醫藥行業病毒載體專題報告1.病毒載體：最常用的基因遞送載體之一1.1病毒載體是通過改造病毒來遞送基因的常用工具病毒載體是一種常用的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入其他細胞進行感染的分子機制。病毒是一種由核酸分子和蛋白質構成的非細胞形態生物，能夠攜帶基因進入受體細胞，經開發和改造后可用作CGT載體。由于病毒的多樣性及宿主機體的高度復雜性，目前僅腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、逆轉錄病毒和溶瘤病毒等少數種類可改造為CGT載體。經過改造且攜帶治療性基因的病毒，即重組病毒載體。通過改造后的病毒載體一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度，同時感染能力也得到了定向進化，從而具備了更快捷、更廣譜的轉導特性，以及更安全、更特異的感染特性。病毒載體可通過受體配體識別、細胞內吞等多種途徑進入細胞，并完成目的基因遞送。1.2病毒載體在基因治療和細胞治療產業有重要的地位在基因和細胞治療中，使用的載體可以分為病毒載體和非病毒載體；迄今為止，大多數基因療法利用病毒載體來傳遞目標基因。據SamanthaL.Ginn綜述文章的統計，在1989-2017年間基因治療的所有臨床試驗中，使用病毒載體的臨床占總數的67.3%。根據AnAnalysisOfTheGeneTherapyViralVectorLandscape，目前常用的病毒載體包括腺相關病毒（AAV）、慢病毒（LV）、仙臺病毒、腺病毒

（AdV）、逆轉錄病毒和溶瘤病毒等，相比于腺病毒和逆轉錄病毒來說，慢病毒載體和AAV載體安全性較好，二者在臨床試驗中使用的數量也越來越多。非病毒載體主要有脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒，外泌體等。該類載體具有低免疫原型、低成本、易規?；a等優點，但轉染效率、細胞毒性、靶向性等問題還有待解決。2.細胞治療與基因治療（CGT）高速發展，助力病毒載體生產行業爆發病毒載體是細胞治療與基因治療的重要物料，而伴隨著細胞治療和基因治療的高速發展，病毒載體生產行業正在迎來重大利好。2.1細胞治療和基因治療迎來高速發展期CGT行業正準備進入快速發展階段，2015-2020年臨床試驗數量復合年均增長率超60%。根據弗若斯特沙利文2021年發布的報告中國細胞與基因治療發展白皮書，中國CGT臨床試驗數量爆發式增長，數量僅次于美國，結合國家利好政策的推動，CGT行業將進入快速發展階段。自2015年開始，中國CGT療法的臨床試驗數量快速增長。2015年至2020年間，中國累計開展了約250項CGT臨床試驗，已成為數量僅次于美國的地區，復合年均增長率超過60%，位列全球第一。截至2021年6月，中國正在開展的CGT臨床試驗約100項，涉及大小公司約80家。CGT藥物全球商業化進程持續加快，在研CGT臨床試驗項目已近2000項。在技術、資本和政策的驅動下，全球CGT行業快速升溫，大量CGT藥物研發進入臨床階段，并自2015年起呈現爆發式增長。根據ASGCT（AmericanSocietyofGene+CellTherapy，美國權威的細胞和基因治療協會）的數據，截至2020年底，全球累計在研CGT臨床試驗超過1,300項，到2022年第一季度末已達到1,986項。根據弗若斯特沙利文的統計，全球CGT行業市場規模自2016年開始飛速增長，預計中國CGT行業市場規模在政策利好及研發投入增長的背景下也將快速擴增。2025年全球整體市場規?；蚩傻?05億美元（復合年均增長率71%），中國整體市場規模達29.5億美元（復合年均增長率276%）。2016年至2020年，全球CGT市場規模從0.5億美元增至20.8億美元，復合年均增長率約為153%。根據弗若斯特沙利文咨詢預測，未來CGT市場規模仍保持快速增長趨勢，預計于2025年全球整體市場規模為305.4億美元，2020年至2025年

