PAGEPAGE6福建農林大學研究生學年論文授課時間2011—2012學年度第二學期學號：1110204012研究生姓名：袁素素課程名稱：植物分子病毒學論文題目：抗植物病毒天然抽提物的研究進展授課或主考教師：魏太云抗植物病毒天然抽提物的研究進展摘要：綜述了自然界中對植物病毒具有抑制作用的植物和微生物提取物,并對提取物的提取方法，抑制作用，抑制機理，研究方法，發展前景做了論述。關鍵詞:植物病毒；天然抽提物；抑制作用幾乎每種農作物和經濟作物都受到2～3種病毒的危害植物病毒病害[1]，在農業生產上造成嚴重的危害。據估計，全世界每年因植物病毒病害造成的損失就超過150億美元，其中僅煙草花葉病毒病(Tobaccomosaicvirus)的危害每年造成的損失就達1億多美元。由于植物病毒對寄主的專性寄生性，加上植物缺乏完整的免疫代謝系統，使得植物病毒病的防治一直十分困難[2]，所以尋找一種安全、有效的抗病毒制劑是目前生產的需要。從自然界的生物中篩選抗病毒物質是尋找抑制植物病毒資源的研究熱點。1.天然產物抑制病毒的研究現狀Swain認為，植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產生的次生代謝產物超過40萬種，其中大多數化學元素物質如：萜烯類、生物堿、類黃酮、甾體、酚類、獨特的氨基酸和多糖等均具有殺蟲或抗菌活性[3]。Mahadeve指出，591種植物抽取物對真菌或細菌具有拮抗作用，173種植物含抗病毒物質。1.1植物中提取的抗病毒天然產物自1914年Allard首次報道商陸汁液具有抗病毒活性后，國內外學者對許多植物提取液的抗病毒活性進行了廣泛的研究[4]。它們大多集中在石竹目，包括商陸科(Phytolaccaceae)、藜科（Chenopodiaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)以及蓮子草屬(AlternantheraForsk)和葉子花屬(BougainvilleaComm.exJuss.)等數百種植物中。沈建國[5]等試驗了78科162種植物，發現其中160種對病毒侵染具有一定的抑制作用，抑制率在50%以上的有83種，抑制率超過95%的有19種：麻黃、杠板歸、雷公藤、蓮、木瓜、山楂、羊蹄甲、夜交藤、火炭母、辣蓼、榕樹、柿、水蜈蚣、金石榴、石韋根、哥蘭葉、楊梅、鼠尾粟。抑制率在90%以上的還有菊花、葉下珠、連翹、小藜、玉簪、菠菜、莧色藜、大蒜、板藍根、三葉鬼針草等。林存鑾，裘維蕃等[6]在測定的90種植物中，小藜(ChenopodiumserotinumL.)和玉簪[Hostaplantaginea(Lam.)Aschers.]兩種植物抽提液對番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)有較強的抑制作用，其它大部分抽提液對病毒有明顯的體外鈍化作用，但對病毒的治療效果很弱，并發現有些抽提液似有協生作用。Duarte[7]證實葉子花(BougainvileaglabraChoisy)、紅葉藜(C.rubrumL.)和紅花馬齒莧(Portulacasplendens)對馬鈴薯X病毒(PotatoXvirus,PVX)的抑制率可高達40%以上，恢復實驗顯示無癥植株不帶毒。而紅葉藜對馬鈴薯Y病毒(PotatoYvirus,PVY)治療效果甚微。另外，紅葉藜和紅花馬齒莧可以抑制TMV-Leg的系統感染，卻對菜豆金黃花葉病毒(Beangoldenmosaicvirus,BGMV)無效。已發現含病毒抑制劑的植物種類越來越多，這些抑制劑大多集中在植物的莖、葉、根、花和種子內。