阿霉素誘導鼻咽癌細胞凋亡的作用機制,藥學論文阿霉素〔adriamycin,ADM〕為蒽環類抗生素，抗瘤譜較廣，療效高，是臨床常用的抗腫瘤藥物。除白血病外，其對膀胱癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤以及侵蝕性淋巴瘤等都有療效[1].阿霉素抗腫瘤作用機制包括誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞周期以及使腫瘤細胞發生自噬等[2].文獻報道，阿霉素可能通過影響Bcl-2/Bax[3]、JNK凋亡通路[3]、p53凋亡通路[4]以及激活腺苷酸活化蛋白激酶〔AMPK〕[5]等誘導細胞凋亡，但其確切機制仍未特別明了。細胞凋亡早期出現的細胞容積減小稱為凋亡性細胞皺縮〔apoptoticvolumedecrease,AVD〕,是具有普遍性意義的細胞凋亡早期的標志性事件。我們實驗室前期研究表示清楚，氯通道介入過氧化氫誘導的腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹參酮[8]誘導的低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞的凋亡。這些結果提示多種抗腫瘤藥物都可能通過激活氯通道引起AVD,繼而誘導細胞發生凋亡，進而發揮其抗癌作用。本研究旨在討論阿霉素能否通過激活細胞氯通道而誘導凋亡性細胞皺縮，從離子通道的角度來討論阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡的作用機制。1材料與方式方法1.1細胞培養用含10%小牛血清、雙抗〔1105UL-1青霉素與100mgL-1鏈霉素〕的RPMI1640生長液，在37C恒溫培養箱〔5%CO2、飽和濕度〕內常規培養低分化鼻咽癌細胞〔CNE-2Z〕,每兩天傳代1次。實驗前取對數生長期的CNE-2Z細胞，用0.25%胰酶進行消化傳代，收集、重懸細胞，將細胞懸液接種于直徑22mm的圓形玻片上，置入培養箱使細胞貼壁，待細胞貼壁1h后進行實驗。1.2主要試劑與藥品鹽酸阿霉素固體粉末購于上海生工生物有限公司，用二甲基亞砜〔DMSO〕溶解，配制成濃度為2.5mmolL-1的儲存液，儲存在4℃冰箱中，使用前稀釋至終濃度。氯通道阻斷劑5-nitro-2-〔3-phenylpropylamino〕-benzoate〔NPPB〕購自Sigma公司，溶于dimethylsulfoxide〔DMSO〕中，配成100mmolL-1的儲存液，工作濃度為100molL-1.等滲灌流液組成〔mmolL-1〕:10HEPES,0.5MgCl2,70NaCl,140D-mannitol,2CaCl2,用冰點浸透壓計〔Osmomat030,Gono2tec〕調節溶液浸透壓至300mOsmolL-1,用Tris-base調節pH至7.4.1.3細胞容積測量將貼有細胞的玻片置于灌流槽內，在倒置相差顯微鏡〔IX71,Olympus,日本〕下選擇固定視野，用圖像分析軟件〔Image-ProPlus6.3,MediaCybernetics,USA〕控制數字式攝像機〔RETIGA4000R,QImaging,Canada〕,進行連續拍攝，每2min拍攝一幅，直至2h.拍攝的圖片用ScionImage圖像分析軟件〔ScionCorporation〕處理，測量細胞直徑與面積，用下面公式計算細胞容積〔V〕:V=4/3〔直徑/2〕3,并標準化細胞容積〔Vst〕:Vst=〔Vt/Vo〕100%〔Vt:細胞的實際容積，Vo:藥物刺激前即等滲條件下〔對照〕的細胞平均容積〕.實驗分為空白對照組〔Iso〕、阿霉素組〔ADM,2.5molL-1〕、氯通道阻斷劑NPPB組〔100molL-1〕、阿霉素〔2.5molL-1〕+NPPB〔100molL-1〕組。實驗環境溫度為室溫〔20℃~24℃〕.1.4流式細胞術檢測細胞凋亡細胞種植于6孔板中，培養箱中培養12h,按上述實驗分組進行處理。