（估計）全球CGT市場復合年均增長率約為71%。2016年至2020年，中國CGT市場規模從0.02億美元增至0.03億美元，復合年均增長率約為12%。根據弗若斯特沙利文咨詢預測，預測未來中國CGT市場規模仍保持快速增長趨勢，于2025年整體市場規模為25.9億美元，2020年至2025年（估計）中國CGT市場復合年均增長率約為276%。2.2病毒載體的生產對CDMO產業依賴度高病毒載體的生產是細胞與基因治療CDMO市場最為關鍵的細分領域之一。CGT公司約八成為初創公司，與基礎研究轉化聯系緊密，依賴CDMO提供產業化服務。根據ARM報告、弗若斯特沙利文分析，截至2020年12月31日，全球約500家CGT公司中，79.1%為初創公司；截至2021年7月20日，在中國CDE有產品臨床試驗公示的48家CGT公司中，75.0%為初創公司。CGT初創新藥企業在藥物開發、臨床申報至商業化生產過程中，由于受到工藝開發能力、GMP生產經驗、臨床申報相關法規知識的限制，更多依賴專業的CRO和CDMO。據和元生物招股書的數據，基因治療外包滲透率超過65%，遠超傳統生物制劑的35%。全球CGTCDMO行業處于快速發展階段。根據和元生物招股書的數據，2016年至2020年，全球CGTCDMO市場規模從7.7億美元增至17.2億美元，復合年均增長率達22.4%；預計到2025年，全球CGTCDMO市場規模將達到78.6億美元，2020年至2025年的復合年均增長率將上升至35.5%。預計到2027年，全球范圍內，歐美發達地區的CGTCDMO行業發展相對更為成熟，市場規模更大，行業格局更為成熟穩定；目前市場參與者主要包括Lonza、Catalent、OxfordBioMedica、藥明康德等巨頭。國內CGTCDMO行業經過近年的穩定增長，即將邁入高速發展階段。2018年至2022年，預計中國CDMO市場規模將從8.7億元增長到32.6億元，復合年均增長率達39.3%；預計到2027年，市場規模將增至197.4億元，2022年至2027年的預期復合年均增長率將高達43.3%。與歐美市場相比，當前國內CGTCDMO行業正處于發展初期，但近年來市場規?？焖贁U大，增長態勢良好。國內主要從事CGTCDMO業務的公司包括藥明康德子公司無錫生基醫藥、金斯瑞生物科技、博騰股份子公司博騰生物等。2.3病毒載體生產產能緊張，供不應求病毒載體生產產能緊張，供不應求。病毒載體外包率遠高于傳統生物制劑，而下游產品型企業往往需要較長的等待期。與此同時，病毒載體生產需要預留定金，這種在CDMO行業罕見的行為也顯示了其供不應求的狀態。Catalent和ThermoFisher都有在產能還沒釋放時收到客戶提前支付的產能預留定金的情況，這在傳統的CDMO行業中是從未存在過的。目前該領域存在較大未被滿足的產能需求。2015年發表在NCBI的一篇文章估計，病毒載體的生產能力需要增加1-2個數量級才能滿足最終的商業需求。盡管自2015年以來產能明顯增長，但自2015年以來飛快進展的臨床項目也極大地增加了產能的需求。3.當前使用最廣泛的兩種病毒載體：腺相關病毒(AAV)和慢病毒(LV)腺相關病毒(AAV)和慢病毒(LV)是當前使用最廣泛的兩種病毒載體，其中AAV常用于基因治療，LV常用于細胞治療。