除石竹外，已報道對病毒有抑制作用的植物還有庭薺(Alyssumsp.)、油菜(Brassicacampestris)、蔓陀蘿(Daturastramonium)、煙草(Nicotianatabacum)、酸模(Rumexcrispus)、粉草(Pseuderanthemumbicolor)[8]。許玉娟等從蒼耳幼苗中提取得蒼耳多糖，發現蒼耳多糖對TMV具有一定的抑制作用，在濃度為1.0mg／mL時，乙醇濃度為30％的條件下獲得的多糖對TMV的抑制率為48.36％[9]。1.2微生物病毒抑制劑早在19世紀70年代，人們就發現多種擔子菌子實體、食用菌深層發酵液和固體培養物水浸液對植物病毒有抑制作用[10-12]。研究報道從榆黃蘑(Plearotuscitrinopileatus)[13]、金針菇(Flammulinavelutipes)[14]、杏鮑菇(Pleurotuseryngii)[15]、楊樹菇(Agrocybeaegerita)[16]、灰花樹(Grifolafrondoca)[17]、毛頭鬼傘(Coprinuscornatus)[18]等多種食用菌中分離到具有抗TMV活性的蛋白質。馬學萍[19]等測試了雞油菌(CantharellusminorPeck)、蘑菇(AgaricnscampestrisL.Fr)、香菇[Lentinuedodes(Berk.)Sing.]、平菇(Pluribus)、茶樹菇[Agrocybeaegerita(Brig.)Sing.]、雞腿菇(Coprinuscomattts)、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、金針菇(Flammulinavelutipes)8種食用菌乙醇提取物水溶液對煙草花葉病毒(TobaccoIllosaicvirus.TMV)的抑制作用，實驗結果表明：8種食用菌提取物在體外都具有鈍化病毒(TMV)及抑制病毒(TMV)侵染的作用；除雞油菌(CantharellusminorPeck)外，其它7種食用菌提取物對TMV有不同程度的治療作用。李丹[20]等對采自自云南的17種大型食用真菌子實體的浸提液及其多糖組分對TMV從預防(施用提取物24h后接種病毒)、鈍化(提取物與病毒混合后接種)、治療(接種病毒24h后施用提取物)3個方面進行抑制活性檢測。結果表明，l6種食用菌子實體的浸提液對TMV有較好的預防和鈍化作用，預防效果最好的真菌為火碳菌，預防效果達到99.95％。火碳菌、奶漿菌、掃把菌、白奶漿菌、美味牛肝菌、黃虎掌、黃牛肝、黑虎掌、冬瓜菌、紅乳菇、北風菌的水浸液對TMV的鈍化效果均在80％以上?；鹛季⑶鄺U菌等9種食用菌的多糖組分與其子實體浸提液對TMV的抑制效果相似，表明其多糖組分具有抑制TMV的主要活性成分。實驗真菌的治療效果總體不如鈍化效果明顯，治療效果在70％以上的有掃把菌、黃虎掌和冬瓜菌。其中，火碳菌和黃牛肝等對TMV抑制效果較好的食用菌及其多糖可作為環保型農藥及生物保健產品的開發對象。據報道部分抗病毒菌素對植物病毒病的抑制和延緩病害發生具有一定作用[21]。辛玉成等發現微生物菌株Penicilinsp.的代謝產物對黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)作用效果良好。抑病毒菌素對菜豆上CMV在500mg/L的鈍化效果為75.4%，抑病毒菌素對番茄上CMV在500mg/L處理的鈍化效果為61.2%。抑病毒菌素對病毒初侵染也有一定的抑制作用[22]。2.研究方法2.1抽提方法2.1.1多糖提取方法許玉娟用水提醇沉法從蒼耳幼苗中獲得不同醇沉級的蒼耳多糖。