第五章環境化學物的特殊毒性及其評價第五章環境化學物的特殊毒性及其評價第一節環境化學物的致突變性及其評價

第一節環境化學物的致突變性及其評價

一、概述物種的各個體和各代之間的種種變化稱為變異。可遺傳變異即稱為突變（mutation）。有自發的和誘發的。相當多的外來化學物能直接損傷DNA或產生其他遺傳學改變而使基因和染色體發生改變——遺傳毒物或致突變物或誘變劑。一、概述二、突變的類型突變的基礎是遺傳物質的DNA改變，根據DNA改變牽涉的范圍大小，可以將遺傳損傷分為三類：基因突變、染色體突變和基因組突變。二、突變的類型（一）基因突變指在基因序列中DNA序列的改變，也叫點突變。1、堿基置換

堿基置換指DNA序列上的某個堿基被其他堿基取代。首先在DNA復制時會使互補鏈的相應位點配上一個錯誤的堿基，即發生錯誤配對。這一錯誤配上的堿基在下一次DNA復制時卻能按正常規律配對，于是一對錯誤的堿基置換了原來的堿基對，亦即最終產生堿基對置換或簡稱堿基置換。轉換（transition）：嘌呤與嘌呤堿基之間的置換，或嘧啶與嘧啶之間的置換。顛換（transversion）：嘌呤與嘧啶堿基之間的置換。

（一）基因突變1、堿基置換轉換（transition）第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件2、移碼

移碼是從mRNA到蛋白質翻譯過程中遺傳密碼子讀碼順序的突變，通常是基因中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數的堿基對所造成的突變。2、移碼3、整碼突變

指在DNA中增加或減少的堿基對為一個或幾個密碼子。4、片斷突變

指基因中某些小片斷核苷酸序列發生改變。這種損傷有時可跨越兩個或數個基因。片斷突變包括缺失、重復、重組、重排。3、整碼突變4、片斷突變（二）染色體突變

也稱染色體畸變，是染色體或染色體單體受損而發生斷裂，且斷端不發生重接或雖重接卻不在原處。能使染色體或染色單體發生斷裂的物質稱為斷裂劑，這種作用的發生及其過程稱為斷裂作用。斷裂作用的關鍵是誘發DNA鏈斷裂。（二）染色體突變也稱染色體畸變，是染色體或染色體單體受損而發（1）裂隙（gap）在染色體上出現無染色質的區域，但該區域兩端的染色體仍保持線狀連接者為裂隙。一般認為裂隙屬于非染色質損傷。裂隙不計入畸變范圍。（2）斷裂（break）

指染色體上狹窄的非染色帶,無線狀連接者為斷裂。（1）裂隙（gap）（2）斷裂（break）（3）斷片（fragment）和缺失（deletion）一個染色體發生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節段遠遠分開，常將無著絲粒斷片簡稱為斷片。有著絲粒的部分稱為缺失，缺失有末端缺失和中間缺失。（3）斷片（fragment）和缺失（deletion）（4）

微小體（minutebody）中間缺失如斷片很小，小于染色單體寬度，呈圓點狀，稱為微小體。（5）無著絲粒環（acentricring）一條較長的無著絲粒斷片的兩端連接，就形成無著絲粒環。（4）微小體（minutebody）（5）無著絲粒環（a（6）環狀染色體（ringchromosome）染色體兩臂各發生一次斷裂，其帶有著絲粒的節段的兩斷端連接形成一個環時，稱為環狀染色體。（7）雙著絲粒染色體（dicentricchromosome）兩條染色體斷裂后，兩個有著絲粒的節段重接形成。（6）環狀染色體（ringchromosome）（7）雙著（8）倒位（inversion）當某一染色體發生兩次斷裂后，其中間節段倒轉180再重接，稱為倒位。臂間倒位：顛倒的是具有中間著絲粒的中間節段臂內倒位：顛倒的是長臂或短臂內的一段（8）倒位（inversion）（9）易位（translocation）兩個非同源染色體斷裂后，從某個染色體斷下的節段接到另一染色體上稱為易位。兩條染色體同時斷裂，相互交換斷片并重接——相互易位僅一個染色體節段連接到另一染色體上——單方易位；三個或三個以上染色體斷裂、重接——復雜易位（9）易位（translocation）（10）插入（insertion）和重復（duplication）當一個染色體發生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來，稱為插入。如此時有缺失的染色體和有插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發生于同一位點，則插入將使該染色體連續出現兩段完全相同的節段，此時稱為重復。（10）插入（insertion）和重復（duplicati（11）輻射體染色體間的不平衡易位可形成三條臂構型或四條臂構型，分別稱為三輻射體和四輻射體。在多個染色體間的單體互換可形成復合射體。（11）輻射體（三）基因組突變指基因組中染色體數目的改變，也稱染色體數目畸變。（三）基因組突變1、非整倍體指細胞丟失或增加一條或多條染色體。缺失一條染色體稱為單體，增加一條染色體稱為三體。2、整倍體指染色體數目的異常是以染色體組為單位的增減，如三倍體、四倍體。1、非整倍體缺失一條染色體稱為單體，2、整倍體三、致突變作用機理外源化學物引起基因突變和染色體突變的靶部位主要是DNA，而導致染色體數目異常的靶部位主要是有絲分裂和減數分裂器，如紡錘絲。（一）DNA損傷和突變1、堿基類似物的取代有些化學物的結構與堿基非常相似，稱堿基類似物。它們能可與天然堿基競爭，并取代其位置，而摻入到DNA分子中，引起劍姬配對特性的改變，引發突變。三、致突變作用機理（一）DNA損傷和突變2、與DNA分子共價結合形成加合物

許多親電子性化學物可與DNA作用形成加合物（adduction）。不同誘變劑與DNA作用的堿基位置不同，可引起不同類型的突變。烷化劑可提供甲基或乙基等烷基，與DNA發生共價結合。對DNA和蛋白質都有強烈烷化作用。各類烷化劑烷化活性有別，一般情況下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。2、與DNA分子共價結合形成加合物3、改變或破壞堿基的化學結構某些誘變劑可與堿基發生相互作用，使堿基發生化學結構變化，引起錯誤配對或引起DNA鏈斷裂。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發生氧化性脫氨，相應變為次黃嘌呤和尿嘧啶。4、大分子嵌入DNA鏈如吖啶類染料（吖啶橙），是一種平面型三環分子，結構與一個嘌呤-嘧啶對十分相似，能嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成移碼突變。3、改變或破壞堿基的化學結構4、大分子嵌入DNA鏈(二)非整倍體及整倍體的誘發

非整倍體畸變的原因：（1）

不分離：同源染色體在第一次減數分裂中不分離；姐妹染色體在第二次減數分裂或有絲分裂中不分離。（2）染色體丟失由于紡錘體形成不完全或著絲粒受損使得染色體在分離過程中沒有進入任一個子細胞核中。(二)非整倍體及整倍體的誘發第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件

整倍體誘發的原因1、紡錘體受損，有絲分裂染色體組不分離，形成四倍體；2、減數分裂異常使配子形成二倍體，若二倍體的配子受精，可形成多倍體受精卵；3、一個卵子被多個精子受精，形成多倍體。整倍體誘發的原因（三）DNA損傷的修復和突變1、生物體DNA損失修復系統（1）