LV基因組長度為9kB，有更強的嗜性，能夠感染非分裂細胞，同時在安全性上較逆轉錄病毒(RV)更安全；AAV基因組長度為4.8kB，其宿主范圍極為廣泛，長時程基因表達，治療效果持久，同時其免疫原性極低，肝毒性低，但包裝容量小，感染到表達的時間比較長。3.1腺相關病毒載體：基因治療的萬金油，廣泛用于體內或全身基因治療3.1.1腺病毒載體1965年被發現，1995年第一次用于人類疾病治療腺相關病毒(AAV)最早于1965年首次在實驗室的腺病毒制劑中被發現，隨后科學家對其進行了多角度的研究。1982年成功完成了AAV2基因組的克隆以及測序工作。1995年，AAV載體首次用于治療人類的囊性纖維化病。進入21世紀后，科研人員發現了更多不同的AAV血清型家族，豐富了AAV載體的選擇范圍。2008年，科研人員在治療萊伯氏先天性黑蒙癥時利用了基于AAV載體的基因療法，獲得了良好的成果。2012年，第一個基于AAV用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥LPLD的基因治療藥物Glybera獲得了歐洲藥品管理局EMA的批準。5年后，治療由RPE65基因突變導致的遺傳性視網膜疾病的AAV基因治療產品Luxturna獲得美國食品藥品管理局FDA的批準。3.1.2腺相關病毒是一種安全性較高的細小病毒，通過整合到人類基因組中實現長期潛伏AAV屬于細小病毒科依賴性細小病毒屬，它由一個直徑約26nm的二十面體蛋白質衣殼和一個約4.8kb的單鏈DNA基因組組成，該基因組可以是正義鏈也可以是反義鏈。病毒衣殼由VP1、VP2和VP3三種亞基構成，三種亞基的比例為1：

1：10，共60份拷貝。目前的普遍共識是AAV病毒不會引起人類疾病，安全性非常高。在人類細胞中，AAV基因組可以整合到一個被稱為AAVS1的基因組位點從而實現長期潛伏。這一現象的部分原因是AAVS1位點的序列和ITR的序列有很大的相似性，位點的插入同樣需要rep基因編碼蛋白的活性，缺乏rep基因的重組AAV載體的基因組整合效率會大大降低。純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細胞，侵染細胞時，AAV與細胞表面特異性受體結合，激活胞內信號通路，進而觸發AAV通過受體介導的內吞作用進入細胞，在核內體、高爾基體等細胞器的協助下進入細胞核，隨后病毒裂解，其單鏈DNA需復制成為雙鏈DNA后表達目的基因。3.1.3AAV載體改造策略：分型發現、設計及修飾為了將野生型AAV變成適合體內基因遞送的重組型AAV載體，研究人員對其進行了一系列的遺傳改造。重組型AAV載體的病毒衣殼依然沿用野生型AAV的序列與構造，如完全剔除了rep基因和cap基因，僅僅保留有了負責引導病毒載體基因組復制和包裝的ITRs序列。與野生型AAV相比，這種改造在很大程度上提高了AAV載體的裝載量并極大程度上降低了體內免疫原性和毒性。與AAV載體復制和裝配相關的rep、cap基因元件以及腺病毒輔助基因元件被分別克隆到其它質粒載體上，這樣的設計允許利用多質粒瞬轉系統大量制備科研或者臨床級別的重組AAV載體產品。3.1.4AAV載體的優勢與面臨的挑戰AAV載體具有器官靶向性、安全性高以及長效性等優點，但同時存在包裝容量小、感染到表達的時間比較長等缺點。重組的AAV2血清型病毒載體仍然處于主流位置。從2003-2019年的144項披露了AAV病毒衣殼數據的臨床試驗中分析發現，重組的AAV2血清型仍然處于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性證據，截至2019年末已經有超過40項使用AAV2病毒載體的臨床試驗完成全部流程。