俺怎么越看越象乒乒乓乓，不要扔西紅柿～～～-_-b俺們的進山全家福，hohoCOOHNH2每一種離子的分布都滿足Boltzmann分布函數第i種離子densityprofile:(x)i=ie-Zie(x)/kT接近表面處(x=0)：oi=ie-Zieo/kT其中：Zi為第i種離子的離子價(x):

electrostaticpotentialatxo為表面電勢(x=0處的(x))e為電子電荷i為第i種離子的體濃度7.生物膜的離體研究生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質體方法脂單分子層技術Langmuir膜

兼性分子在空氣與水的界面上形成的單分子層。Langmuir-Blodgett(LB)膜

氣/液界面單層膜轉移到固體表面上形成的薄膜(單層或多層)。典型的能形成LB膜的分子：硬脂酸分子(兼性分子)的結構及模型空氣水脂單分子層技術Langmuir膜的鋪展將要鋪展單層膜的兼性分子溶于適當的易揮發性有機溶劑中，滴加在適當的亞相上，待有機溶劑揮發掉以后，在亞相表面就懸浮著一層兼性分子。脂單分子層技術氣液界面上Langmuir膜制備裝置示意圖脂單分子層技術LB膜制備裝置示意圖垂直提拉法制備LB膜將單層膜保持在一定的壓力下，用事先處理好的固體載片沿著垂直方向緩慢地伸入和提拉出亞相，單層膜就會被連續地轉移到固體表面上。疏水襯底提拉(左)妾水襯底提拉(右)水平提拉法制備LB膜

將表面經過疏水化處理的載片水平地放在亞相表面，使單層膜吸附轉移到載片表面。脂單分子層技術表面壓由于氣/液(如水)界面單分子層的存在，使液相的表面張力由0

降低為

，定義表面壓為=0-脂單分子層技術單層膜的-A曲線在等溫條件下改變膜太平的擋片的位置，并記錄的變化。以對分子的平均面積作圖，得到單層膜的曲線(等溫線)。單分子層-A曲線(等溫線)示意圖G:氣相(二維理想氣體狀態方程：A=kT)L-G:氣相-液相共存L:液相(狀態方程：

(A-Ao)=kT)M:凝膠相-液相共存S:固相

由于單分子層除了層內分子間的相互作用外還有層內分子與底部亞相中的液體分子之間的相互作用，這就使得單層膜可能出現一些中間狀態，與這些中間狀態相似的三維空間的相態至今還未發現過。Idealizedisothermsofpressure()versusarea(A)relationshipofphospholipidmonolayersshowingdifferentphasesandcoexistenceregions.Pressure-AreaisothermsofmonolayersofDPPConwateratthetemperaturesindicated.使用單層膜檢測A40的插膜單層膜檢測A40與A28插膜的比較單層膜檢測膽固醇對A40插膜的影響單層膜檢測A40插膜的膜組分依賴性脂單分子層技術表面收集法測量界面蛋白濃度原理圖Wang等人設計了一套真空吸取的辦法(BiophysicalJ.83(2002)985-993)，待熒光標記的蛋白達到插膜平衡之后，將部分單層膜連同粘著的體相溶液收集，然后通過熒光強度的測量確定界面蛋白濃度。

倒置式熒光顯微膜天平的結構原理示意圖

脂單分子層技術熒光顯微鏡膜天平技術觀測脂膜的相分離和運動LB膜在生物學中的應用(1)脂類之間及脂類/蛋白之間相互作用的研究-A曲線，-t曲線，熒光顯微膜太平

(2)配體與受體間的分子識別(3)膜的粘著與融合(4)蛋白質的二維結晶化(5)生物傳感器和生物芯片Two-dimensionalcrystallizationofavidinonbiotinylatedlipidmonolayers生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質體方法固態支撐膜四種不同類型的固體表面支撐膜(A)支撐脂雙層與固體表面間由一層約1nm厚度的超薄水層分隔；(B)支撐雙層的內層與固體表面通過靜電作用或共價鍵直接結合；(C)支撐雙層與固體表面間由一層超薄的軟多聚化合物分隔；(D)在固體表面先藕聯上超薄的多聚物層（如dextran），然后再通過共價藕聯將蛋白與多聚物結合在一起形成蛋白支撐膜。