復制前的修復過程——精確修復，包括直接修復和切除修復a、直接修復：包括光修復和O6－甲基鳥嘌呤修復光修復：針對紫外線引起的嘧啶二聚體修復功能，修復的過程是通過在波長范圍為320～370mm的可見光中，二聚體可直接恢復成原來的樣子。催化光復活反應的酶叫做光裂合酶。（三）DNA損傷的修復和突變a、直接修復：包括光修復和O6－O6-甲基鳥嘌呤修復：修復在O6位上含有烷基的鳥嘌呤，靠O6-甲基鳥漂吟-DNA-甲基轉移酶將O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉移至該酶的半胱氨酸殘基上，而恢復鳥嘌呤正常的堿基配對特性，該酶在修復過程中被不可逆地失活。O6-甲基鳥嘌呤修復：修復在O6位上含有烷基的鳥嘌呤，靠O6b、切除修復(excixion-repair)由于這過程并不依賴于光的存在故又稱為暗修復（darkrepair）。依據切除對象的不同，分為核苷酸切除修復（大段異常核苷酸）；堿基切除修復（個別異常堿基）；錯配堿基修復

b、切除修復(excixion-repair)

核苷酸切除修復(nucleotideexcisionrepair)是所有生物體內最常見的修復機制。它可修復幾乎所有的DNA損傷類型，包括其他修復機制不能修復的加合物及DNA鏈間交聯等。修復時，先靠內切酶把DNA鏈從損傷兩端切斷；在解螺旋酶作用下，除去受損的寡核苷酸；再在修復多聚酶的作用下，以對應的鏈為模板，以正確的堿基填補空隙；最后在DNA連接酶作用下連接，恢復原來的序列。核苷酸切除修復(nucleotideexcision堿基切除修復：

A：六邊型表示錯誤的堿基

B：DNA糖基化酶切除錯誤的堿基

C：AP內切核酸酶及AP裂解酶切除磷酸二酯鏈及糖基

D：DNA聚合酶填補單一核苷酸。

E：DNA連接酶封閉缺口錯配堿基修復(mismatchbaserepair)是一種特殊的切除修復形式，通過該機制可去除不正確的堿基配對，如G：T和A：C。堿基切除修復：A：六邊型表示錯誤的堿基錯配堿基修復(mi（2）復制后修復

這個系統是在DNA復制時模板鏈上含有損傷的堿基導致子鏈產生裂缺，這是在復制時產生的，所此修復系統也屬于復制后修復。

復制時新合成的互補鏈相應部位出現空隙，隨后以重組作用及鏈延長作用填補。通過此機制，使DNA合成得以通過損傷部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA損傷并末移除，仍有待通過其他的修復機制而修復。（2）復制后修復復制時新合成的互補鏈相應部位出現空隙，2.DNA損傷修復與突變突變的產生不僅與DNA受損的情況有關，DNA損傷修復也是決定突變發生與否的重要因素。DNA損傷修復功能的缺失或修復能力降低都會使突變的發生明顯增加。不同生物損傷修復功能的類型及能力有所不同，如人類的修復能力比小鼠大10倍左右。在使用元原核生物及動物進行致突變試驗，并用其結果外推到人時，要考慮到DNA損傷修復系統的差別。DNA損傷修復過程涉及許多酶的參與。同代謝酶的多態性一樣，DNA損傷修復酶也有多態性，即其基因型或表型存在個體差異。DNA損傷修復酶的多態性在一定程度上影響著個體對遺傳毒性因素的易感性。2.DNA損傷修復與突變四、突變的不良后果突變的靶細胞有體細胞和生殖細胞（一）體細胞突變的后果1、癌變2、畸變：胚胎體細胞突變，造成畸胎3、其他不良后果：動脈粥樣硬化、衰老。（二）生殖細胞突變的后果1、致死性2、可遺傳的改變：顯性遺傳病、隱性遺傳病四、突變的不良后果（二）生殖細胞突變的后果五、致突變作用的評價（一）致突變試驗的分類

目前有200多種，重要的和常規使用的大約20多種。依據檢測的遺傳學終點的不同，可分為四類：基因突變試驗、染色體損傷試驗、非整倍體試驗和其他反映DNA損傷的試驗。五、致突變作用的評價（二）常用的致突變試驗1、細菌回復突變試驗

細菌回復突變試驗是以營養缺陷的突變體菌株為試驗系統，觀察受試物引起其回復突變的作用。常用的菌株：

色氨酸營養缺陷型的大腸桿菌——大腸桿菌回復試驗組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌——Ames實驗（二）常用的致突變試驗1、細菌回復突變試驗原理：

Ames試驗，檢測受試物誘發鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型突變株(his-)回復突變成野生型(his+)的能力。試驗菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養平皿上不能生長，回復突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養平皿上生長成可見菌落。計數最低營養平皿上的回變菌落數來判定受試物是否有致突變性。原理：第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件2.哺乳動物細胞基因突變試驗

哺乳動物細胞基因突變試驗是利用嚙齒類和人體外培養細胞的基因正向突變試驗。

常用細胞株選用的基因小鼠淋巴瘤細胞L5178YTK、HPRT

中國倉鼠卵巢組織細胞CHOHPRT

中國倉鼠肺組織細胞V79HPRT

人淋巴細胞HPRT2.哺乳動物細胞基因突變試驗常用細胞（1）tk基因位于常染色體上，編碼胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷＋ATP→

胸苷酸。存在嘧啶類似物5－溴脫氧尿苷時，產生異常核苷酸使細胞死亡。受試物存在時若細胞不死亡說明TK發生突變。（2）hprt基因位于X染色體上，編碼次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶：催化次黃嘌呤＋鳥嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸

→

核苷-5’-單磷酸（NMP）。如存在堿基類似物，生成相應的NMP，摻入到DNA中可致死。加入受試物后能存活的細胞表示發生基因突變。（1）tk基因（2）hprt基因3、染色體畸變試驗

制備細胞分裂中期相染色體標本，在光鏡下可直接觀察染色體的數目和形態的改變。染色體畸變試驗也常稱為細胞遺傳學試驗(cytogeneticassay)。染色體畸變試驗可為體外試驗，也可為體內試驗，包括對體細胞和生殖細胞的分析。

結構畸變：可觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、環狀染色體、雙或多著絲粒染色體和射體。數目畸變：需在染毒后經過一次有絲分裂才能發現。但是經過一次有絲分裂后，一些結構畸變可能因遺傳物質的丟失而致細胞死亡，因此不能發現。所以應安排多次收獲時間，以便分別檢查斷裂劑的作用。3、染色體畸變試驗結構畸變：可觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體內試驗：多觀察骨髓細胞，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優勢在于可體現哺乳動物的代謝過程、DNA修復和藥物動力學特征。但應注意受試物或其活性代謝產物有可能不易在骨髓中達到足夠的濃度。體外試驗：常用中國倉鼠肺細胞(CHL)，以及中國倉鼠卵細胞(CHO)和V79等細胞系，但任何細胞系的染色體皆不穩定，不能準確地觀察非整倍體，故在體外試驗中，如考慮進行染色體數目觀察，應當使用原代或早代細胞體內試驗：多觀察骨髓細胞，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優勢在4、微核試驗

微核是染色體的斷片或遲滯的染色體在細胞分裂后期，由于不能進入子細胞的核中而在間期的子細胞胞漿內形成的游離團塊物質，它與細胞主核著色一致，圓形或橢圓形。4、微核試驗常用嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細胞(PCE)或外周血細胞進行微核試驗。PCE是紅細胞成熟的一個階段，此時紅細胞的主核已排出，微核容易辯認，PCE胞質含RNA染色與成熟紅細胞易于區別，故為骨髓微核試驗的首選細胞群。一般采用多次染毒后24h采樣。常用嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細胞(PCE)或外周血細胞進行微核5.顯性致死試驗(dominantlethalassay)

顯性致死(dominantlethal)指發育中的精子或卵子細胞發生遺傳學損傷，導致受精卵或發育中的胚胎死亡。一般認為顯性致死主要是由于染色體損傷的結果。顯性致死試驗以胚胎死亡為觀察終點，用于檢測受試物對動物性細胞的染色體損傷作用。