具體過程如下：取蒼耳幼苗100g，加200mL蒸餾水，勻漿，80℃提取2次，合并提取液，減壓濃縮至1／3體積。Sevag法脫蛋白，離心，除去變性蛋白，濃縮至1／3體積，加95％乙醇，使含醇量達到30％，4℃放置過夜，離心收集沉淀，復溶于水，水浴加熱揮發乙醇，冷凍干燥后得30％粗多糖組分。上清液繼續加入95％乙醇，使含醇量達到60％，同前處理得60％粗多糖組分，同樣方法得到80％粗多糖組分[9]。在多糖的提取中多用水提醇沉法，此方法簡單可行，提取多糖含雜質較少，但是提取工藝的不合理，醇溶性差異，以及提取過程中易受各種外在因素的影響，導致提取物中多糖分子結構的改變2.1.2蛋白提取方法王芳等研究拮抗細菌活性蛋白對CMV的體外鈍化作用為86.97%，通過離子交換層析和凝膠過濾層析的方法粗提蛋白，并測得活性蛋白的分子量大小為40.6KD。離子交換層析和凝膠過濾層析是蛋白提出的基本方法。前者是利用各帶電蛋白與離子交換劑之間的差異進行物質分離的操作方法。后者是根據蛋白質的大小和形狀，在層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖類物質，使蛋白混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。2.2抑制方法在植物病毒抑制物的篩選和抑制效果試驗中，枯斑分析法與漂浮葉圓片法是最常用的兩種方法。其中，前者主要用來研究抑制物抑制病毒侵染作用及抑制病毒復制的定量分析，而后者則被普遍認為是抗病毒化學成分測試的一種重要模式。此外，在研究抑制病毒增殖作用的測定中，還有棉線法、局部病斑法、水培法等。此外，在研究抑制病毒增殖作用的測定中，還有棉線法、局部病斑法、水培法等。在試驗中，往往采用系統感染寄主的方法，通過田間實際傳染方式相近的方法如噴霧、灌根等接種病原物，根據植物發病率、病情指數或植物體內的病毒含量來評價有效成分的抑制效果。另外，江山[23]提出藥物是否影響TMV衣殼蛋白聚合可作為篩選植物病毒抑制劑的方法之一；侯玉霞[24]驗證了病毒／細胞同步侵染體系篩選抗植物病毒劑是可行的方法。許玉娟采用枯斑半葉法在心葉煙上進行抗煙草花葉病毒(TMV)活性的檢測[9]。3.抗植物病毒的化學物質①金屬鹽類，如ZnSO4、CaC12；②有機化學物質，如水楊酸、聚苯烯酸、類黃酮、季胺化合物、非環式連氮結構化合物、蒽醌類等；③嘌呤和嘧啶類，如8一氮雜腺嘌呤、2一硫脲嘧啶、三嗪類等；④氨基酸，如原亮氨酸、半磺氨酸等；⑤維生素類；⑥植物激素類，如赤霉素、抗病毒醚、胞激素、激動素等；⑦蛋白質類，如牛奶和脫脂牛奶。這些化學物質有的對植物病毒只有體外鈍化作用，有的在活體內有抑制病毒和治療作用，有的可以誘導寄主植物產生與病程相關的蛋白，從而提高植株的抗病性。4.抑制機理劉學端等從600多種植物中篩選復配了一種對煙草花葉病防效較理想的藥劑MHll-4。研究結果表明，MH11-4的防病機理表現在體外鈍化病毒、體內抑制病毒增殖和誘導煙株產生抗性3個方面。隨著研究手段的H臻完善，許多天然抑制劑對靠機械傳播的病毒特別有效。從現有的研究結果看，高等植物中抑制病毒的有效成分大多屬于堿性蛋白或蛋白類似物，諸如多肽、酶等。高等植物和微生物代謝產物對病毒的抑制作用機理還不完全清楚，天然抑制劑主要是使病毒粒子的蛋白凝聚和蛋白合成受阻，從而使病毒不能復制。從香菇中提取的苯恩特明對TMV的抑制作用，可在電鏡下觀察到病毒凝聚，這表明是其外殼蛋白引起某些變性造成的[25]。Grasso等[26]認為噴灑天然抑制劑后，使寄主核糖體上的病毒蛋白合成受阻，病毒不能復制。關于病毒蛋白合成受阻的原因，Grasso認為抑制劑使病毒的RNA失去了mRNA的功能，從而不能合成病毒復制所需要的早期蛋白。