第三章植物組織器官培養第三章植物組織器官培養1第四節植物胚乳培養一、胚乳培養（Endospermculture）

是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養，使其發育成完整植株的技術。第四節植物胚乳培養一、胚乳培養（Endospermcul2胚乳在被子植物中是雙受精的產物，由極核和雄配子結合成的三倍體組織。而裸子植物胚乳在受精前形成，為單倍體。僅40多種植物進行胚乳培養研究，20種獲得再生植株，如獼猴桃等。多存在混倍現象。胚乳在被子植物中是雙受精的產物，由極核和雄配子結合成的三3二、胚乳培養的意義獲得三倍體植株，用于育種利用。三倍體植株具有營養體大，無籽等特點。如無籽西瓜。胚乳培養也會產生較多的混倍體，可為育種提供豐富的不同倍性的材料，具有重要意義。二、胚乳培養的意義獲得三倍體植株，用于育種利用。三倍體植株4三、胚乳培養的方法1.取材與接種取合適發育時期的幼果（細胞型期）→常規消毒→在無菌條件下切開果實→取出種子→分離出胚乳→接種2.常用基本培養基:MS、White，B5，MT激素組合根據培養材料而定三、胚乳培養的方法1.取材與接種取合適發育時期的幼果（5一、概念 指將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來，進行無菌培養，并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內實現受精的技術。第五節植物離體授粉一、概念第五節植物離體授粉61、雌蕊離體授粉2、離體子房授粉3、胚珠離體授粉二、離體授粉類型1、雌蕊離體授粉二、離體授粉類型7

離體授粉3種方式示意圖(引自Razdan，1993)

離體授粉3種方式示意圖(引自Razdan，1993)8三、離體授粉的意義 可以克服遠緣雜交中的不親和性，特別是離體子房授粉和離體胚珠授粉，能消除受精不育障礙或雜種胚不能發育成熟等問題。三、離體授粉的意義9造成受精障礙的因素包括：①花粉在柱頭上不能萌發；②花粉管不能進入胚珠，造成這種現象的原因或是由于花柱太長，或是由于花粉管生長速度太慢，還沒長到花柱基部子房已經脫落；③花粉管在花柱中破裂。以上這些都屬于受精前障礙（合子期前障礙）。在另外一些情況下，即使受精能正常進行，但由于胚和胚乳之間的不親合性或胚乳發育不良，雜種胚不能發育成熟。這是屬于受精后障礙。造成受精障礙的因素包括：①花粉在柱頭上不能萌發；②花粉管不能10四、離體授粉的方法1、胚珠試管受精操作方法：①取胚珠②人工受精2、子房離體授粉操作方法：①直接引入法②注射法3、雌蕊離體授粉四、離體授粉的方法11五、離體授粉的程序1、確定開花、花藥開裂及授粉時間2、去雄后將花蕾套袋隔離3、制備無菌子房或胚珠4、制備無菌花粉5、胚珠或子房的試管內授粉五、離體授粉的程序12六、影響離體授粉的因素 1、外植體的發育階段 2、花粉粒數量及萌發力 3、營養及環境條件4、授粉方式5、保留母體組織的影響6、基因型的影響7、培養前預處理的影響

六、影響離體授粉的因素13種子seed裸子植物和被子植物特有的繁殖體由胚珠經過傳粉受精形成上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@第六節人工種子種子seed裸子植物和被子植物特有的繁殖體上海海洋大學細胞14種皮保護作用胚乳為發育中的胚提供營養胚發育成新的植物體上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@種皮上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@shou15一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細胞種子，是指將植物離體培養的胚狀體或芽包裹在含有養分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細胞種子，是指將16人工種子www.agr.hokudai.ac.jp不定胚形成人工種子www.brs.nihon-u.ac.jp人工種子大量生產kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp人工種子結構示意圖人工種子www.agr.hokudai.ac.jp不定胚形17半夏人工種子上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@半夏人工種子上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@18二、人工種子的意義（1）可對一些自然條件下不結實的或種子很昂貴的植物進行繁殖。（2）固定雜種優勢，使F1雜交種可多代利用，使優良的單株能快速繁殖成無性系品種，從而大大縮短育種年限。（3）節約糧食。（4）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調節物質、菌肥、農藥等，可人為地影響控制作物生長發育和抗性。(5)可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長期營養繁殖所積累的病毒病等。(6)與試管苗相比成本低，運輸方便(體積小)，可直接播種和機械化操作。二、人工種子的意義（1）可對一些自然條件下不結實的或種子很昂19人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內容。