一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接觸受試物，然后使之與未染毒的雌性交配，觀察胚胎死亡情況。計算出受孕率、總著床數、早期和晚期胚胎死亡率予以評價。5.顯性致死試驗(dominantlethalassa6、小鼠精子畸形試驗

精子畸形指精子形態發生異常改變。可導致生育能力的改變。用于檢測外源化學物對精子生成和發育的影響，也可用于評價化學物對生殖細胞的致突變作用。

常用6－8周的小鼠，連續5天染毒。在染毒后不同時間（1、4、10周）處死，取樣檢查精子形態。6、小鼠精子畸形試驗常用6－8周的小鼠，連續5天染毒。7、程序外DNA合成試驗(unscheduledDNAsynthesistest，UDS)

正常細胞在有絲分裂過程中，僅在S期進行DNA復制合成。

當DNA受損后，DNA的修復合成可發生在正常復制合成期(S期)以外的其他時期，稱為程序外DNA合成。用同步培養將細胞阻斷于Gl期，并將正常的DNA半保留復制阻斷，然后用受試物處理細胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培養液中進行培養。利用放射自顯影法或液閃計數法測定摻入DNA的放射活性，檢測DNA修復合成，從而間接反映DNA的損傷程度。

7、程序外DNA合成試驗(unscheduledDNAs

8、轉基因動物致突變試驗

近年來建立的轉基因動物致突變檢測模型為研究哺乳動物體內基因突變提供了有效的手段，可以在動物個體水平研究突變的器官、組織特異性，包括生殖細胞。并可比較容易地從動物基因組中重新回收導入的基因，進行序列分析。

轉基因動物指基因組中整合有用實驗方法導入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遺傳給后代的一類動物。

在進行轉基因動物致突變試驗時，在染毒后先抽提不同器官或組織的基因組DNA，然后把純化的基因組DNA與噬菌體體外包裝抽提物混合，而將導入的基因載體包裝進噬菌體中，用這些噬菌體感染大腸菌，可形成噬菌斑，通過噬菌斑顏色變化進行突變的判斷并獲得突變子。

8、轉基因動物致突變試驗轉基因動物指基因組中整合有（三）致突變試驗在預測致癌性及遺傳危害性中的價值

致突變試驗的主要目的是研究外源化學物引起人類生殖細胞的突變并傳遞給后代的可能性；另外基于體細胞突變與腫瘤有關的認識，也可用于外源化學物潛在致癌性的預測。

雖然致突變試驗可用于外源化學物致癌性的篩選，但也存在不足。在致癌性預測時致突變試驗適用于遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性非致癌物。對于遺傳毒性非致癌物會出現假陽性，對于非遺傳毒性致癌物則會出現假陰性。（三）致突變試驗在預測致癌性及遺傳危害性中的價值預測遺傳學危害也即預測對哺乳動物性細胞的致突變性。哺乳動物性細胞致突變物的標準體內試驗需較大的動物數量，且費時、費錢，不可能廣泛使用。可利用短期致突變試驗對哺乳動物性細胞致突變性及遺傳危害性進行預測。生殖細胞的致突變試驗在預測遺傳危害性中具有重要的意義。但一般認為，體細胞致突變試驗陰性的化學物，在生殖細胞試驗中一般也為陰性。所以，一般都是先進行體細胞的誘變性檢測，發現部分試驗結果陽性或有生殖細胞接觸證據時，再進行生殖細胞的誘變性檢測。預測遺傳學危害也即預測對哺乳動物性細胞的致突變性。哺乳動物性

哺乳動物性細胞致突變性與對人的遺傳危害性之間還缺乏直接相關的證據。為評價外源化學物對人類的遺傳危害性，遺傳流行病學研究是最直接、最可靠的方法，但難度很大。目前，評價遺傳危害主要還是依據致突變試驗的結果，特別是體內生殖細胞的致突變試驗結果。如果一種化學物在多項致突變試驗中證明有致突變性，一般也假定其對人也可能具有遺傳危害性。哺乳動物性細胞致突變性與對人的遺傳危害性之間還缺乏直第二節環境化學物的致癌作用及其評價

第二節環境化學物的致癌作用及其評價

一、環境致癌與化學致癌

癌癥的發生80－90％由環境因素引起，包括物理因素、生物因素和化學因素。其中主要是化學因素。在環境因素引起的腫瘤中，80％以上由化學因素引起。

化學致癌(chemicalcarcinogenesis)是指化學物質引起正常細胞發生惡性轉化并發展成腫瘤的過程，具有這種作用的化學物質稱為化學致癌物(chemicalcarcinogen)。在此，“癌”的含義包括上皮的惡性變(癌)，也包括間質的惡性變(肉瘤)及良性腫瘤。一、環境致癌與化學致癌癌癥的發生80－90％由環境因癌細胞的生物學特點：1、持續性增殖，分化不良，體外培養無接觸性抑制。永生性。2、浸潤性生長：可侵入其他組織，并發生轉移3、過分旺盛地合成核酸和氨基酸4、強烈的有氧酵解：在供氧充分時，仍能將葡萄糖轉化為乳酸，大量的乳酸使pH下降，影響細胞酶活力，破壞內穩態的維持。5、可將上述特征遺傳給子代細胞癌細胞的生物學特點：二、化學致癌的機制

尚未徹底闡明，大體可分為遺傳機制學說和非遺傳機制學說。（一）化學致癌的遺傳機制學說

該學說認為，化學致癌物進入細胞后作用于遺傳物質，通過引起細胞基因的改變而發揮致癌作用。有關學說最主要的是多階段學說和癌基因學說。二、化學致癌的機制（一）化學致癌的遺傳機制學說1、化學致癌的多階段學說包括引發、促長和進展三個階段。（1）引發階段：化學致癌的第一階段，是化學致癌物本身或其活性代謝物作用于DNA，誘發體細胞突變的過程，可能涉及原癌基因的活化和腫瘤抑制基因的失活。

具有引發作用的化學物稱為引發劑。引發劑本身有致癌性，大多數是致突變物，沒有可檢測的閾劑量，引發作用是不可逆的并且是累積性的。但并非所有的引發細胞都將構成腫瘤，因其中大多數將經歷程序性細胞死亡(凋亡)。引發細胞不具有生長自主性，因此不是腫瘤細胞。1、化學致癌的多階段學說（2）促長階段：促長階段是引發細胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。促長劑單獨使用不具致癌性，必須在引發劑后使用才發揮促長作用。促長劑通常是非致突變物，影響引發細胞的增殖，導致局部增殖并引起良性局灶性病理損害如乳頭瘤、結節或息肉。這些病損很多會消退，僅少數細胞發生進一步突變引成惡性腫瘤。

特點：

歷時較長，早期有可逆性，晚期為不可逆的對生理因素調節的敏感性，衰老、飲食和激素可影響促長作用。（2）促長階段：促長階段是引發細胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤（3）進展階段：進展階段是從引發細胞群(癌前病變、良性腫瘤)轉變成惡性腫瘤的過程。在進展期腫瘤獲得生長加快、侵襲、轉移和抗藥性等特征。這些特征是由于在進展階段的核型不穩定性。腫瘤的染色體發生斷裂、斷片易位和非整倍體。