36h后，收集細胞，用PBS沖洗，并用預冷的70%乙醇于-20℃固定30min.PBS清洗并離心，參加propidiumiodide〔PI,50mgL-1〕,室溫避光染色15min.用流式細胞儀〔CoulterEPTCSXL-31240,Coulter,USA〕進行分析。1.5膜片鉗全細胞記錄技術EPC-7膜片鉗放大器〔ListElectronic,Germany〕用于記錄全細胞電流，CED1401〔Cambridge,UK〕用于數字化〔采樣頻率3kHz〕電流和電壓信號。拉制的電極是硼硅酸鹽毛細玻璃管，其內徑為0.86mm,外直徑為1.5mm,內含細長絲，于垂直微電極拉制器〔PB-7〕上，分兩步拉制。將電極內液充灌至電極容積的1/3至2/3間，此時阻抗約為〔5-10〕M。全細胞記錄形式構建完成后，開場記錄實驗數據。將細胞鉗制在氯離子的平衡電位〔0mV〕.按指令電壓的順序〔40,0和80mV〕循環記錄氯電流變化。每一電位持續時間約200ms,兩電位之間間隔4s.構成全細胞記錄后，補償電容。灌流等滲液3min后，參加阿霉素，連續觀察氯電流變化，待阿霉素激活氯電流達峰值，并平衡5min后，灌流含氯通道阻斷劑與阿霉素的等滲液，觀察氯電流變化，直至電流抑制到最小值，并平穩3min以上。實驗數據用EPC〔CED,Cambridge,UK〕軟件分析。實驗環境溫度為室溫〔20℃~24℃〕.全細胞膜片鉗記錄所需電極內液組成〔mmolL-1〕:1EGTA[乙二醇-雙-〔2-氨基乙醚〕四乙酸],1.2MgCl2,70N-methyl-D-glucaminechloride〔NMDG-Cl〕,10HEPES,140D-mannitol和2ATP,并用Tris-base調節pH至7.25.1.6統計學處理采用SPSS12.0軟件對實驗數據進行統計與分析，數據用珋xs表示，采用方差分析〔ANOVA〕檢驗差異的顯著性。2結果2.1氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡用流式細胞儀檢測阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡率。實驗結果顯示，不加任何藥物處理的空白對照組細胞，其凋亡率為〔1.742.34〕%〔n=3〕〔Fig1A〕,而用2.5molL-1的阿霉素處理36h的細胞，凋亡率增加至〔23.563.45〕%〔n=3,P0.01,vscontrol〕〔Fig1C〕.為了討論氯通道在阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑NPPB對阿霉素誘導的凋亡的影響。結果顯示，單純用NPPB〔100molL-1〕處理的細胞，凋亡率為〔1.581.35〕%,與空白對照組相比，差異沒有顯著性〔n=3,P0.05,vscontrol〕〔Fig1B〕.NPPB〔100molL-1〕與阿霉素〔2.5molL-1〕共同處理細胞，CNE-2Z細胞凋亡率為〔13.292.78〕%,與阿霉素組凋亡率〔23.563.45〕%相比，差異有顯著性〔n=3,P0.01〕〔Fig1D〕.2.2氯通道阻斷劑抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞凋亡性容積減小細胞圖像分析結果顯示，等滲液灌流細胞2h,細胞容積及形態基本保持不變〔Fig2A〕.而用含2.5molL-1阿霉素的等滲液灌流細胞10min內，便可觀察到CNE-2Z細胞的凋亡性容積減小的發生，在連續觀察120min的經過中，發現細胞體積逐步減小，皺縮〔Fig2B〕.而阿霉素和NPPB聯合作用120min時的細胞體積并沒有減小〔Fig2C〕.Fig2D顯示了藥物作用前后120min細胞容積變化百分率，阿霉素灌流120min時細胞體積減小至〔90.360.42〕%〔n=21,P0.01〕,阿霉素和NPPB聯合作用組細胞體積為〔102.830.44〕%〔n=27〕,與阿霉素組相比，差異有顯著性〔P0.01〕.單純用NPPB灌流細胞，細胞體積有所增大，120min時為〔104.050.65〕%〔n=14〕.