利用組織特異性啟動子實現組織特異性表達成為新趨勢。從104項披露了啟動子數據的臨床試驗中分析發現，像CBA、CAG和CMV等泛表達類的啟動子依然受到研究者的廣泛青睞，而在2015-2019年間，超過25項臨床試驗使用了組織特異性啟動子來實現特定組織的表達，例如白蛋白啟動子和突觸蛋白啟動子等。3.1.5基于AAV載體的基因治療臨床試驗數量猛增截至2022年6月，在ClinicalT上登記了239項以AAV為載體的基因治療臨床試驗。2016年-2022年6月，臨床以AAV為載體的基因治療試驗數量增長迅猛，從2016年的不足10個增至2018年11月的145個，再到2022年6月進一步提升至239個。盡管臨床試驗中所用最多的是基于AAV2血清型的載體，但是新的血清型如AAV8、AAV9也在不斷被用于臨床試驗。大多臨床試驗通過進行I/II期合并臨床試驗以加速研發進程。以AAV為載體的基因治療主要靶向眼、肝、肌肉和腦部，其中尤以靶向眼部疾病的臨床試驗數量為多，占比約21%。3.1.6AAV載體生產方式主要有三種，基于Sf9細胞的桿狀病毒表達載體系統是實現大規模生產的重要方法在AAV載體的生產中，目前主流的方法主要有三種：1、基于HEK293細胞的三質粒轉染系統；2、哺乳動物穩定細胞系；3、基于夜蛾昆蟲細胞(Sf9)的桿狀病毒表達載體系統。1、HEK293三質粒共轉染工藝的方法是研究級與臨床前使用的AAV載體的主要生產方式；HEK293三質粒轉染中的質粒分別有：含ITRs和目的基因的順式質粒、含rep和cap基因的反式質粒、提供E2a/b、E4和VARNA基因的Ad輔助質粒三種質粒，共轉染HEK293細胞（表達E1a和E1b基因）來生產AAV載體。此方法中細胞通常以半貼壁的方式培養，在轉染后2-3天達到最高生產力，隨著時間的推移失去活力。2、哺乳動物穩定細胞系：上世紀90年代，Clark等人將rep/cap和AAV載體基因組克隆到表達質粒中，并使其穩定感染Hela細胞，首次建立了基于Hela的生產細胞系。近來開發的混合rAAV/rAd載體，將轉基因載體和腺病毒元件同時遞送，從而使穩定整合的AAV基因在Hela細胞系中獲得rep-cap的高表達。穩定細胞系生產可以消除常規生產中的外來輔助污染物（如外源性病毒、質粒污染物等）。但是穩轉株內的基因產物可能組裝成雜質，造成潛在的安全隱患。3、桿狀病毒/Sf9系統是在錐體夜蛾昆蟲細胞(Sf9)中使用桿狀病毒表達載體(BEV)來生產AAV病毒載體。該方法是利用攜帶AAV載體基因組的BEV感染Sf9細胞。由于桿狀病毒具有輔助功能，BEV系統與Sf9細胞系結合可以穩定表達，用于高滴度的大規模載體生產。3.2慢病毒載體：體外基因修飾細胞治療（含CAR-T療法）最常用的載體3.2.1慢病毒載體是基因治療和CAR-T細胞治療的重要物料慢病毒載體（LVs）是傳遞遺傳物質最常用的轉移載體之一，也是改造造血細胞以糾正原發性免疫缺陷、血紅蛋白病和白血病的首選載體。慢病毒載體也被廣泛用于修改T細胞以通過免疫療法治療癌癥（如嵌合抗原受體T細胞療法，CART）。在基因組編輯中，LV被用來傳遞序列特異性設計核酸酶和DNA模板。3.2.2LVs載體的前身是HIV-1，具有免疫原性低、安全性高等多重優點慢病毒（Lentivirus）載體是一種單鏈RNA病毒，是以人類免疫缺陷型病毒