制備支撐雙水分子層的3種方法(1993)a)LB技術b)SUV在親水襯底上融合c)SUV在疏水脂單層表面融合固態支撐膜固態支撐膜固體襯底表面生物功能化的方法如果要固定多聚物，如Dextran，可以先在表面上沉積一層帶有功能頭基（如環氧基，氨基，腈基）的長鏈表面活性劑單層膜和乙醇，乙醇的目的是使表面親水化，以防非特異性的蛋白吸附。通過活化的酯（如琥珀酰胺），將其結合到脂質或聚合物鏈上，而蛋白上則化合上氨基，氨基與活化脂間結合將蛋白固定。這種方法很適合固定抗原表位或Fab片斷。在鎳或銅離子存在的情況下，NTA(Nitrilotriaceticacid)與寡聚組氨酸可以形成穩定的鰲合物。利用此原理，制備鰲合脂質NTA-lipid，在二價離子（如Ni2+,Cu2+）存在時鰲合脂質與含有寡聚Histine的蛋白能結合。

全內反射熒光技術Schematicillustrationofcontrolledassemblyofbiotin-lipidcontainingmonolayer/avidin/biotin-ssDNAcomplexonsolidsupport(a)andtherelatedSPRspectra(b).Supportedmembranesas“phantomcells”Incorporationofchargedlipids,gangliosides,andreceptorsintosupportedbilayersallowcontrolofelectrostatic,polymer-induced,andlock-keyforces(Science271(1996)43-48)

RICMvisualizationofaDMPCvesiclecontaining1mol%biotin-labeledlipidasthereceptorinteractingwithasurfacecoveredbystreptavidin.Theformationofadhesionplaquesiscausedbyinterplayofthestrongattractionbetweenreceptorsandtherepulsiveundulationforces.生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質體方法為什么叫“黑脂膜”？顯微觀察磷脂成膜情況Schematicrepresentationoftheexperimentalset-upfortheformationofBLMbypaintingafilmoflipidonaholeonTefloncup.測量參數：電阻電容制備BLM的脂溶液

為了要模擬生物膜的脂組分，故BLM是從需要模擬的組織器官提取磷脂或鞘脂的。用得較多的有從腦組織提取的脂，葉綠粒抽提物，膽固醇，氧化膽固醇以及純的PC，PE，PS等。

BLM制備液一般應將高度純化的磷脂溶于碳氫溶劑，例如癸烷，辛烷，苯，氯仿或乙醇等。有時也用鯊烯作溶劑，因為鯊烯會在BLM形成過程中被排擠出來，使BLM成為無溶劑的BLM。這種BLM更接近自然生物膜的基架。一般情況下溶劑碳氫鏈在C6一CI16間較適宜，它們在室溫時都是液態，極少溶于水。BLM制備液中如含有雜質就不易鋪制出BLM。

對稱BLM的鋪制

實驗槽中間以聚四氯乙烯作為隔板（BLM支持物），隔板中間開一小圓孔，面積一般不要超過0.25平方厘米。

槽內放上適當的緩沖溶液，把小孔浸沒。然后把一滴BLM制備液加到隔板的小孔下方（用毛刷或微量注射器）。由于聚四氯乙烯具有良好的親脂疏水性，故脂較容易附在小孔四周，并擴展過整個小孔，隨后脂滴的中間部分慢慢變薄，最后成為雙分子層，而沿著小孔四周則積有較厚的脂層，成為一個圈，它對BLM起支持作用，這一圈稱P－G邊界（Plateau－Gibbsborder）。脂滴在小孔中形成雙分子層脂膜是一個自發的漸變過程。通過光學或電學的方法可以驗證雙分子層是否已經形成。

毛刷法鋪制對稱BLM

TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonahydrophobicpartitionbyraisingtheleveloftheaqueousphaseonwhichamonolayerhasbeenformed.

