關于植物細胞工程的基本原理和技術基礎第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日

4.1植物細胞工程的基本原理

4.2植物細胞和組織培養所需條件

4.3外植體的選擇及消毒

4.4外植體的切取和培養

第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日

植物細胞工程的含義：通過細胞、組織、器官培養以及細胞融合等，達到改良品種、快速繁殖或生產生物產品的一種技術。

研究內容：

細胞工程基本技術

細胞、組織、器官培養

原生質體培養

細胞融合及培養第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.1植物細胞工程的基本原理

植物細胞的全能性

1934年，White首次定義為:每個植物活細胞在合適的條件下，都有發育為胚的能力。

70年代，擴大了以上定義范圍，為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發育為完整植株。

80年代初，認為：任何植物的離體細胞在人工培養下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養細胞的藥物生物合成的能力。

第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日

一個細胞所具有的產生完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。

細胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養反應;即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產生植物個體；動、植物細胞全能性的表現程度存在明顯的差異。第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日植物細胞全能性表現根據細胞類型不同從強到弱:

營養生長中心>形成層>薄壁細胞>厚壁細胞(木質化細胞)>特化細胞(篩管、導管細胞)；根據細胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導組織>厚壁組織。第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日

脫分化：具有特異結構和功能的細胞轉化成沒有特異結構和功能的細胞的過程稱為脫分化。（如根、莖、葉）

再分化：是指離體培養物可以由脫分化狀態再度分化。包括細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生完整植株。第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日植物激素的調控作用

激素在細胞分化中的作用，可能是通過在轉錄或翻譯水平上的調節作用而影響相關基因的表達從而調控細胞分化。但應該注意到，在植物中細胞種類的不同或同一種細胞不同的發育狀態，均會影響該種細胞對激素的反應，即靶細胞反應差異，所以試圖尋找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困難的。第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2植物細胞和組織培養所需的營養和環境條件

培養基的組成和配制

影響植物組織培養的環境條件第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日培養基的組成和配制4.2.1.1培養基的基本成分（1）無機成分培養的植物組織、器官、細胞或者原生質體需要連續的供給某些無機化學物質，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營養元素。第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日

大量元素

培養基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培養基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結合的鹽提供。微量元素

微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl

其他一些化學藥品常帶有微量元素雜質，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等毒害現象。第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）碳源

糖在培養基的作用：

①為細胞提供合成新物質的碳骨架

②為細胞的呼吸代謝提供底物和能量

③維持滲透壓

蔗糖是廣泛應用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日（3）維生素類維生素類物質在酶系統中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產生和生活力有關，可能是所有植物組織培養初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（VB6）促進根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進胚的發育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日（4）植物生長物質植物激素是在植物體內合成的，對植物生長發育有顯著調節作用的微量有機物，而植物生長調節劑是外源的調節植物生長發育的物質。無機元素和有機營養構成的培養基僅保證培養物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調節物質，才能誘導細胞分裂、脫分化和再分化。第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日生長素類：1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內普遍存在，是生理活性最強的生長素。第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日生長素的生理作用1、促進細胞生長和細胞分裂。

2、誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力。

3、形成愈傷組織，促進生根。

4、與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側芽的萌發與生長、胚狀體的誘導。第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日細胞分裂素是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基氨基嘌呤。功能：1、促進細胞的分裂和分化2、誘導芽的分化3、促進側芽的萌發和生長4、抑制衰老第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日控制植物細胞分化：分裂素/生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件。比例高時——產生芽,比例低時——產生根。第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日赤霉素（GA3）生理作用：

1、誘導莖的細胞伸長，對矮生型植物恢復成高生型特別有效，對根無效。

2、對形成層的細胞分化有影響，往往同生長素有協同作用。IAA/GA比值高有利于木質部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。

3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發。

4、對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用。

注：不耐熱，應采用過濾滅菌加入。第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日脫落酸（ABA）生理作用：

1、抑制蛋白質的合成。

2、抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用。

3、誘導休眠、促進衰老和脫落。第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日以上四種生長調節物質，前兩類用的多，后兩類只是補充，對某些植物有利、對某些植物不僅沒有利，還有害，實際工作中要具體分析。