（HIV）為基礎發展起來的CGT載體，能夠感染分裂和非分裂細胞。慢病毒可以將外源片段隨機插入細胞基因組，因此可以在體內長期表達目的基因，同時慢病毒載體具有表達時間長、安全性高等優點，是重要的基因操作工具。慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續且穩定，并隨細胞基因組的分裂而分裂。3.2.3四質粒共轉染工藝是LV載體生產的最常用方式，穩定轉染生產細胞系可能是未來工業大規模連續過程的理想系統HIV維持生存的基本基因包括gag、pol和env基因；gag編碼結構蛋白，pol編碼逆轉錄酶和整合酶，env編碼病毒包膜糖蛋白。LV的構建基于野生型HIV-1病毒。為了避免有復制能力病毒（RCV）的產生，在構建HIV-1型病毒載體時一般將HIV-1基因組分裝于幾個質粒載體中，再共轉染細胞，然后獲得只有一次感染能力而無復制能力的HIV-1載體顆粒。四質粒共轉染工藝（第三代系統）是目前用于研發和臨床的最多的系統。該系統由1個包含目的基因的表達質粒、2個包裝質粒、1個包膜蛋白質粒，共4個質粒組成。包裝構建體在此系統中被進一步拆分，gag-pro-pol和rev基因被分離在兩個獨立的質粒中。包膜蛋白質粒使用水皰性口炎病毒的糖蛋白G基因（VSVG）替代了病毒原有的env基因。應用了VSV-G包膜的假構型慢病毒載體，擴大了載體的靶細胞嗜性范圍，同時也增加了載體的穩定性。四質粒包裝系統，極大地降低了產生具有復制能力慢病毒的可能性，而VSV-G蛋白的使用也降低了這種重組的可能性。更新的第四代系統通過密碼子優化，對rev蛋白（促進晚期基因轉錄的因子）的需求也被取消。但是滴度較低，應用尚少。穩定包裝細胞系提供了可重復的和可擴展的生產過程，同時降低了成本，且由于降低了病毒表達載體之間的重組概率，生產的安全性也得到了提升。其可擴展性還可以適應無血清懸浮培養體系。所以在慢病毒生產中穩定包裝細胞系的應用是要優于瞬時轉染系統的，雖然建立慢病毒生產穩定細胞系也存在諸多困難，特別是一些病毒蛋白對細胞具有顯著毒性，但這依然是行業未來發展的一個重要方向。4.病毒載體的生產工藝復雜，擴大培養與純化是難點4.1病毒載體生產工藝總覽病毒載體生產分為上游（生產）工藝（USP）和下游（純化）工藝（DSP）；

上游生產工藝包括：細胞復蘇→細胞擴增→接種、轉染、誘導→收獲；

下游包括：純化→濃縮→制劑→灌裝、包裝；4.2上游工藝之細胞擴增培養——成熟貼壁培養與前景廣闊的懸浮培養在細胞擴增培養方面，目前廣泛使用的是從實驗室研究中沿襲下來的細胞貼壁培養技術，被用于生產大約70%的病毒載體產品。AAV和LV載體生產最常用的是使用貼壁培養的人胚胎HEK293細胞。在貼壁細胞培養中，細胞以單層形式附著在基質上生長。而在懸浮細胞培養中，細胞在培養基中自由漂浮。貼壁培養常常被用于生產小劑量的病毒，操作簡單，可滿足部分工業需求。但是在大規模生產中也有處理復雜、容易污染、培養條件控制與檢測困難等問題。微載體培養技術在一定程度上解決了貼壁細胞的部分缺點，工藝放大相對容易。而懸浮無血清細胞培養系統，使得AAV生產的工藝放大更為容易，為AAV下游純化減少了負擔。4.3上游關鍵工藝之轉染——高效的瞬時轉染與長期性的穩定轉染轉染是指是將目的基因轉染至特定哺乳動物細胞內的方法。目前工業生產中的轉染方式主要有瞬時轉染與穩定轉染兩種。瞬時轉染中，外源基因并沒有轉染到細胞的染色體上而是存在于游離的載體上，這樣可以在短時間內獲得基因的表達產物，但是隨著細胞的不斷分裂增殖外源基因最終會丟失，無法繼續進行重組蛋白的生產；而利用細胞穩定轉染則會將外源基因轉染至細胞染色體上，目的基因不會隨著細胞傳代而消失，穩定轉染的細胞株能夠長期穩定的生產目的蛋白。瞬時轉染和穩定轉染各有優缺點，需要按照實際場景而使用：