使細胞由促長階段進入進展階段的化學物稱為進展劑(progressor)。進展劑可引起染色體畸變，但不一定具有引發活性。引發、促長及進展都可自發發生。有些化學致癌物可同時具有引發、促長及進展的作用，稱為完全致癌物。（3）進展階段：進展階段是從引發細胞群(癌前病變、良性腫瘤)化學致癌是長期的、復雜的多階段過程，至少涉及引發、促長和進展三個階段。在引發階段主要是細胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變在促長階段主要是遺傳外機制在進展階段主要是核型不穩定性正常細胞經過遺傳學改變的積累才能轉變為癌細胞。化學致癌是長期的、復雜的多階段過程，至少涉及引發、促長和進展第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件2、化學致癌的癌基因學說調控細胞增殖和分化的基因發生異常，可導致細胞持續增殖，不能及時分化和凋亡，形成腫瘤。與細胞惡性轉化有關的基因主要有癌基因和腫瘤抑制基因。2、化學致癌的癌基因學說癌基因：能引起細胞惡性轉化及癌變的基因。通常以原癌基因的形式存在正常動物細胞的基因組中。原癌基因：最早在1968年Duesberg發現Rous肉瘤病毒致癌是由于攜帶能致癌的基因片段，稱為病毒癌基因（V－onc），后來發現在正常細胞中也存在與病毒癌基因高度相似的DNA序列，稱為原癌基因（C-onc）。正常細胞中的原癌基因表達并不引起惡性病變，其表達受到嚴格控制，通常與機體的生長和發育有關。原癌基因必須經過激活才能導致細胞的惡性轉化。原癌基因是一種顯性基因，當其兩個等位基因之一發生突變，即可被激活。癌基因：能引起細胞惡性轉化及癌變的基因。通常以原癌基因的形式

腫瘤抑制基因：即抗癌基因。抗癌基因可能是編碼抑制生殖、促進分化的基因，也可能是某些基因的負控制調節基因，并是維持基因組織定性的某些基因。抗癌基因可抑制腫瘤細胞的腫瘤性狀的表達，只有當自己不能表達或其基因產物去活化才容許腫瘤性狀的表達。染色體缺失而誘發腫瘤的基因都可能是腫瘤抑制基因。屬隱形基因，必須一對等位基因丟失或突變后失活，才能對細胞的惡性轉化起作用。腫瘤抑制基因：即抗癌基因。抗癌基因可能是編碼抑制生殖、促進（二）化學致癌的非遺傳機制學說

一部分致癌物用目前的致突變試驗不能檢出其致突變性。這些非遺傳毒性致癌物促進細胞分裂增殖的機制多種多樣：

具有細胞毒性的致癌劑可引起細胞變性壞死，細胞釋放出的物質具有刺激細胞分裂增殖的作用激素失調導致腫瘤發生，與通過細胞內相應的受體刺激細胞分裂有關免疫抑制劑可降低機體對癌前細胞的監視和清除能力（二）化學致癌的非遺傳機制學說具有細胞毒性的致癌劑可引三、環境化學致癌物的分類（一）按致癌作用機制分類

可分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物兩類。1、遺傳毒性致癌物（1）直接致癌物：不需代謝活化直接與親核分子共價結合形成加合物。這類化合物為親電子劑，大多數為合成有機物。（2）間接致癌物：

多數有機致癌物需代謝活化才具有致癌活性，稱為間接致癌物。間接致癌物的原型稱為前致癌物。前致癌物經代謝活化形成的之間代謝產物——近致癌物（半致癌物），有一定致癌作用但必須再一次激活——終致癌物（前致癌物經代謝活動形成的具有致癌作用的代謝物和不需代謝活化的致癌物）。三、環境化學致癌物的分類1、遺傳毒性致癌物（2）間接致癌物：（3）無機致癌物放射性元素和重金屬。有些可能是親電子劑，但有些是通過選擇性改變DNA復制保真性，導致DNA的改變，如金屬鎳、鉻。2.非遺傳毒性致癌物(non-genotoxiccarcinogens)

非遺傳毒性致癌物不與DNA反應，可能間接地影響DNA并改變基因組導致細胞癌變，或者通過促長作用、增強作用導致癌的發展。（3）無機致癌物2.非遺傳毒性致癌物(non-genoto（1）促長劑：本身無致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促長劑可增強遺傳毒性致癌物的致癌作用，也可促進“自發性”轉化細胞發展成癌。（2）激素調控劑：主要改變內分泌系統平衡及細胞正常分化，常起促長劑作用。（3）細胞毒劑：可能引起細胞死亡，導致細胞增殖活躍及癌發展。（4）過氧化物酶體增殖劑：過氧化物酶體增殖可導致細胞內氧自由基過量生成。（1）促長劑：本身無致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促（5）免疫抑制劑：主要對病毒誘導的惡性轉化起增強作用。（6）固態物質：物理狀態是關鍵性因素，可能涉及細胞毒性。如塑料、石棉等。（7）助癌物：本身無致癌性，在致癌物之前或同時應用助癌物可顯著增加癌癥的發生。助癌作用的機制可涉及增加致癌物的吸收、增加活化的致癌物的比例、耗盡內源性結合反應底物、抑制DNA修復、促進DNA損傷固定為突變等。（5）免疫抑制劑：主要對病毒誘導的惡性轉化起增強作用。（四、環境化學物致癌物的評價(一)哺乳動物致癌試驗哺乳動物致癌試驗是鑒定化學致癌物的標準體內試驗。哺乳動物致癌試驗用來確定受試物對試驗動物的致癌性、劑量—反應關系及誘發腫瘤的靶器官。四、環境化學物致癌物的評價1、實驗動物物種和品系：要求用兩種實驗動物，常規選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。在選擇品系時應選擇較敏感、自發腫瘤率低、生活力強及壽命較長的品系。性別：應使用同等數量的雌雄兩種性別的動物。年齡：使用剛離乳的動物，以保證有足夠長的染毒和發生癌癥的時間，而且幼年動物解毒酶及免疫系統尚未完善，對致癌作用比較敏感。1、實驗動物2、劑量設置致癌試驗一般設三個試驗組。高劑量組：最大耐受劑量(MTD)是由90天毒性試驗來確定的，此劑量應使動物體重減輕不超過對照組的10％，并且不引起死亡及導致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷。低劑量組：一般不低于高劑量的10％。應不影響動物的正常生長、發育和壽命，即不產生任何毒性效應。中劑量組：介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動力學性質來確定。對照組除不給受試物外，其他條件均與試驗組相同。同時應設陰性(溶劑或賦形劑)對照組。必要時可設陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物的化學結構相近。2、劑量設置3、染毒途徑盡可能模擬人體可能的暴露途徑，主要途徑有經口、經皮和吸入三種，應根據受試物的理化性質和接觸方式選擇確定。4、試驗期限一般情況下，試驗期限小鼠和倉鼠應為18個月，大鼠為24個月；然而對于某些生命期較長或自發腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可持續24個月，大鼠可持續30個月。3、染毒途徑4、試驗期限5、觀察指標（1）一般觀察：每天觀察受試動物一次，主要觀察其外表、活動、攝食情況等。在實驗最初三個月每周稱體重一次，以后每兩周稱體重一次。經飼料或飲水給以受試物時，應記錄食物消耗量或飲水量，以計算受試物的攝人量。觀察時要注意有無腫瘤出現、腫瘤出現時間及死亡時間。（2）腫瘤發生情況：記錄肉眼可見或可觸及腫瘤出現的時間、部位、大小、外形、發展狀況并記錄動物死亡時間。（3）病理檢查：動物自然死亡或處死后必須及時進行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。5、觀察指標6、結果分析主要分析指標有腫瘤發生率、腫瘤潛伏期及腫瘤多發性。腫瘤發生率(％)=(實驗結束時患腫瘤動物總數／有效動物總數)×100％式中，有效動物總數指最早發現腫瘤時存活動物總數。腫瘤潛伏期即從攝入受試物起到發現腫瘤的時間，因為內臟腫瘤不易覺察，通常將腫瘤引起該動物死亡的時間定為發生腫瘤的時間。腫瘤多發性指一個動物出現多個器官的腫瘤或一個器官出現多個腫瘤。6、結果分析