1、高質量和高產量的體細胞胚誘導與同步化控制體細胞胚的誘導與同步化控制方法：

三、人工種子的制作程序人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚20體細胞胚誘導與同步化控制

體細胞胚誘導與同步化控制21a成熟的體細胞胚；b用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚c帶體細胞胚的液滴滴入2％CaCl2溶液后形成的白色半透明的包埋丸；d人工種皮包埋制成的人工種子人工種子的制備a成熟的體細胞胚；b用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚22苜蓿體細胞胚的生產與植株的獲得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm

苜蓿體細胞胚的生產與植株的獲得www.plant.uogue232、人工種子包埋獲得發育正常、形態上較為一致的體細胞胚后，就要用適合的材料進行包埋。進行包埋時應做到以下幾點：（1）包埋材料必須對體細胞胚無損害和無毒性，并能保護胚和胚發芽的能力；（2）同時在制造、貯藏、運輸和種植過程中必須具有耐久性；（3）膠囊必須含有養分和植物激素以及植物生長和發育所需的成分和水分，并要求制作的人工種子適合于農業機械化播種。2、人工種子包埋243包埋方法：經研究認為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。（1）滴注法制備人工種子是將選擇好的體細胞胚懸浮于含2%～3%的藻酸鈉溶液中，然后用一個塑料吸管吸注含體細胞胚的藻酸鈉懸滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，這時離子間發生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細胞胚的大小和發芽能力而定，一般采用吸管口徑為3－4mm，可得直徑為4－5mm的膠囊。體細胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發。至于聚合時間長短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在2％－3%，在CaCl2中停留時間不要超過10min，以免膠囊太硬而影響發芽。形成膠囊后轉入無菌水中沖洗，最后在1/2MS培養基上作發芽和轉換試驗或進一步包裹人工種皮。3包埋方法：（1）滴注法25滴注法滴注法26人工種子包埋過程示意圖人工種子包埋過程示意圖27（2）裝膜法制備人工種子是把體細胞胚混合到一個溫度較高的膠液中，然后滴注到一個有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變為凝膠而形成膠丸。（2）裝膜法284、人工種皮的研制美國杜邦公司生產的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質共聚的產物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果。4、人工種皮的研制291、人工種子轉換定義**轉換（Transformation）指人工種子在一定條件下，萌發、生長、形成完整植株的過程。2、轉換方法**轉換的方法可分為無菌條件下的轉換和土壤條件下的轉換。5、人工種子的轉換試驗1、人工種子轉換定義5、人工種子的轉換試驗30（1）、無菌條件的轉換：其也稱離體條件的轉換。一般是將新制成的人工種子播種在1/4MS培養基，附加1.5%麥芽糖、8g/L的瓊脂中，培養后統計人工種子形成完整植株的數目，即人工種子的轉化率。（2）、無菌條件轉換率的高低主要取決于：（a）、對提高體細胞胚質量的培養基成分的研究；（b）、改進轉換條件的研究。如麥芽糖代替蔗糖，有利于體細胞胚的萌發和轉換。（1）、無菌條件的轉換：其也稱離體條件的轉換。一般是將新制成31（3）、土壤條件的轉換：也稱活體條件下的轉換。人工種子真正目的是直接播種于土壤，即在活體條件下，使轉換成功。（4）土壤條件下轉換采用方法：a、無土培養試驗：目前以蛭石或珍珠巖試驗較多，附加低濃度無機鹽，1/6的MS培養基，0.75%麥芽糖有利于轉換。b、土壤試驗：人工種子的土壤轉化試驗報道較少。苜蓿人工種子的直接土壤轉化試驗已達20%，水稻不定芽研制的人工種子經適當地過渡性培養，在土壤中的轉化率為10%。（5）、土壤條件的轉換人工種子轉化率低的主要限制因子a、研究無機鹽在轉換中的重要性時表明，沒有硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣時就不會發生轉換，缺乏磷酸銨，轉化率從30%降至5%。顯然這些無機鹽成分作為人工種子營養肥料是不可缺少的。b、0.75％（W/V）的麥芽糖有利于提高轉化率。因此推測，碳源在人工種子轉換中也是限制因子。因此，必須在人工種子中貯藏必需的養分或供給外源營養物質。（3）、土壤條件的轉換：也稱活體條件下的轉換。人工種子真正目321、人工種子的應用目前存在的問題（1）許多有價值的基因作物，特別是那些不易獲得種子和自然增殖率極低的植物，目前尚未顯示出較好的體細胞胚發生能力，或胚的生活力差；（2）有些作物雖然可以誘導出體細胞胚，但胚胎發生機制研究不夠，而且同步化等技術尚未解決，因而難以達到大量控制同步化的目的；（3）人工種子的成本遠高于自然種子；（4）人工種子貯藏、運輸和加工以及機械化播種，尚未完全解決，許多問題尚待進一步研究和探索。四、人工種子應用前景1、人工種子的應用目前存在的問題四、人工種子應用前景332、人工種子應用應該考慮哪些方面要想人工種子技術得到應用：（1）首先應考慮該作物的價值；（2）要考慮那些很難獲得種子，而且自然增殖率極低的植物。例如：多年生名貴藥材，高質量的木材和橡膠樹或優質果樹以及珍惜瀕危植物等。3、人工種子發展前景（1）人工種子的發展前景是客觀的（2）它將是農業中一種革命性的繁殖系統（3）相信該技術會得到逐步完善，建立多種模式來研制人工種子，并逐步擴大應用范圍。2、人工種子應用應該考慮哪些方面34第三章植物組織器官培養[課件]]35第三章植物組織器官培養[課件]]36第三章植物組織器官培養[課件]]37第三章植物組織器官培養[課件]]38第三章植物組織器官培養[課件]]39第三章植物組織器官培養[課件]]40第三章植物組織器官培養[課件]]41