瞬時轉染多用于貼壁細胞系，而穩定轉染多用于懸浮細胞系。大部分瞬時轉染載體的生產使用貼壁性細胞系，其中所選培養容器需要有利于它們附著、生長和生產病毒載體的表面。而穩定生產的細胞系通常是適應懸浮的細胞系，不需要基質附著、生長和生產病毒載體。因此，需要在臨床開發的早期就要確定CGT所需的目標劑量和患者群體，以指導選擇最優載體生產平臺，從而滿足未來的商業化需求。瞬時轉染工藝成熟，使用廣泛；與穩定的生產細胞系相比，基于瞬時轉染的病毒生產相關的工藝開發時間相對較短，生物制藥行業已經有多家成熟的供應商，擁有高效瞬時轉染類載體生產需要的各種工具。同時可保持長期穩定生產的穩定轉染工藝也逐步被產業重視。使用穩定的生產細胞系的載體生產方法雖然相對較新，不過其有很大潛力可支撐行業不斷增長的產量需求。4.4除雜提純是下游工藝的關鍵（1）下游純化工藝的一般過程。下游純化工藝方案通常采用相似的工作流程：

①澄清步驟（由于收獲時需進行細胞裂解，可能需要額外進行深層過濾）②純化步驟（通常采用離子交換法或親和層析法）③精純步驟（額外的層析法步驟/尺寸排阻）。（2）控制污染物與雜質是下游工藝的核心關注點。下游純化所面臨的主要挑戰是：如何在最大程度提高產量的同時，滿足產品與雜質的質量規范。去除產品中的污染物，將其雜質控制在監管標準許可的范圍之內，是下游工藝最關注的技術細節。4.5下游工藝改進依然存在諸多潛力點（1）細胞裂解是從細胞中釋放病毒載體的重要環節，目前主要使用的是機械裂解和化學裂解，前者會導致產品損失，后者使用的細胞破膜劑存在安全性問題，新的細胞裂解方法的開發對于工藝優化意義重大。（2）過濾：過濾是AAV下游處理中最昂貴的單元操作。過濾過程中的大滯留量和產品損失是一個棘手的問題。如何優化過濾器以實現高通量回收是工藝優化中的一大挑戰，連續過濾技術或可提供優化方案。（3）平臺純化：由于缺乏穩健的純化過程，目前的下游操作導致病毒回收率非常低。且對于不同亞型的AAV需要不同的純化方法，提高了平臺的復雜性。行業需要一種平臺純化工藝，可用于各種病毒載體，并盡量減少純化過程中的操作步驟。同時選擇性捕獲雜質的新型樹脂也將極大地有助于獲得高純度產品。（4）安全且高效地分離空衣殼的方法是下游工藝改進的一大重點。載體生產過程中會產生空衣殼?？找職た赡軙绊慉AV載體產品的功效和安全性，是最終產成品中需要去除的雜質。但空衣殼與完整衣殼具有相似的大小及電荷量，分離仍具有挑戰性。兩種廣泛使用的分離方法是氯化銫和陰離子交換色譜法(AEX)。但依然有會產生刺激性物質，擴展性差，工藝難度大等問題。5.病毒載體生產成本及拆分—價值千金的質粒DNAAAV載體與LV載體的生產均有多種基于不同反應容器的生產工藝，不同工藝的成本構成存在一定的差異，使得在不同的生產規模下，成本最低的路線不盡相同。一般而言，生產規模越大，原材料成本占比越高。另外，常用的兩種病毒載體的生產原料均包括質粒DNA（三質粒/四質粒共轉染工藝等），而且質粒DNA在生產成本中是占比最高的原料，符合GMP要求的質粒DNA價格達每克數萬美元，在商業化生產規模下在不同工藝中占生產成本的18%-46%。5.1質粒質粒是基因工程中最常見的DNA載體工具，是一種小型環狀DNA分子，常見于原核細菌和真菌內，可以獨立于宿主染色體進行自主復制、并穩定遺傳所攜帶的遺傳信息。質粒大小一般為1kb-20kb，可以置換或插入外源DNA將目的基因帶入宿主細胞，而且因為宿主原核細菌生長快，可以快速擴增。5.1.1用途廣泛，身兼數職隨著細胞與基因治療的崛起，研發管線數量迅速擴增，對質粒DNA的需求量急劇增加，同時對質粒質量提出了更高的要求。根據在CGT中的用途，質粒DNA可以分為藥物活性成分和藥物生產原料兩類。質粒是病毒載體生產的關鍵原料，涉及病毒載體的實驗室研究、藥物臨床試驗的質粒需求量一般在毫克級，商業化生產的需求量則為克級。