實驗結果表示清楚，氯通道阻斷劑NPPB能夠明顯抑制阿霉素誘導的鼻咽癌細胞容積減小，提示阿霉素可能通過激活氯通道而誘導鼻咽癌細胞凋亡，早期發生的凋亡性容積減小。2.3阿霉素激活的CNE-2Z細胞氯電流為了進一步驗證阿霉素能否通過激活細胞氯通道而誘導細胞凋亡性容積減小，我們用全細胞膜片鉗技術記錄了阿霉素激活的CNE-2Z細胞氯電流。Fig3A所示為阿霉素誘導的鼻咽癌細胞氯電流全程圖。在等滲條件下，可記錄到一個微弱且穩定的背景氯電流〔Fig3A、B〕.胞外灌流阿霉素，能夠明顯激活氯電流，該電流具有外向優勢，外向電流明顯大于內向電流，且未見明顯時間依靠性失活〔Fig3A、C〕.該電流的翻轉電位為〔-3.000.84〕mV〔n=8〕,接近氯離子平衡電位。當鉗制電壓為80mV時，該電流的平均峰值高達〔-31.672.38〕pA/pF〔-80mV〕、〔49.413.23〕pA/pF〔+80mV〕〔n=6,P0.01,vsIso〕〔Fig3E〕.在阿霉素激活氯電流且達平穩的基礎上，參加氯通道阻斷劑NPPB〔100molL-1〕,氯電流迅速降低〔Fig3A、D〕.其對外向電流的抑制率為〔79.966.57〕%〔+80mV〕,對內向電流抑制率為〔76.644.66〕%〔-80mV〕〔n=5,P0.01,vsADM〕〔Fig3E〕,對內外向電流間的抑制作用差異無統計學意義。以上實驗結果提示，氯通道在阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡早期的經過中起重要作用。在所有實驗中，用來配制NPPB的DMSO在灌流液中的終濃度低于1%〔V/V〕,其對阿霉素誘導的細胞容積減小及激活的氯電流沒有影響，且24h內無細胞毒性。3討論細胞凋亡異常在腫瘤以及很多疾病的發生發展中起著重要的作用。細胞凋亡發生于生理以及病理狀態下對不同刺激的應答經過中，具有一系列生化和形態學特征，其伴隨著細胞進行性的體積縮小，以及線粒體細胞色素C釋放、caspase激活、核固縮、DNA片段化和凋亡小體的構成[9]等。華而不實早期細胞皺縮或凋亡性容積減小〔AVD〕是在等滲狀態下發生的細胞體積縮小，具有普遍的意義。研究表示清楚[10],AVD發生于細胞色素C釋放、caspase活化以及DNA斷裂之前，是細胞凋亡早期的標志性事件。鑒于AVD在細胞凋亡早期觸發機制中的關鍵性作用，深切進入討論AVD的發生、發展經過及其機制，對于揭示凋亡規律有重要意義。AVD的發生被以為與細胞內K+與Cl-濃度減小有關[11].在凋亡早期，凋亡誘導劑激活鉀通道與氯通道，促使K+與Cl-外流，并驅動水的外流，致使細胞體積減小發生AVD,進而誘發凋亡[6,12].氯通道介入細胞的多種生理功能，如細胞增殖[13]、遷移[14]、凋亡[6]、細胞溶血[15],還可介入冰片引起的細胞體積減小經過[16].我們前文報道，中藥丹參酮發揮抗腫瘤作用的機制可能是通過激活氯通道引起氯離子和水外流，誘導AVD發生，進而引起細胞凋亡[8].阿霉素作為一種常用的抗腫瘤藥物，它能否可以能通過激活氯通道誘導AVD和細胞凋亡？當前國內外沒有相關報道。本實驗采用活細胞影像系統實時拍攝細胞圖像，分析細胞凋亡早期的細胞容積變化。實驗結果表示清楚，在阿霉素作用的10min內，便可觀察到CNE-2Z細胞凋亡性容積減小的發生；而在阿霉素繼續作用的2h內，細胞容積持續減小。流式細胞術檢測到阿霉素誘導CNE-2Z細胞凋亡，氯通道阻斷劑NPPB能夠完全阻抑CNE-2Z細胞凋亡性容積減小、明顯阻抑細胞凋亡，提示阿霉素能夠激活CNE-2Z細胞氯通道，進而誘導細胞發生AVD和細胞凋亡。為了進一步驗證這個觀點，我們用膜片鉗法記錄CNE-2Z細胞阿霉素激活的全細胞電流，直接觀察阿霉素對氯通道的激活作用。結果顯示，細胞外灌流阿霉素可激活一個外向電流，該電流與氯離子跨細胞流動所產生的電流一致，其翻轉電位接近氯離子的平衡電位-0.9mV〔根據本實驗所用細胞外灌流液及電極內液配方計算而得〕,該電流可被氯通道阻斷劑NPPB抑制，由此推知該電流為氯通道所介導的氯電流。本實驗結果為