不對稱BLM的制備(1)由單層合成雙層的BLM鋪制法隔板固定而使兩側溶液液面移動的方法：使兩個可以同步推進的注射器與聚四氟乙烯隔板兩側的溶液連通并使左右液面保持在同一水平上。同步推進注射器，使兩側液面升至小孔下方2－3毫米處。在兩側溶液面上分別滴加BLM制備液，BLM制備液在液面擴展為單分子層，此時再使二注射器同步推進，使二側面上升經小孔而達小孔上方2－3毫米處方才停止。當二側脂單層上升經過小孔時，合而形成脂雙層。如果脂溶劑是易揮發的，這樣形成的BLM還能做到不含脂溶劑。另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移動，但仍能保證左右兩側之間有良好的絕緣性。鋪制時先將隔板向上提起，使小孔上升至液面之上，將BLM制備液分別滴在左右兩側的水面上．脂即在水面上擴展為脂單分子層。如果在兩側水面上鋪展不同的脂，則兩邊的單分子層就不對稱。然后將隔板向下移，當隔板的小孔移到液面下時，很自然地在小孔上就形成了雙分子脂層。鋪成的BLM并不是靜止不動的，雙層的脂分子是流動的，兩側不同的脂分子在P－G邊界中會混合在一起，而P－G邊界中的脂分子是會同雙分子層中的脂分子通過流動而進行交換的，最后在BLM中的脂也就不可能保持不對稱了。但是這種方法可以確保BLM兩側溶液不會混合，因而可以進行膜兩側溶液不對稱時的各種研究。TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonthetipofamicropipettebyfirstremovingthetipfromtheaqueousphaseonwhichamonolayerispresent,andthenreinsertingthetipthroughthemonolayer.不對稱BLM的制備(2)

在濾紙的微孔中形成BLM

在顯微鏡下觀察濾紙，可以看到上面有許多微孔。有人把濾紙先用脂浸泡，然后取出晾干，這樣濾紙就具有親脂疏水特性。用這種脂處理過的濾紙放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯隔板（當然要有特別設計的夾具，把濾紙夾在左右二室之間）。然后用前面介紹的方法鋪制BLM，實踐證明在濾紙的許多小孔上都形成了BLM，只是每個BLM的面積小，但是許多小面積的BLM加起來就比單個“大”孔上鋪成的BLM還大。生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質體方法Temperatureinducedshapechangesofvesicles(1990).

(a)Transitionofavesiclefromabiconcaveshape(center)toaninvaginated(stomatocyte)shape(leftside)atdecreasingtemperatureandtoabuddedshape(rightside)atincreasingtemperature.Shapesofvesicles(orcells)onthebasisofthebilayercouplinghypothesismodel(1983):Thedifferentcellshapescanbeexplainedintermsoftwoparameters:1)thereducedvolumev=v/vs:theratiooftheactualvolumeofthecelltothatofasphere,2)therelativeareadifference=(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s)

whereA0andAiaretheareasoftheouterandinnerleafletofthemembraneandwhereA0,sandAi,sarethecorrespondingvaluesofthesphere.Shapetransformationofgiantvesicletriggeredbytemperaturechanges.Thetransitionsarecompletelyreversible!

Phasecontrastmicrographsofshapechangeofcompositeshell(1998).

