實驗目的

學習分光光度計的原理和使用方法。掌握淀粉酶活力測定的一般方法。了解大麥萌發前后淀粉酶活力的變化。第1頁/共12頁實驗原理

幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發的禾谷類種子，淀粉酶活性最強。種子萌發時，淀粉酶活性隨萌發時間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種。α-淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解生成麥芽糖。第2頁/共12頁淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉的水解產物麥芽糖及其它還原糖與3，5-二硝基水楊酸（DNS）的顯色反應來測定。還原糖作用于黃色的3，5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，其顏色深淺與淀粉酶水解產物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。休眠種子的淀粉酶活力很弱，但經吸脹萌發后，淀粉酶活力逐漸增強，并隨著發芽天數的增長而增加。本實驗通過測定大麥種子萌發前后的淀粉酶活力，來了解此過程中淀粉酶活力的變化。第3頁/共12頁儀器、原料和試劑

儀器：小臺秤；具塞刻度試管25ml×13；；研缽；容量瓶50ml×2、100ml×1；離心機；分光光度計；恒溫水浴；移液管。原料：大麥種子第4頁/共12頁試劑：（1）麥芽糖標準液（1mg/ml）：稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml（要求嚴格仔細操作）；（2）0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液：

A液（0.1mol/L檸檬酸）—稱取分析純檸檬酸21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；

B液(0.1mol/L檸檬酸鈉)—稱取檸檬酸鈉29.41g用蒸餾水溶解并定容至1L；取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液；（3）1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100ml0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。（4）3，5-二硝基水楊酸（DNS）：精確稱取1g3，5-二硝基水楊酸溶于20ml2M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進入。若溶液混濁，可過濾。第5頁/共12頁實驗步驟種子萌發：大麥種子浸泡2.5h后，放入25℃恒溫箱內或室溫下發芽。大麥萌發所需要的時間與品種有關。若難以萌發，可適當延長浸泡時間和發芽時間。酶液提取：稱取萌發3天的大麥種子1.0g（芽長1.0~1.5cm），置研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿后轉入離心管中，用8ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數分鐘振蕩1次，使其充分提取。然后3000r/min離心10min，取上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中（稀釋程度視酶活性大小而定），用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀粉酶稀釋液，進行酶活力測定。取干燥種子或浸泡2.5h后的種子1.0g作為對照，按上述步驟進行提取操作。第6頁/共12頁麥芽糖標準曲線制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表加入試劑：置沸水浴中加熱5min。取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25m1。混勻后以1號管為對照用分光光度計在520nm波長下進行比色，記錄吸光度。以吸光度為縱坐標，以麥芽糖含量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。試劑管號1234567麥芽糖標準液（ml）00.20.61.01.41.62.0蒸餾水2.01.61.41.00.60.20麥芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.62.0DNS（ml）2.02.02.02.02.02.02.0第7頁/共12頁4．酶活力測定：取25ml刻度試管5支，編號，按下表要求加入試劑。搖勻，置于水浴中煮沸5min,取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至25mL。搖勻，以5號管為對照在520nm波長下比色，記錄光密度值，從麥芽糖標準曲線中查出麥芽糖含量，用以表示酶活性。第8頁/共12頁試管標號試劑加入量/ml12345干燥種子的酶提取液干燥種子的酶提取液重復萌發幼苗的酶提取液萌發幼苗的酶提取液重復空白管酶稀釋液1.01.01.01.00DNS（ml）00002.0預保溫將各試管和淀粉溶液置于40℃恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液11111保溫在40℃恒溫水浴中準確保溫5min

DNS（ml）2.02.02.02.02.0第9頁/共12頁計算

根據溶液的濃度與光吸收值成正比的關系，即：

A標準/A未知=C標準/C未知，則

C（酶液管濃度）=A酶×C標準/A標準式中C—濃度；

A—光吸收值第10頁/共12頁注意事項

在實驗中要嚴格控制時間和溫度，以減小誤差。為了確保酶促反應時間的準確性，在進行保溫這一步驟時，可以將各試管每隔一定時間依次放入恒溫水浴，準確記錄時間，到達5min時取出試管，在依次立即加入DNS紀錄吸光值，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。如果條件允許，各實驗小組可采用不同材料，例如萌發1d、2d、3d、4d的大麥種子，比較