第三章植物組織器官培養第三章植物組織器官培養42第四節植物胚乳培養一、胚乳培養（Endospermculture）

是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養，使其發育成完整植株的技術。第四節植物胚乳培養一、胚乳培養（Endospermcul43胚乳在被子植物中是雙受精的產物，由極核和雄配子結合成的三倍體組織。而裸子植物胚乳在受精前形成，為單倍體。僅40多種植物進行胚乳培養研究，20種獲得再生植株，如獼猴桃等。多存在混倍現象。胚乳在被子植物中是雙受精的產物，由極核和雄配子結合成的三44二、胚乳培養的意義獲得三倍體植株，用于育種利用。三倍體植株具有營養體大，無籽等特點。如無籽西瓜。胚乳培養也會產生較多的混倍體，可為育種提供豐富的不同倍性的材料，具有重要意義。二、胚乳培養的意義獲得三倍體植株，用于育種利用。三倍體植株45三、胚乳培養的方法1.取材與接種取合適發育時期的幼果（細胞型期）→常規消毒→在無菌條件下切開果實→取出種子→分離出胚乳→接種2.常用基本培養基:MS、White，B5，MT激素組合根據培養材料而定三、胚乳培養的方法1.取材與接種取合適發育時期的幼果（46一、概念 指將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來，進行無菌培養，并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內實現受精的技術。第五節植物離體授粉一、概念第五節植物離體授粉471、雌蕊離體授粉2、離體子房授粉3、胚珠離體授粉二、離體授粉類型1、雌蕊離體授粉二、離體授粉類型48

離體授粉3種方式示意圖(引自Razdan，1993)

離體授粉3種方式示意圖(引自Razdan，1993)49三、離體授粉的意義 可以克服遠緣雜交中的不親和性，特別是離體子房授粉和離體胚珠授粉，能消除受精不育障礙或雜種胚不能發育成熟等問題。三、離體授粉的意義50造成受精障礙的因素包括：①花粉在柱頭上不能萌發；②花粉管不能進入胚珠，造成這種現象的原因或是由于花柱太長，或是由于花粉管生長速度太慢，還沒長到花柱基部子房已經脫落；③花粉管在花柱中破裂。以上這些都屬于受精前障礙（合子期前障礙）。在另外一些情況下，即使受精能正常進行，但由于胚和胚乳之間的不親合性或胚乳發育不良，雜種胚不能發育成熟。這是屬于受精后障礙。造成受精障礙的因素包括：①花粉在柱頭上不能萌發；②花粉管不能51四、離體授粉的方法1、胚珠試管受精操作方法：①取胚珠②人工受精2、子房離體授粉操作方法：①直接引入法②注射法3、雌蕊離體授粉四、離體授粉的方法52五、離體授粉的程序1、確定開花、花藥開裂及授粉時間2、去雄后將花蕾套袋隔離3、制備無菌子房或胚珠4、制備無菌花粉5、胚珠或子房的試管內授粉五、離體授粉的程序53六、影響離體授粉的因素 1、外植體的發育階段 2、花粉粒數量及萌發力 3、營養及環境條件4、授粉方式5、保留母體組織的影響6、基因型的影響7、培養前預處理的影響

