2BGFP-B23GFP-SENP3RFP-B23ByYangKai,unpublisheddata第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.雙重或多重標記，同時比較不同分子的位置及量的關系。2.雙重或多重標記，同時染色細胞器和感興趣分子，可顯示分子的亞細胞定位信息。3.根據熒光素的強度，進行半定量分析免疫熒光技術優點：DAPI蛋白1shRNA-蛋白B載體與EGFP融合merge第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日

是將酶作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物得到標記，再通過酶細胞化學反應產生顯微鏡下可見的顯色物質，間接顯示抗原物質的定位.普通光學顯微鏡即可觀察

（二）免疫酶技術第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日酶抗原一抗二抗酶標二抗酶—抗酶抗體復合物抗酶抗體第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日酶標抗體法抗酶抗體法

復合物法酶標記的三種形式：信號的放大一抗二抗抗酶抗體一抗二抗抗酶抗體復合物一抗二抗第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日常用的標記酶：

辣根過氧化物酶

2.堿性磷酸酶外源的酶，與細胞內的內源酶應該有明顯區別.第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

顯示辣根過氧化物酶（HRP)底物為DAB(二氨基聯苯胺)，經一系列氧化聚合反應后形成聚合物，在光鏡下呈棕黃色;DAB經鋨酸固定后能生成具有鋨黑,電鏡下呈現高電子密度.

既適用于光鏡，又適用于電鏡。HRP

H2O2

H2O

nDAB鋨酸

鋨黑（高電子密度）DAB氧化聚合物(棕黃色)

第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

a.底物：萘酚衍生物，捕捉底物：固紅或固藍產物：紅或藍色偶氮色素

AP底物紅或藍偶氮色素固紅或固藍

APBCIP藍紫色色素NBT

b.底物：吲哚酚酯，捕捉底物：四唑鹽，產物：藍紫色

顯示堿性磷酸酶(AP)

第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

（1）過氧化物酶標記抗體法（2）過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）*一抗+組織抗原*二抗+第一抗體+PAP復合物*加入H2O2和DAB

光鏡-棕黃色反應產物(組織抗原的定位)１.辣根過氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）一抗二抗PAP“橋梁”第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日JMJD2B在結腸癌中的表達HRP標記抗體正常組織腫瘤組織靈敏度：高特異性：好2.陽性程度有差異++：%+：%-：%結果判斷3.核質分布有差異核+：%質+：%1.正常/腫瘤有差異FuL,etal.Carcinogenesis,2012,33(9):1664第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

２.堿性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）兩種方法：

(1)堿性磷酸酶標記抗體

(2)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）

第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.反應后標本材料可長期保存2.觀察定位信息時，可觀察感興趣分子在細胞整體中的相對定位，顏色對比清晰3.同時觀察陽性信號和陰性信號。3.能用于電鏡觀察4.可用于原位雜交技術的探測。免疫酶技術優點：與免疫熒光技術對比DAPI蛋白1EGFP/shRNAmerge第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（三）免疫膠體金技術

以電鏡下都可見的膠體金作為抗體或蛋白Ａ的標記物，間接顯示組織細胞中特異分子的技術。

通常在電鏡下觀察膠體金顆粒大小一般在5--60nm

金標抗體或金標A蛋白（二抗）

一抗+抗原第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日1、亞細胞定位（超微結構定位）2、采用不同大小的金顆粒(通常5-20nm)，標記不同抗體或A蛋白，達到雙重甚至多重標記，定位多種抗原的目的

免疫膠體金技術優點：X蛋白定位于核仁第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日親和物質

具有多價能力的物質，與另一種親和物質有高度親和力，又能與抗體、蛋白質及各種標記物(熒光素、酶、膠體金等)結合

最常用的親和物質系統：

1、生物素（biotin）-親和素（avidin）結合能力強，結合不可逆

2、葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG

（四）親和細胞化學技術通常在光鏡下觀察第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

(1)標記親和素－生物素技術

（LabeledStreptoavidinbiotin,LSAB）

(2)橋式親和素－生物素技術（Bridgedavidinbiotin,BAB）

(3)親和素－生物素-酶復合物技術

（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系統標記技術的基本方法第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日生物素化酶生物素化抗體親和素—生物素

—酶復合物生物素親和素第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日

標記鏈球菌親和素-生物素技術

Labeledstreptoavidinbiotin（LSAB)①→③→②→Hsp90在肝細胞中的表達(LSAB法)肝癌組織癌旁組織第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日

親和素－生物素-酶復合物技術（ABC）

親和素-生物素-HRP①一抗③

復合物②二抗生物素化靈敏度：高特異性：好陽性程度有差異++：%+：%-：%結果判斷：抑癌基因產物P16位于垂體腺瘤細胞核第五十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日

葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)

◆是金黃色葡萄球菌細胞壁含有的一種蛋白簡稱為A蛋白或蛋白A

◆

SPA能與人及多種哺乳動物血清中IgG呈非特異性結合又能與標記物結合

經標記的SPA可代替相應標記的二抗2.葡萄球菌A蛋白與IgG系統第五十四頁，共五十八頁，2022年，8月2