致癌試驗陽性的判定標準為WHO提出的標準。WHO(1969)提出機體可以對致癌物有下列一種或多種反應：

(1)對于對照組也出現的一種或數種腫瘤，試驗組腫瘤發生率增加；

(2)試驗組發生對照組沒有的腫瘤類型；

(3)試驗組腫瘤發生早于對照組；

(4)與對照組比較，試驗組每個動物的平均腫瘤數增加。

在進行試驗的兩個物種兩種性別動物中，有一種結果為陽性，即認為該受試物有致癌性。兩個物種兩種性別動物試驗結果均為陰性時，方能認為未觀察到致癌作用。致癌試驗陽性的判定標準為WHO提出的標準。WHO(（二）致突變試驗用于致癌物篩選

預測致癌性的理想致突變試驗應能靈敏地預測出受試物的致癌性，也能特異地預測出受試物的非致癌性，即要有高的靈敏性和特異性。靈敏性指受試物在致突變試驗中的陽性比例。

特異性指受試物在致突變試驗中的陰性比例。（二）致突變試驗用于致癌物篩選預測致癌性的理想致突變用于致癌物篩選的短期試驗如下：①基因突變試驗：鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)，培養哺乳動物細胞TK或HPRT正向突變試驗；②染色體畸變試驗：體外細胞系細胞遺傳學分析，小鼠骨髓微核試驗，大鼠骨髓染色體畸變試驗；③原發性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復誘導(細菌SOS反應，大鼠肝UDS誘導)，SCE試驗；④體外細胞轉化：敘利亞地鼠胚胎細胞，Balb／c3T3細胞。用于致癌物篩選的短期試驗如下：（三）細胞惡性轉化試驗

是短期試驗中的一類重要方法。將受試物在體外與動物細胞株接觸，若受試物具有致癌作用，則正常細胞的形態、功能發生變化與癌細胞類似，此種現象稱為轉化或惡性轉化。通過增殖，這些表型變異細胞形成與正常細胞不同的集落，即轉化集落。利用這些集落的存在、形成率以及將轉化細胞接種于裸鼠中發生腫瘤的情況來評價化學物的致癌活性。（三）細胞惡性轉化試驗

該方法操作快速，理論上可靠。試驗證明，細胞惡性轉化與Ames試驗配套使用，可檢出98－99％的致癌物。而且試驗周期短，簡便經濟，易于觀察，靈敏度高，受試物直接作用于靶細胞，便于劑量控制，免受整體動物體內免疫系統和生物轉化、生物轉運的影響。

但惡性轉化大多數屬形態轉化或惡性前期轉化，這種轉化可發展為真正的惡性病變，也可能到此為止，并一定形成腫瘤。因此陽性結果只提示受試物具有致癌的可能性。該方法操作快速，理論上可靠。試驗證明，細胞惡性轉化與（四）哺乳動物短期致癌試驗哺乳動物短期致癌試驗又稱為有限體內試驗，指時間有限(數月)，靶器官有限。較受重視的短期致癌試驗有下列四種：小鼠皮膚腫瘤誘發試驗、小鼠肺瘤誘發試驗、大鼠肝轉化灶誘發試驗、雌性大鼠乳腺癌誘發試驗。

（四）哺乳動物短期致癌試驗（五）人群流行病學研究

流行病學調查是獲得環境化學物對人類致癌性的最可靠證據的主要手段，經驗證明大多數化學物質的致癌物是依據職業性接觸人群的流行病學調查而肯定的。

調查應該包括前瞻性和回顧性調查。重點調查各種腫瘤發生率、死亡率、潛伏期、劑量－效應關系以及接觸劑量與腫瘤發病率和死亡率的關系。（五）人群流行病學研究（六）轉基因動物致癌檢測模型動物致癌試驗耗時長，耗費人力物力大，使用的染毒劑量大。轉基因底物為快速檢測致癌物和促癌物提供了新的重要途徑。轉基因小鼠可用于研究在致癌過程中特定基因的作用，可用于分析化學物-基因的相互作用。（六）轉基因動物致癌檢測模型2、腫瘤抑制基因敲除小鼠

將一段DNA整合到腫瘤抑制基因中，使該基因不能表達具有正常功能的蛋白質。過量表達癌基因的轉基因小鼠

這類轉基因動物是研究化學物致癌作用的敏感體系。攜帶癌基因的轉基因動物可用于致癌試驗，試驗周期僅3個月左右，有希望發展成代替長期動物致癌試驗的試驗系統。

2、腫瘤抑制基因敲除小鼠過量表達癌基因的轉基因小鼠（七）結構與生物活性關系分析典型的例子是根據分子軌道法提出的多環芳烴致癌的K區理論和灣區理論的等。如果在定量結構-活性關系研究中發現化學物具有某些可引起腫瘤的特殊結構，應考慮進一步的相關試驗，或不將其應用于藥品及工業生產中。（七）結構與生物活性關系分析第三節環境化學物的生殖發育毒性

及其評價

第三節環境化學物的生殖發育毒性

及其評價

生殖發育過程即繁殖過程，包括：生殖細胞發生→卵細胞受精→著床→胚胎形成→胚胎發育→器官發生→胎仔發育→分娩和哺乳

生殖毒性：對生殖細胞、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳的損害作用。發育毒性：對胚胎發育、胎仔發育及出生幼子發育的損害作用。生殖發育過程即繁殖過程，包括：生殖毒性：對生殖細胞、卵一、生殖毒性及評價（一）對雄性生殖系統的毒害作用包括對睪丸生精細胞的影響、對內分泌功能的影響、對性功能和生殖功能的影響。精子的生成有賴于下丘腦-垂體-睪丸軸的調節功能。一、生殖毒性及評價（二）對雌性生殖系統的損害作用包括對卵細胞和內分泌功能的影響。下丘腦LH-RH垂體前葉FSHLH卵泡初期成長卵泡成熟排卵黃體形成雌二醇孕酮

（＋）（－）

（＋）（－）（二）對雌性生殖系統的損害作用下丘腦LH-RH垂體前葉FSH（三）生殖毒性及其評定外來化合物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。可全面反映外來化合物對性腺功能、發育周期、交配行為、受孕、妊娠、分娩、授乳及幼子斷奶后生長發育可能產生的影響。1、試驗方法原則材料：性成熟大鼠，或小鼠、家兔劑量：三組最高：出現輕度中毒，不死亡或死亡率小于10％等比級數中：極輕微中毒低：無中毒癥狀染毒方式：口服——飼喂法、灌胃法數量：雌雄各16－20只，或雌16－20只，雄8－10只（三）生殖毒性及其評定1、試驗方法原則（2）試驗方案a、三代兩窩試驗（2）試驗方案

近年來許多國家與機構多規定采用兩代一窩或一代一窩試驗法，兩代一窩生殖試驗法基本程序與三代兩窩試驗法相同，但只進行到第二代F2，每代只生育一窩。（3）觀察指標

在上述各種生殖毒性試驗中，根據哺乳動物全部生育繁殖過程，可觀察下列4個指標：受孕率：反映雌性動物生育能力正常分娩率：反映雌性動物妊娠過程是否受影響幼仔出生存活率：反映雌性動物分娩是否正常幼仔哺育成活率：反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力近年來許多國家與機構多規定采用兩代一窩或一代一窩試驗法二、發育毒性及評價胚胎毒性——發育毒理學范疇，母體毒性——生殖毒理學范疇。都是化學物對生殖繁殖過程的影響，是在不同階段和不同靶部位的具體體現。（一）胚胎毒性指外來化學物對母體子宮內胚胎或胎兒產生的毒作用。具體表現：1、胚胎死亡2、生長遲緩：平均體重低于正常值兩個標準差。3、功能發育不全：包括代謝、免疫、神經系統方面的缺陷。4、畸形：包括外觀、內臟、骨骼畸形，指的是器官形態結構的異常，與發育缺陷不同，它指的是出生后個體發育紊亂引起的結構、功能、代謝、精神、行為和遺傳等異常。二、發育毒性及評價（一）胚胎毒性