六、影響離體授粉的因素54種子seed裸子植物和被子植物特有的繁殖體由胚珠經過傳粉受精形成上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@第六節人工種子種子seed裸子植物和被子植物特有的繁殖體上海海洋大學細胞55種皮保護作用胚乳為發育中的胚提供營養胚發育成新的植物體上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@種皮上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@shou56一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細胞種子，是指將植物離體培養的胚狀體或芽包裹在含有養分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細胞種子，是指將57人工種子www.agr.hokudai.ac.jp不定胚形成人工種子www.brs.nihon-u.ac.jp人工種子大量生產kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp人工種子結構示意圖人工種子www.agr.hokudai.ac.jp不定胚形58半夏人工種子上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@半夏人工種子上海海洋大學細胞工程黃林彬lbhuang@59二、人工種子的意義（1）可對一些自然條件下不結實的或種子很昂貴的植物進行繁殖。（2）固定雜種優勢，使F1雜交種可多代利用，使優良的單株能快速繁殖成無性系品種，從而大大縮短育種年限。（3）節約糧食。（4）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調節物質、菌肥、農藥等，可人為地影響控制作物生長發育和抗性。(5)可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長期營養繁殖所積累的病毒病等。(6)與試管苗相比成本低，運輸方便(體積小)，可直接播種和機械化操作。二、人工種子的意義（1）可對一些自然條件下不結實的或種子很昂60人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內容。

1、高質量和高產量的體細胞胚誘導與同步化控制體細胞胚的誘導與同步化控制方法：

三、人工種子的制作程序人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚61體細胞胚誘導與同步化控制

體細胞胚誘導與同步化控制62a成熟的體細胞胚；b用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚c帶體細胞胚的液滴滴入2％CaCl2溶液后形成的白色半透明的包埋丸；d人工種皮包埋制成的人工種子人工種子的制備a成熟的體細胞胚；b用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚63苜蓿體細胞胚的生產與植株的獲得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm

苜蓿體細胞胚的生產與植株的獲得www.plant.uogue642、人工種子包埋獲得發育正常、形態上較為一致的體細胞胚后，就要用適合的材料進行包埋。進行包埋時應做到以下幾點：（1）包埋材料必須對體細胞胚無損害和無毒性，并能保護胚和胚發芽的能力；（2）同時在制造、貯藏、運輸和種植過程中必須具有耐久性；（3）膠囊必須含有養分和植物激素以及植物生長和發育所需的成分和水分，并要求制作的人工種子適合于農業機械化播種。2、人工種子包埋653包埋方法：經研究認為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。（1）滴注法制備人工種子是將選擇好的體細胞胚懸浮于含2%～3%的藻酸鈉溶液中，然后用一個塑料吸管吸注含體細胞胚的藻酸鈉懸滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，這時離子間發生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細胞胚的大小和發芽能力而定，一般采用吸管口徑為3－4mm，可得直徑為4－5mm的膠囊。體細胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發。至于聚合時間長短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在2％－3%，在CaCl2中停留時間不要超過10min，以免膠囊太硬而影響發芽。形成膠囊后轉入無菌水中沖洗，最后在1/2MS培養基上作發芽和轉換試驗或進一步包裹人工種皮。3包埋方法：（1）滴注法66滴注法滴注法67人工種子包埋過程示意圖人工種子包埋過程示意圖68（2）裝膜法制備人工種子是把體細胞胚混合到一個溫度較高的膠液中，然后滴注到一個有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變為凝膠而形成膠丸。（2）裝膜法694、人工種皮的研制美國杜邦公司生產的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質共聚的產物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果。4、人工種皮的研制701、人工種子轉換定義**轉換（Transformation）指人工種子在一定條件下，萌發、生長、形成完整植株的過程。2、轉換方法**轉換的方法可分為無菌條件下的轉換和土壤條件下的轉換。5、人工種子的轉換試驗1、人工種子轉換定義5、人工種子的轉換試驗71（1）、無菌條件的轉換：其也稱離體條件的轉換。一般是將新制成的人工種子播種在1/4MS培養基，附加1.5%麥芽糖、8g/L的瓊脂中，培養后統計人工種子形成完整植株的數目，即人工種子的轉化率。（2）、無菌條件轉換率的高低主要取決于：（a）、對提高體細胞胚質量的培養基成分的研究；（b）、改進轉換條件的研究。如麥芽糖代替蔗糖，有利于體細胞胚的萌發和轉換。（1）、無菌條件的轉換：其也稱離體條件的轉換。一般是將新制成72（3）、土壤條件的轉換：也稱活體條件下的轉換。人工種子真正目的是直接播種于土壤，即在活體條件下，使轉換成功。（4）土壤條件下轉換采用方法：a、無土培養試驗：目前以蛭石或珍珠巖試驗較多，附加低濃度無機鹽，