DMPCvesiclecontaining2Mofactin(imageaandb)and7M(imagecandd)ofactin.脂質體的類型：SUV：小單片層脂質體(smallunilaminar-)MLV：多片層脂質體(multilayer-)LUV:大單片層脂質體(largeunilaminar-)

脂質體是由脂質雙分子層組成的內部為水相的閉合囊泡。SUV(小單層囊泡)的制備(1)：

方法一：將磷脂用氯仿溶解，通氮氣干燥，用真空泵或旋轉蒸發器驅除殘留溶劑。加入所需的水相，使脂質濃度在mM范圍。之后，懸浮液在探頭式或水浴式超聲儀中超聲至透明（溫度視脂質而異，保持在相變溫度以上，但過高溫度時脂質易氧化）。用探頭式時僅帶幾分鐘，用水浴式則右時長達2小時。雖然用水浴式費時長，但此時超聲可在充氮氣的密閉容器中進行。用負染電鏡術，可檢驗囊泡的大小，其直徑下限可達20nm。實用中往往要加入膽固醇成分，此時直徑至少50nm。SUV(小單層囊泡)的制備(2):

第二種方法是將脂質的乙醇溶液快速注入到緩沖液中，隨即自發地形成SUV。脂質的最終濃度為3—30mM。所形成的囊泡直徑范圍為30-110nm，與脂質的濃度有關。這一方法的優點是避免了超聲的損傷．且快速、簡單及溫和，但脂質體的濃度相當稀，需要進一步濃縮，另一個缺點是高濃度的乙醇必須由隨后的純化階段去除。SUV(小單層囊泡)的制備(3):

方法三：將MLV的懸浮液以20，000磅／英寸的壓力，4℃時通過French濾器擠排。四次擠排后，94％囊泡的大小范圍為31.5－52.5納米。該法所得囊泡較超聲法的略大，能適用于各種脂質。此外，操作簡單、重復性好，亦無超聲損傷。MLV(多層囊泡)的制備(1)：

根據Bangham的方法:

在100毫升圓底燒瓶中，用氯仿溶解10毫克含5摩爾％PA的eggPC，通氮氣去除氯仿，在燒瓶壁形成磷脂薄膜。將燒瓶置于真空中，過夜（或數小時）除去剩留的溶劑。然后加入所需的水溶液5毫升，脂質水化數小時（相變溫度之上）。然后用旋渦混合器振搖，即得MLV的懸浮液。

MLV中各片層之間的間隔取決于VanderWaais吸引力和水化、靜電的排斥力之間的平衡。生理鹽濃度條件下，PC組成的MLV中各片層之間的間距約2.8納米。脂質帶負電時，間距增加（特別是在低離子強度時）。制備中加酸性磷脂(如PA)的道理就在于此。

MLV適于包囊各種物質，也適于各種脂膜。其制備法是所有脂質體制備中最簡單的。缺點是大小分布很不均勻，包裹效率也不高。MLV(多層囊泡)的制備(2)：多層囊泡的脫水形成（脫水一再水化循環法)

0.1微摩爾磷脂用超聲分散于1毫升水中。將待包裹的物質加入，通干燥的氮氣將水分蒸發。在干燥的過程中，SUV被濃縮，彼此融合形成多片層的平板，因而將待包裹的物質夾在諸片層之間。干燥畢，把濕棉花塞入試管或通以含水汽的氮氣流幾小時以使脂質再水化。此時，多片層膨潤，形成大的囊泡。從而俘獲大部分的溶質。然后加入水，將混合物輕輕振蕩以分散脂質囊泡。若再通過聚碳酸酯濾膜，則可分選大小。該方法的最大優點是包裹效率極高，對DNA分子能達50％（10毫克脂質包裹1毫克DNA)，也能有效地包裹蛋白質。制備過程中酶的活性仍保持近90％。此外，適用于幾乎所有的磷脂。但該法易受水相中無機離子的影響，此外不太適用于包裹較小的分子。LUV(大單層囊泡)的制備(1):注入法將非極性溶劑中的脂質溶液在使溶劑能揮發的條件下注入到水溶液中，溶液中脂質即以薄膜的形式殘留在氣泡和液相的界面上。可以計算出，薄膜的組成僅是幾個脂雙層。當氣泡通過水相上升時，片層分散后形成單片層的脂質體。最后用聚碳酸酯濾膜分選大小。具體方法：4毫升戊烷或乙醚的脂質溶液（1－2毫摩爾脂質）緩慢地注入到4毫升、60℃的水相中（0.2毫升／分）。水相中緩慢地通氮氣泡以促使溶液混勻，同時給空氣一溶液的界面上提供惰性環境、增加氣泡的大小，從而有利于單片層囊泡的形成。注入完全后，將脂質體懸浮液通過聚碳酸酯濾膜以分選大小、去除凝聚體。然后，再用凝膠柱過濾（例如Sephadex。G－25或G－50，BiogelP－10）進一步去除殘留的溶劑。注入法的好處是適用于各種脂質，而且在1小時內即可完成。主要的限制是最終的制劑相當稀（1一15毫摩爾），因而包裹效率低。該法能得直徑為150－250納米的LUV。LUV(大單層囊泡)的制備(2):反相蒸發法（REV）