畸形指的是器官形態結構的異常，與發育缺陷不同，后者指的是出生后個體發育紊亂引起的結構、功能、代謝、精神、行為和遺傳等異常。

與變異區別：兩者有時難以區分，一般變異不存在生命危險，甚至不影響正常生理功能，而且難以明確變異與接觸某種外源化學物的因果關系。常見的變異有內臟左右易位、手指、足趾數目不同。畸形指的是器官形態結構的異常，與發育缺陷不同（二）母體毒性指外來化合物在一定劑量下，對受孕母體產生的損害作用。具體表現包括體重減輕、出現某些臨床癥伏、直至死亡。常見有以下情況：（1）具有胚胎毒性，但無母體毒性出現。（2）出現胚胎毒性的同時也表現母體毒性。（3）不具有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩態，以致對胚胎具有非特異性的影響，并造成畸形。（4）僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。（5）在一定劑量下，既不呈現母體毒性，也未見致畸作用。此種情況并不能確定受試物確實不具致畸作用。可能是動物接觸的劑量未達到致畸作用的最小有作用劑量，并非真正不具有致畸作用。（二）母體毒性常見有以下情況：（三）發育毒性及評定1、致畸試驗檢查受試物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形的動物試驗，可確定受試物是否有致畸作用，誘發何種畸形及出現畸形的主要器官，最大無作用劑量和最小有作用劑量。（1）動物選擇食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養和繁殖及價廉，還應特別注意妊娠過程較短、每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類接近等特點。可選用二種哺乳動物，一般首先考慮大鼠，此外可采用小鼠或家兔。大鼠受孕率高，易于得到足夠標本數；胎仔大小適中；大鼠對大多數外來化合物代謝過程基本與人類近似。（三）發育毒性及評定（1）動物選擇（2）劑量分組預試驗：用孕鼠8－10只，在妊娠15－16天內給予受試物，如果出現嚴重的母體中毒、流產或胚胎大量死亡，將劑量減小，直到找出母體輕度中毒的劑量。最少設3個劑量組，成等比級數關系。另設對照組，陽性對照、陰性對照最高劑量組——可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%中間劑量組——母體出現某些極輕微中毒癥狀最低劑量組——不應觀察到任何中毒癥狀（2）劑量分組（3）交配處理每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。接觸受試物的方式與途徑應與人體實際接觸情況一致，一般多經口給予。也可采用灌胃方式、腹腔注射法。大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始給予受試物，每日一次，持續到第15天。試驗期間每2～3天稱取母鼠體重。一方面可根據體重增長，隨時調整給予受試物的劑量，同時也可觀察受孕動物的妊娠情況和胚胎發育情況。（3）交配處理（4）胎仔檢查自然分娩前1～2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。活產胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計算平均體重，然后由下列幾方面進行畸形檢查：①外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；②肉眼檢查內臟及軟組織畸形，例如腭裂；③骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等。畸形檢查只限活產胎仔。（5）結果評定主要計算畸胎總數和畸形總數。計算時還要對劑量效應（反應）關系加以分析。常用評價指標：活產幼仔平均畸形出現率、畸胎出現率、母體畸胎出現率（4）胎仔檢查2、致畸物體內篩檢試驗法（C/K法）對象：受孕小鼠或大鼠劑量：至少兩個劑量組＋對照組。高劑量組：最小有作用劑量，允許產生明顯母體毒性。妊娠6－15天內每天接觸受試物，記錄體重，自然分娩，肉眼查看畸胎，計算出現死胎母鼠百分率、出現吸收胎母鼠百分率和出生第三日存活幼子百分率。此外，還應計算幼子平均體重和出生三日增長的體重，判斷是否生長遲緩，若有培養至斷奶，觀察是否可逆。特點：簡單易行；經濟；可作大批量試驗處理；可確定生長發育遲緩是否可逆。2、致畸物體內篩檢試驗法（C/K法）3、致畸作用和發育毒性體外試驗法

包括全胚胎培養、器官培養、細胞培養。特點：①節約人力和時間②可利用人血清、尿液，直接觀察其對人群的作用③可理解代謝物的致畸作用及發育毒性④試驗條件易控制（1）全胚胎培養法系將試驗動物的全胚胎在一定培養基中進行培養，觀察在接觸受試物的情況下，是否出現致畸作用及發育毒性。常選用來自大鼠妊娠9－10天、小鼠8－9天后的胚胎，觀察指標有胚胎存活力和組織學形態變化。雞、魚、蛙類胚胎也可采用。3、致畸作用和發育毒性體外試驗法（1）全胚胎培養法（2）器官培養法系將胚胎或胎仔組織、器官或器官一部分在體外培養，觀察外源化學物對其發育過程的影響。一般利用妊娠10－11天的鼠類胚胎肢芽進行懸浮培養。培養7－9天，期間觀察細胞的增殖分化，肢芽大小和形狀、軟骨形成等。（3）細胞培養法傳代細胞和原代細胞都曾用過，根據是致畸物可干擾細胞的正常生長過程。但傳代細胞往往失去原有特性，在致畸物作用下，往往只觀察到細胞毒性作用。原代細胞沒有這樣的缺點。常用的原代細胞有大、小鼠和鳥類的肢芽細胞。（2）器官培養法（3）細胞培養法4、生殖毒性和發育毒性三階段一代試驗法（1）第一階段：生育力與生殖功能試驗檢驗化學物對受孕能力和生殖功能的影響。劑量組：2－3個＋對照組分組：雌性20只，雄性10只，最好有兩種哺乳動物。性成熟雄鼠接觸60天后，雌鼠接觸14天，再交配。妊娠14天后，將一半受孕鼠殺死。記錄黃體數、著床數和吸收胎數，分別計算著床前死亡率和著床后死亡率；另一半受孕鼠繼續試驗，直至分娩，哺乳結束，幼子出生后觀察有無畸形，稱重判斷有無發育遲緩。4、生殖毒性和發育毒性三階段一代試驗法（2）第二階段試驗：致畸作用和胚胎毒性評定每組雌鼠20只．在妊娠6至15日接觸受試物。自然分娩前1天，處死孕鼠，取出胎仔，稱重、鑒定性別并檢查內臟和骨骼有無畸形。（3）第三階段試驗：圍產期及出生后發育情況試驗妊娠第15天開始接觸受試物直至斷奶。以評定受試物可能對胎仔發育后期、母體妊娠、分娩和受乳以及幼仔在新生期間存活和生長發育的影響。觀察指標有受孕率、幼仔性別比例或雌雄兩性各占幼仔總數的百分率、出生存活率、哺育成活率等。

（2）第二階段試驗：致畸作用和胚胎毒性評定（四）致畸作用的機理

目前已知致畸因素很多，其中主要是化學因素。其機理復雜，至今尚未闡明。1、基因突變和染色體畸變

基因突變：生殖細胞——具遺傳性，但發生較少。因其不易完成胚胎及胎仔的正常發育過程體細胞——即胚胎細胞，非遺傳性，表現在子代

染色體畸變：常導致胚胎死亡。不死亡可產生畸形和障礙。2、生物合成的原料和能量不足

指細胞內各種生物合成必需的能量和原料供應不足或代謝過程受到干擾。胚胎組織增殖速度很快，短時間內要消耗大量能量，能量代謝受阻可畸形。（四）致畸作用的機理2、生物合成的原料和能量不足3、細胞毒作用由于致畸物對DNA復制、轉錄和翻譯或細胞分裂等過程的干擾，影響細胞的增殖，即表現出細胞毒作用，引起組織細胞死亡，出生時形成畸形。