生長調節物質在生物體內存在甚微，濃度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日（5）有機附加物

①肌醇（環己六醇）

肌醇可以形成果膠物質，是細胞壁的構建物質另外還可以形成植酸，與陽離子結合或形成磷脂，參與細胞膜的組成。利于胚和芽的形成

②天然有機物

一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養，并表現出了良好的促進作用。

③AA類物質

絕大多數AA適量時對培養效果都有正象效應。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.1.2培養基的種類和配制MS培養基它是1962年由Murashige和Skoog為培養煙草細胞而設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩定的平衡溶液。其養分的數量和比例較合適，可滿足植物的營養和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養，效果良好。有些培養基是由它演變而來的。B5培養基是1968年由Galmborg等為培養大豆根細胞而設計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日White培養基是1943年由White為培養番茄根尖而設計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數量較低，適于生根培養。N6培養基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養而設計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養和其他組織培養。KM—8P培養基它是1974年為原生質體培養而設計的。其特點是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質融合的培養。第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（1）培養基的種類（根據無機鹽的濃度）：

①高無機鹽含量培養基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當，離子平衡性好，具有較強的緩沖性，養分數量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞及原生質體的培養。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養基。第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日②高硝態氮培養基

硝酸鉀含量高，氨態氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養。主要有B5、N6、SH培養基。第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日③中等無機鹽含量培養基

大量元素約為MS培養基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養，主要有Nitch，NT、H、Miller培養基。第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日④低無機鹽含量培養基

大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量相對也很低。多數用于生根培養基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日

根據培養物的培養過程，培養基分為初代培養基和繼代培養基。初代培養基是指用來第一次接種外植體的培養基。繼代培養基是指用來接種繼初代培養物的培養基。根據其作用不同，培養基分為誘導培養基、增殖培養基和生根培養基。第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日

根據其營養水平不同，培養基可分為基本培養基和完全培養基。基本培養基（就是通常稱呼的培養基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培養基就是基本培養基的基礎上，根據試驗的不同需要，附加一些物質，如生長調節物質和其他復雜有機物質等。第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日培養基的篩選：

1.無機營養成分：一般在現有培養基配方中選擇。可以參考前人的經驗，例如：MS是廣譜性培養基，N6用于單子葉植物的培養。豆科多用B5培養基。

2、植物生長調節劑：必須進行篩選試驗。總體原則-當誘導愈傷組織形成時，細胞分裂素和生長素相對平衡；誘導芽分化時，細胞分裂素水平應高于生長素，誘導根則要低。

3、有機成分要根據培養類型考慮，如進行器官和組織培養，一般不加復雜有機成分，而進行細胞和原生質體培養則要加。第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）培養基的配制

配制培養基前，為了使用方便和用量準確，常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物類和激素類分別配制成比培養基濃度大若干倍的母液。當配制培養基時，只需按預先計算好的量吸取母液稀釋即可。母液應保存在冰箱中備用，保存時間不可過長，當母液出現沉淀或霉菌團時，則不能使用。

貯備液（母液）的配制：

a、方便

b、準確（有些成分量太小）第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日培養基的配制步驟：1、計量

根據配制培養基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量ml=培養基中物質的含量（mg/L）×1000ml/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取醫用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫用瓷量杯中備用。注意（1）用量筒或移液管量取培養基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。

（2）量取母液時，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、稱取瓊脂蔗糖備用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。

6、調pH

用滴管吸取物質的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.4～7.0)測培養基的pH，一直到培養基的pH達到要求為止(在調制時要比目標pH值偏高0.2～0.5個單位，因為培養基在滅菌過程中由于糖等物質的降解，pH值會下降0.2～0.5個單位左右)。第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日7、分裝

溶化的培養基應該趁熱分裝。注意不要讓培養基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養基的代號。

9、培養基的滅菌第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2影響植物組織培養的環境條件

培養中溫度、光照、濕度等各種環境條件，培養基組成、pH值、滲透壓等各種化學環境條件都會影響組織。第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.1溫度培養都是在23～27℃之間進行，一般采用25±2℃。喜溫性植物：茄科、禾本科、蘭科等。培養溫度一般控制在26-28℃。冷涼性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培養溫度控制在18-22℃或<25℃。第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.2光照的影響培養中光照也是重要的條件之一，主要表現在光強、光質、以及光周期等方面：光周期：黑暗與光照交替的時間光量：光照強度光質：光的波長第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日1、光周期對植物細胞脫分化和再分化的效應