Szoka等設計了另一種制備LUV的方法。該方法中，水一非極性溶劑混合液中的脂質分子形成內翻型微團，此時脂質的尾部插入非極性相，而頭部基團包圍水滴。當非極性溶劑在真空中蒸發后，微團彼此結合，形成大的單片層的囊泡。典型制備時，66微克分子（50毫克）脂質溶于3毫升乙醚，加入1毫升水相（PBS等緩沖液及待包物質），通氮氣下水溶式超聲2－5分，直至混合物變為清沏的一相懸浮液或均勻的乳白色液（超聲后30分內水和油相不分離）。然后，移至旋轉蒸器中，用水泵抽氣驅除乙醚。當大部分溶劑除去后，懸浮液呈凝膠狀，經2－3次旋渦振蕩后再繼續減壓蒸發，直至得到均一的懸浮液．最后進過孔直徑0.2微米的聚碳酸脂濾膜，即能得到大小校均勻的LUV。也可用透析或上Sepharose4B柱或離心等方法除去未包裹的物質及殘留的有機溶劑。

REV法的優點是：1.水相的包裹容積大（水相離子強度低時，如0.01摩爾NaCI，能達65％）；2.能包裹大的生物高分子，如鐵蛋白、25SRNA；3.制備過程中不受水溶性蛋白質存在的影響，也不受磷脂種類的影響；4.水相容積從02毫升至10毫升都可以處理。主要的缺點是待包物質暴露于有機溶劑中，且要經短時間超聲，這樣可能導致某些蛋白質的變性或DNA斷裂。LUV(大單層囊泡)的制備(3):去垢劑稀釋法將過量去垢劑(超過CMC)加入到膜懸浮液中直到因形成去垢劑-脂質-蛋白質的混合微團而變得澄清為止。此后緩慢降低去垢劑的濃度(如透析)，致使脂質與膜蛋白形成囊泡狀膜結構，這樣就能達到重組蛋白的作用。去垢劑如膽酸鹽、TritonX－100等用于脂質體重組已取得很大成功。

現列舉典型的去垢劑一LUV法：eggPC和脫氧膽酸鹽混合成1毫升溶液（20微克分子脂質：10微克分子去垢劑）。水浴超聲數分，最初的渾濁懸浮液即變為透明狀（因混合微團的形成）。然后用凝膠過濾除去脫氧膽酸鹽。囊泡的直徑約100納米，可認為是小的LUV。俘獲容積為2－3升／摩爾。用該法已成功地包裹了細胞色素C和葡萄糖等。