致畸物量較低：細胞可死亡，但可被存活細胞的增殖補償，出生時不形成畸形。

致畸物量較高：細胞大量死亡，使胚胎死亡。只有在一定范圍的機理內，細胞增殖速度下降，不能對受損組織補償，但不危機生命，導致畸形。細胞分化過程的某一特定階段、步驟或環節受到干擾，引起畸形。3、細胞毒作用4

、酶的抑制在細胞分化、增殖及生長發育過程中，一些重要酶類受抑制或破壞，將影響胚胎正常發育過程，引起畸形。5、對細胞膜的損傷細胞膜正常結構及滲透性等生物物理性質改變的情況下，也可出現畸形。細胞膜結構的正常與保持滲透壓是維持細胞增殖及細胞代謝所必需。6、非特異性發育毒性作用特點是全部胚胎組織細胞基本生命現象的干擾。與能量代謝有關的環節受到干擾，全部組織受到損害，并引起胚胎全面生長遲緩。不存在靶部位與靶組織，不可能有部分組織受損與畸形幼子出生。4、酶的抑制5、對細胞膜的損傷6、非特異性發育毒性作用7、母體與胎盤的正常功能受到干擾胚胎的正常發育與母體、胎盤的正常功能有密切關系。8、致畸作用中生物化學作用因素的新認識近年來細胞通訊和程序性細胞死亡的障礙或干擾及遺傳毒性的研究很受重視。7、母體與胎盤的正常功能受到干擾演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！

第五章環境化學物的特殊毒性及其評價第五章環境化學物的特殊毒性及其評價第一節環境化學物的致突變性及其評價

第一節環境化學物的致突變性及其評價

一、概述物種的各個體和各代之間的種種變化稱為變異。可遺傳變異即稱為突變（mutation）。有自發的和誘發的。相當多的外來化學物能直接損傷DNA或產生其他遺傳學改變而使基因和染色體發生改變——遺傳毒物或致突變物或誘變劑。一、概述二、突變的類型突變的基礎是遺傳物質的DNA改變，根據DNA改變牽涉的范圍大小，可以將遺傳損傷分為三類：基因突變、染色體突變和基因組突變。二、突變的類型（一）基因突變指在基因序列中DNA序列的改變，也叫點突變。1、堿基置換

堿基置換指DNA序列上的某個堿基被其他堿基取代。首先在DNA復制時會使互補鏈的相應位點配上一個錯誤的堿基，即發生錯誤配對。這一錯誤配上的堿基在下一次DNA復制時卻能按正常規律配對，于是一對錯誤的堿基置換了原來的堿基對，亦即最終產生堿基對置換或簡稱堿基置換。轉換（transition）：嘌呤與嘌呤堿基之間的置換，或嘧啶與嘧啶之間的置換。顛換（transversion）：嘌呤與嘧啶堿基之間的置換。

（一）基因突變1、堿基置換轉換（transition）第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件2、移碼

移碼是從mRNA到蛋白質翻譯過程中遺傳密碼子讀碼順序的突變，通常是基因中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數的堿基對所造成的突變。2、移碼3、整碼突變

指在DNA中增加或減少的堿基對為一個或幾個密碼子。4、片斷突變

指基因中某些小片斷核苷酸序列發生改變。這種損傷有時可跨越兩個或數個基因。片斷突變包括缺失、重復、重組、重排。3、整碼突變4、片斷突變（二）染色體突變

也稱染色體畸變，是染色體或染色體單體受損而發生斷裂，且斷端不發生重接或雖重接卻不在原處。能使染色體或染色單體發生斷裂的物質稱為斷裂劑，這種作用的發生及其過程稱為斷裂作用。斷裂作用的關鍵是誘發DNA鏈斷裂。（二）染色體突變也稱染色體畸變，是染色體或染色體單體受損而發（1）裂隙（gap）在染色體上出現無染色質的區域，但該區域兩端的染色體仍保持線狀連接者為裂隙。一般認為裂隙屬于非染色質損傷。裂隙不計入畸變范圍。（2）斷裂（break）

指染色體上狹窄的非染色帶,無線狀連接者為斷裂。（1）裂隙（gap）（2）斷裂（break）（3）斷片（fragment）和缺失（deletion）一個染色體發生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節段遠遠分開，常將無著絲粒斷片簡稱為斷片。有著絲粒的部分稱為缺失，缺失有末端缺失和中間缺失。（3）斷片（fragment）和缺失（deletion）（4）

微小體（minutebody）中間缺失如斷片很小，小于染色單體寬度，呈圓點狀，稱為微小體。（5）無著絲粒環（acentricring）一條較長的無著絲粒斷片的兩端連接，就形成無著絲粒環。（4）微小體（minutebody）（5）無著絲粒環（a（6）環狀染色體（ringchromosome）染色體兩臂各發生一次斷裂，其帶有著絲粒的節段的兩斷端連接形成一個環時，稱為環狀染色體。（7）雙著絲粒染色體（dicentricchromosome）兩條染色體斷裂后，兩個有著絲粒的節段重接形成。（6）環狀染色體（ringchromosome）（7）雙著（8）倒位（inversion）當某一染色體發生兩次斷裂后，其中間節段倒轉180再重接，稱為倒位。臂間倒位：顛倒的是具有中間著絲粒的中間節段臂內倒位：顛倒的是長臂或短臂內的一段（8）倒位（inversion）（9）易位（translocation）兩個非同源染色體斷裂后，從某個染色體斷下的節段接到另一染色體上稱為易位。兩條染色體同時斷裂，相互交換斷片并重接——相互易位僅一個染色體節段連接到另一染色體上——單方易位；三個或三個以上染色體斷裂、重接——復雜易位（9）易位（translocation）（10）插入（insertion）和重復（duplication）當一個染色體發生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來，稱為插入。如此時有缺失的染色體和有插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發生于同一位點，則插入將使該染色體連續出現兩段完全相同的節段，此時稱為重復。（10）插入（insertion）和重復（duplicati（11）輻射體染色體間的不平衡易位可形成三條臂構型或四條臂構型，分別稱為三輻射體和四輻射體。在多個染色體間的單體互換可形成復合射體。（11）輻射體（三）基因組突變指基因組中染色體數目的改變，也稱染色體數目畸變。（三）基因組突變1、非整倍體指細胞丟失或增加一條或多條染色體。缺失一條染色體稱為單體，增加一條染色體稱為三體。2、整倍體指染色體數目的異常是以染色體組為單位的增減，如三倍體、四倍體。1、非整倍體缺失一條染色體稱為單體，2、整倍體三、致突變作用機理外源化學物引起基因突變和染色體突變的靶部位主要是DNA，而導致染色體數目異常的靶部位主要是有絲分裂和減數分裂器，如紡錘絲。（一）DNA損傷和突變1、堿基類似物的取代有些化學物的結構與堿基非常相似，稱堿基類似物。它們能可與天然堿基競爭，并取代其位置，而摻入到DNA分子中，引起劍姬配對特性的改變，引發突變。三、致突變作用機理（一）DNA損傷和突變2、與DNA分子共價結合形成加合物

許多親電子性化學物可與DNA作用形成加合物（adduction）。不同誘變劑與DNA作用的堿基位置不同，可引起不同類型的突變。烷化劑可提供甲基或乙基等烷基，與DNA發生共價結合。對DNA和蛋白質都有強烈烷化作用。各類烷化劑烷化活性有別，一般情況下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。2、與DNA分子共價結合形成加合物3、改變或破壞堿基的化學結構某些誘變劑可與堿基發生相互作用，使堿基發生化學結構變化，引起錯誤配對或引起DNA鏈斷裂。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發生氧化性脫氨，相應變為次黃嘌呤和尿嘧啶。4、大分子嵌入DNA鏈如吖啶類染料（吖啶橙），是一種平面型三環分子，結構與一個嘌呤-嘧啶對十分相似，能嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成移碼突變。3、改變或破壞堿基的化學結構4、大分子嵌入DNA鏈(二)非整倍體及整倍體的誘發