例1：黑暗中培養的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長，同經光照培養一樣的多。

例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根。

例3：對日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根。

結論：光周期的需要與否，應根據植物種類、培養的目的來決定。第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日離體培養中光周期的調節

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈傷組織誘導階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據植物種類不同做法不同，多數植物適合全暗或周期性光照。

器官發生階段：一般給予周期性光照比較好。第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、光量的影響

光照強度對培養細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植物體、細胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。

離體培養條件下常用的光量，一般為1000-4000lx（勒克斯）。離體培養中通常難以達到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照強度的高低直接影響器官分化的頻率。

高光量可以降低植物體內生長素水平，低光量使植物體內生長素素水平較高，容易生根。第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、光質的影響

光質對愈傷組織誘導，培養組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養，2周后，分化出愈傷組織。但在藍光下培養，幾周后才出現愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍光下培養首先出現芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。

離體培養條件下，一般用日光燈進行光照，光譜成分主要是藍紫光，波長為419-467nm。

對芽分化有效光譜成分為藍紫光，根分化則受600-680nm所刺激。第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.3濕度組織培養中濕度的影響有兩個方面：

一是培養容器內的濕度條件，容器內主要受培養基水分含量和封口材料的影響。

一是環境的濕度條件。環境的相對濕度一般要求70～80%。常用加濕器或經常灑水的方法來調節濕度。第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.4pH值不同的植物對培養基最適pH值的要求也是不同的，大多在左右，一般培養基皆要求5.8，這基本能適應大多數植物培養的需要。一般來說pH值高于6.5時，培養基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。因為高溫滅菌會降低pH值（約個pH值）因此在配制時常提高pH值單位。第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.5滲透壓培養基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細胞就不能生存。滲透壓調節物質

培養基各種物質中，糖對培養基滲透壓起決定性作用。因此調節滲透壓往往從調節糖濃度著手。糖除了作為滲透壓調節物質外，還是培養基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作為調節物質。第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.2.2.6氣體影響氧氣是培養中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養基干燥，夏季易引起污染。固體培養基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發根。培養室要經常換氣，改善室內的通氣狀況。液體振蕩培養時，要考慮振蕩的次數、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養基等。第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.3外植體的選擇及消毒

外植體的選擇

植物材料的消毒第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日外植體的選擇

外植體是指用于離體培養的活的植物組織、器官等材料。它是植物離體培養的基本材料。總體原則：

a.根據培養需求選擇植物部位。

b.多年生植物注意樹齡和季節。

c.在不影響培養目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體。

第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.3.1.1取材部位的選擇外植體選取合理與否，不僅影響培養的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型。1974年TranThanhVan等取煙草正在開花的植株的薄層表皮進行培養，結果不同部位的表皮外植體所形成的芽的類型不同。從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗容易成功。第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.3.1.2器官的發育階段和生理狀態外植體對誘導反應及其再生能力的影響體現在外植體的生理狀態上。總體來講，生理狀態年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細胞更有利于培養，但具體到不同的植物類型則有較大差異。因此，最好在植物生長的最適宜時期取材培養，會得到較好的結果。第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日4.3.1.3外植體的大小接種外植體的大小和形狀并不需要嚴格限制，但是不能太小，小到肉眼能見到的限度時，細胞分裂可能難以發生。故一般要求切塊的大小要適當。外植體細胞的數目多，能獲得愈傷組織的機會也多。研究表明：外植體的損傷表面積會分泌出某些物質，這些物質具有促進愈傷組織形成的能力，因此表面積越大，產生這類物質的數量也就越多，愈傷組織得率也越高。如果可取的組織不多，則外植體的體積應該盡可能小一些，從而得到較大數量的外植體。如利用莖尖培養，脫毒快繁，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養，胚齡也非常重要。第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日

植物材料的消毒

大田或溫室植物材料，都帶有大量的