去垢劑稀釋法已廣泛地應用于膜蛋白脂質體的重組。方法學上的限制是，透析時需幾小時甚至幾天才能完成；此外，如果被包裹的溶質能夠通過透析膜，則包裹效率就非常低。LUV(大單層囊泡)的制備(4):SUV融合法1.鈣促融合法Panahadjonoulos等將負電荷磷脂的SUV和Ca2＋混和，再用EDTA螯合Ca2＋。當Ca2＋與含PS的SUV相互作用時，囊泡首先凝聚形成沉淀，融合形成多片層結構。而后用EDTA去除Ca2＋時，該片層結構膨脹，形成大的單層囊泡。典型實驗中，1－10毫摩爾不飽和PS用以制備SUV。加入足量的CaCI2，使Ca2＋／脂質之比為1：2。此時SUV沉淀。然后，加入稍過量的EDTA，攪拌直至沉淀物形成LUV的透明懸浮液。這樣所形成的囊泡，能夠在相當溫和的條件下包裹諸如病毒、核酸及鐵蛋白等結構。俘獲容積約7升／摩爾，20毫摩爾脂質懸浮液中包裹效率約10－15％。2.冰凍一融化一超聲法第二種融合方法是冰凍一融化一超聲的方法。典型步驟是，30毫克脂質在1毫升緩沖液中超聲形成SUV。然后加進待包物質。混合物在液氮中冰凍，然后再融化。冰凍一融化過程可根據情況一次或兩次。再在水浴中超聲30秒（超聲目的主要是用以分散聚集體）。最終所形成的囊泡對離子不易通透，俘獲容積約8升/摩爾。該方法的優點是簡單且溫和，且可用于膜蛋白重組。然而，在有蔗糖、高濃度離子或有二價陽離子存在時效果不好。Threemethodsforreconstitution.(1)Lipidandproteinssolubilizedindetergentsaremixedandthenthedetergentisremovedbydialysis,dilution,orgelfiltration.(2)Delipidatedproteinscansometimesbespontaneouslyincorporatedintoapreformedbilayer.(3)Partiallydelipidatedproteinswithasmallamountofdetergentssometimesformdiscsthatcanfusewithpreformedvesicles(膽酸鹽法).重組脂質體right-side-outvesicles:0.5MNa2PO4and0.1MMg+.inside-outvesicles:0.5MNa2PO4.redbloodcell紅細胞膜制備脂質體生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質體方法去污劑與膜的分離

對于生物膜結構與功能的研究，通常需要將膜解聚成各種組分。抽提分析膜脂，一般使用有機溶劑。對于膜蛋白，有機溶劑也是可以使用的，但是許多蛋白在有機溶劑中容易變性，沉淀。因此，要針對不同類型的膜蛋白選擇不同的提取方法。溶解膜蛋白可以采用：螯合劑，改變離子強度和pH值，蛋白的變性劑（如脲、胍等），酶解等方法，但對于膜內在蛋白，上述方法分離效果都不好，只能采用去污劑抽提的方法。Methodsforsolubilizationofmembraneproteins.Stepsusuallyinvolvedaresaltwash(whichremoveselectrostaticallyboundproteins)followedbysonicationordetergenttreatment,orsolubilizationinanorganicsolvent.用去污劑溶解膜內在蛋白

搞清去垢劑溶解膜磷脂和膜蛋白的先后次序

Klingenberg實驗室利用CAT(抑制劑)飽和的線粒體膜研究去垢劑對這種線粒體膜的作用機理。結果發現，去垢劑與蛋白的比例為1:1時，當膜上的磷脂約有50％被溶解后，才開始觀察到CAT－蛋白復合體被溶解。因此，去垢劑對這種線粒體膜的作用，首先是磷脂被溶解，然后才是蛋白被溶解。由此可以設想，去垢劑單體分子首先“攻擊”磷脂的雙分子層，使脂的雙分子層變成松散，然后才作用于CAT－蛋白復合體上。Detergent的單體與團粒在溶液中處于動態平衡狀態。由于單體分子不斷深入到磷脂雙層中，使團粒不斷解離成單體。當愈來愈多的去垢劑分子深入到脂雙層而形成復合的磷脂－去垢劑團粒時，蛋白分子被包圍，最后被溶解下來。需要了解去污劑的性質及其作用機理

純化鑒定膜蛋白，使用去污劑是必須的。在使用去污劑溶解的過程中，膜被破壞，蛋白與脂雙層以及細胞骨架之間的作用被去除，取而代之的是蛋白與去污劑之間的作用。蛋白被去污劑溶解后，膜蛋白就如同水溶性蛋白一樣可被進一