非整倍體畸變的原因：（1）

不分離：同源染色體在第一次減數分裂中不分離；姐妹染色體在第二次減數分裂或有絲分裂中不分離。（2）染色體丟失由于紡錘體形成不完全或著絲粒受損使得染色體在分離過程中沒有進入任一個子細胞核中。(二)非整倍體及整倍體的誘發第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件

整倍體誘發的原因1、紡錘體受損，有絲分裂染色體組不分離，形成四倍體；2、減數分裂異常使配子形成二倍體，若二倍體的配子受精，可形成多倍體受精卵；3、一個卵子被多個精子受精，形成多倍體。整倍體誘發的原因（三）DNA損傷的修復和突變1、生物體DNA損失修復系統（1）

復制前的修復過程——精確修復，包括直接修復和切除修復a、直接修復：包括光修復和O6－甲基鳥嘌呤修復光修復：針對紫外線引起的嘧啶二聚體修復功能，修復的過程是通過在波長范圍為320～370mm的可見光中，二聚體可直接恢復成原來的樣子。催化光復活反應的酶叫做光裂合酶。（三）DNA損傷的修復和突變a、直接修復：包括光修復和O6－O6-甲基鳥嘌呤修復：修復在O6位上含有烷基的鳥嘌呤，靠O6-甲基鳥漂吟-DNA-甲基轉移酶將O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉移至該酶的半胱氨酸殘基上，而恢復鳥嘌呤正常的堿基配對特性，該酶在修復過程中被不可逆地失活。O6-甲基鳥嘌呤修復：修復在O6位上含有烷基的鳥嘌呤，靠O6b、切除修復(excixion-repair)由于這過程并不依賴于光的存在故又稱為暗修復（darkrepair）。依據切除對象的不同，分為核苷酸切除修復（大段異常核苷酸）；堿基切除修復（個別異常堿基）；錯配堿基修復

b、切除修復(excixion-repair)

核苷酸切除修復(nucleotideexcisionrepair)是所有生物體內最常見的修復機制。它可修復幾乎所有的DNA損傷類型，包括其他修復機制不能修復的加合物及DNA鏈間交聯等。修復時，先靠內切酶把DNA鏈從損傷兩端切斷；在解螺旋酶作用下，除去受損的寡核苷酸；再在修復多聚酶的作用下，以對應的鏈為模板，以正確的堿基填補空隙；最后在DNA連接酶作用下連接，恢復原來的序列。核苷酸切除修復(nucleotideexcision堿基切除修復：

A：六邊型表示錯誤的堿基

B：DNA糖基化酶切除錯誤的堿基

C：AP內切核酸酶及AP裂解酶切除磷酸二酯鏈及糖基

D：DNA聚合酶填補單一核苷酸。

E：DNA連接酶封閉缺口錯配堿基修復(mismatchbaserepair)是一種特殊的切除修復形式，通過該機制可去除不正確的堿基配對，如G：T和A：C。堿基切除修復：A：六邊型表示錯誤的堿基錯配堿基修復(mi（2）復制后修復

這個系統是在DNA復制時模板鏈上含有損傷的堿基導致子鏈產生裂缺，這是在復制時產生的，所此修復系統也屬于復制后修復。

復制時新合成的互補鏈相應部位出現空隙，隨后以重組作用及鏈延長作用填補。通過此機制，使DNA合成得以通過損傷部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA損傷并末移除，仍有待通過其他的修復機制而修復。（2）復制后修復復制時新合成的互補鏈相應部位出現空隙，2.DNA損傷修復與突變突變的產生不僅與DNA受損的情況有關，DNA損傷修復也是決定突變發生與否的重要因素。DNA損傷修復功能的缺失或修復能力降低都會使突變的發生明顯增加。不同生物損傷修復功能的類型及能力有所不同，如人類的修復能力比小鼠大10倍左右。在使用元原核生物及動物進行致突變試驗，并用其結果外推到人時，要考慮到DNA損傷修復系統的差別。DNA損傷修復過程涉及許多酶的參與。同代謝酶的多態性一樣，DNA損傷修復酶也有多態性，即其基因型或表型存在個體差異。DNA損傷修復酶的多態性在一定程度上影響著個體對遺傳毒性因素的易感性。2.DNA損傷修復與突變四、突變的不良后果突變的靶細胞有體細胞和生殖細胞（一）體細胞突變的后果1、癌變2、畸變：胚胎體細胞突變，造成畸胎3、其他不良后果：動脈粥樣硬化、衰老。（二）生殖細胞突變的后果1、致死性2、可遺傳的改變：顯性遺傳病、隱性遺傳病四、突變的不良后果（二）生殖細胞突變的后果五、致突變作用的評價（一）致突變試驗的分類

目前有200多種，重要的和常規使用的大約20多種。依據檢測的遺傳學終點的不同，可分為四類：基因突變試驗、染色體損傷試驗、非整倍體試驗和其他反映DNA損傷的試驗。五、致突變作用的評價（二）常用的致突變試驗1、細菌回復突變試驗

細菌回復突變試驗是以營養缺陷的突變體菌株為試驗系統，觀察受試物引起其回復突變的作用。常用的菌株：

色氨酸營養缺陷型的大腸桿菌——大腸桿菌回復試驗組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌——Ames實驗（二）常用的致突變試驗1、細菌回復突變試驗原理：

Ames試驗，檢測受試物誘發鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型突變株(his-)回復突變成野生型(his+)的能力。試驗菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養平皿上不能生長，回復突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養平皿上生長成可見菌落。計數最低營養平皿上的回變菌落數來判定受試物是否有致突變性。原理：第五章環境化學物的特殊毒性及其評價課件2.哺乳動物細胞基因突變試驗

哺乳動物細胞基因突變試驗是利用嚙齒類和人體外培養細胞的基因正向突變試驗。

常用細胞株選用的基因小鼠淋巴瘤細胞L5178YTK、HPRT

中國倉鼠卵巢組織細胞CHOHPRT

中國倉鼠肺組織細胞V79HPRT

人淋巴細胞HPRT2.哺乳動物細胞基因突變試驗常用細胞（1）tk基因位于常染色體上，編碼胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷＋ATP→

胸苷酸。存在嘧啶類似物5－溴脫氧尿苷時，產生異常核苷酸使細胞死亡。受試物存在時若細胞不死亡說明TK發生突變。（2）hprt基因位于X染色體上，編碼次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶：催化次黃嘌呤＋鳥嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸

→

核苷-5’-單磷酸（NMP）。如存在堿基類似物，生成相應的NMP，摻入到DNA中可致死。加入受試物后能存活的細胞表示發生基因突變。（1）tk基因（2）hprt基因3、染色體畸變試驗

制備細胞分裂中期相染色體標本，在光鏡下可直接觀察染色體的數目和形態的改變。染色體畸變試驗也常稱為細胞遺傳學試驗(cytogeneticassay)。染色體畸變試驗可為體外試驗，也可為體內試驗，包括對體細胞和生殖細胞的分析。

結構畸變：可觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、環狀染色體、雙或多著絲粒染色體和射體。數目畸變：需在染毒后經過一次有絲分裂才能發現。但是經過一次有絲分裂后，一些結構畸變可能因遺傳物質的丟失而致細胞死亡，因此不能發現。所以應安排多次收獲時間，以便分別檢查斷裂劑的作用。3、染色體畸變試驗結構畸變：可觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體內試驗：多觀察骨髓細胞，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優勢在于可體現哺乳動物的代謝過程、DNA修復和藥物動力學特征。但應注意受試物或其活性代謝產物有可能不易在骨髓中達到足夠的濃度。體外試驗：常用中國倉鼠肺細胞(CHL)，以及中國倉鼠卵細胞(CHO)和V79等細胞系，但任