以AAV載體生產為例，根據文獻研究，在最佳質粒—宿主細胞比例下，1.6μg的質粒在懸浮反應體系中生產的AAV載體滴度最高達到了7.64*109vg/ml（gc/ml等同于vg/ml，即VectorGenomespermL），對應2.3*1011vg的AAV載體。一般基因治療的劑量單位為1014vg，已獲批上市的基因治療藥物ZOLGENSMA用量為1.1*1014vg/kg，以此為基準則一單位劑量的基因治療產品約需要0.8mg的質粒DNA。5.1.2質粒大規模商業化生產具有較高壁壘目前質粒DNA的生產一般基于大型不銹鋼生物反應器中使用大腸桿菌發酵的方法，盡管質粒的GMP生產技術相對成熟，但商業化大規模生產仍具有較高的技術壁壘。質粒生產流程涉及質粒構建、菌株庫構建、發酵及純化等多個步驟，生產流程長、過程復雜難控、容錯率低，操作不當會使得整批產品報廢。上游發酵生產中的工藝參數如培養基成分、溫度、PH、接種密度、補料速度、生長速率等均需嚴格控制，此外GMP生產對于最終質粒產品的內毒素含量、DNA雜質等含量均有嚴格規定。整體而言，質粒DNA的大規模商業化生產對工藝水平、生產能力等有較高的要求。5.1.3質粒DNA外包生產行業內代表公司在質粒外包生產領域，國內代表公司有金斯瑞、藥明生基、博騰生物、和元生物等。5.2AAV載體AAV的上游生產工藝包括傳統的基于多層托盤的貼壁工藝（MT）與基于懸浮工藝的攪拌生物反應器及固定床生物反應器，有研究對上述三種生產裝置在200L1000L生產規模下的的成本進行了計算和比較。結果顯示，在生產規模為200L時，單批可生產12單位劑量的AAV載體（單位劑量為1014vg，對應年產能600劑），貼壁工藝和懸浮工藝的單位劑量成本（包括上游和下游步驟）沒有差別，均為2.5萬美元，而固定床工藝單位成本為2.1萬美元。當生產規模提升到1000L（對應一批次60劑，滿產一年約3000劑）時，貼壁工藝為1.5萬美元，懸浮工藝為1.2萬美元，固定床工藝為0.8萬美元。進一步的支出分析表明，懸浮和固定床工藝的資本和勞動力成本相當，而貼壁工藝的成本在臨床規模（200L）上與懸浮和固定床工藝接近。當生產規模達到1000L時，貼壁工藝的勞動力成本會顯著上升，而懸浮及固定床工藝幾乎沒有變化?？傮w而言，若使用基于一次性耗材的固定床工藝代替懸浮工藝，可以使得生物反應器的USP運營費用降低30%至40%，生物反應器的占地面積也可減少60%。5.3LVs載體有研究對比分析了若干種制備慢病毒載體在不同生產規模下的生產成本，工藝包括多層容器（標準的十層容器CF10）、中空纖維反應器（HF）、微載體生物反應器（RMmc）、一次性攪拌罐生物反應器（SUB）、固定床生物反應器（FB），上述五種生產工藝均符合cGMP標準，其中基于一次性攪拌罐生物反應器的生產工藝在各種場景的生產規模中下單位成本均為最低，其次是微載體生物反應器和固定床生物反應器，多層容器和中空纖維反應器由于上游生產過程中一次性組件價格昂貴，導致其成本最高。對原材料成本進一步拆分顯示，在產量為1000劑/年的(2×109TU/劑)的情況下，對于多層容器（CF10）和纖維反應器（HF）這類生產規模小（L級）、多應用于實驗室、臨床研究等場景的工藝而言，USP一次性組件成本占主導地位

（多層容器為34%，纖維反應器為82%）。而對于固定床（FB333）、微載體

（RMmc600）及攪拌罐（SUB500）生物反應器等生產規模更大（可擴展至百L級）、更適用于載體商業化生產的工藝而言，質粒DNA的成本占比最高，占比分別為41%、46%和36%。6.病毒載體相關產業監管日趨完善，多項利好政策密集出臺6.1病毒載體生產受藥監局與衛健委監管，從準入、研發、注冊、生產到上市的全流程具有完整的規范標準，準入門檻高病毒載體生產所在的CGT研發和生產外包服務行業屬于國家發改委頒布的產業結構調整