雷新云等認為NS-83與植物激素的作用和機制相類似，制劑作用于植物細胞膜，啟動質子泵，控制了膜的通透性。同時，NS-83引起植物一系列生理生化變化，并認為NS-83中存在激素特性的證明為這一解釋提供了依據。林存鑾和裘維蕃[27]根據多種抽提液對病毒有體外鈍化作用，但很少具有病毒治療效果的現象認為，這些物質具有不同的作用機制，即具有強體外鈍化作用的物質不一定在植物體內起治療作用；相反，在體外鈍化作用較弱的也有可能有一定的治療作用。對病毒的體外鈍化作用，一般認為是鈍化物質對病毒直接的物理作用。而對病毒的治療作用，則可能是在寄主體內對病毒增殖過程的抑制作用，也可能是通過誘導寄主植物在生理機制上發生一系列變化，從而產生一定的抗性或耐性，降低病毒的增殖，甚至可能二者兼有。許玉娟等測定了蒼耳多糖處理普通煙后煙草葉片中過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性變化，發現噴施蒼耳多糖后，可提高煙草葉片POD、PPO、PAL酶的活性，因此蒼耳幼苗多糖可能通過誘導煙草中防御酶活性形成對TMV的抑制活性[9]。但是植物抽提物和微生物代謝產物對病毒產生的抑制機理還不是完全清楚?，F有的研究也僅限于初步了解，真正的作用機理還需要進行深入研究。5.存在的問題及發展前景5.1存在問題當前還沒有一種理想的藥劑能夠有效地防治植物病毒病。雖然在抗植物病毒天然物質篩選研究中取得了一些成果，但仍存在許多問題，主要表現在以下幾個方面：①篩選的面不寬。目前抗植物病毒天然物質篩選多以中草藥為主，篩選的面較窄。②抗植物病毒天然物質篩選方法的局限性。建立標準體系是一個重要基礎工作，然而由于對植物病原物致病機理的研究不夠深入，特別是對植物、病原物和藥劑之間相互作用的關系不夠明朗，使得有效成分篩選沒有較好的理論基礎。③活性成分缺乏跟蹤研究。目前提取有效成分的方法常用乙醇或直接用水浸提，雖然含有許多活性和非活性成分，但確切的活性成分、結構及構效關系探討缺乏深入的跟蹤研究。④抑制機理沒有完全弄清楚。目前，對有效成分在病原物一寄主之間的識別作用、誘導信號傳導等方面尚有許多問題沒有完全弄清楚，還需進一步的研究。5.2發展前景由于病毒病是僅次于真菌病害的第二大病害，每年病毒病造成的損失相當嚴重，所以尋找一種安全、有效的抗病毒制劑是目前生產的需要。天然抑制劑的開發與利用為研制抗病毒制劑開辟了一條嶄新的途徑，具有美好的前景。首先，由于植物本身存在方式的特殊性，在植物王國中可供開發的有效成分種類十分豐富。其次，植物源活性成分的研究與開發符合綠色思維。大多有效成分屬于小分子物質，易被植物吸收，同時其本身又來源于植物，一般都易在環境中降解，不易造成環境污染和殘留毒性問題。開發的制劑與環境有較高和諧度，是目前無公害農藥、動植物綠色生產的重要方向。此外，利用有效成分結構作為先導化合物進行仿生合成，也可能篩選出比天然活性更理想的新制劑，這也是新型藥劑(包括農藥)開發的重要思路。參考文獻：[1]安德榮.植物病毒化學防治的研究現狀和所面臨的問題[J].生命科學,1994,6(2):16—18.[2]吳云峰.生物病毒農藥篩選及應用[J].世界農業,1995,(5):35—36.[3]李永剛,文景芝,都中娜.植物源殺菌劑的研究現狀與展望[J].東北農業大學學報,2002,33(2):198—202.[4]沈建國,翟梅枝,林奇英,等.我國植物源農藥研究進展[J].福建農林大學學報(自然科學版)[J].2002,31(1):26—31.[5]沈建國,謝荔巖,吳祖建,等.藥用植物提取物抗煙草花葉病毒活性的研究［Ｊ］.中草藥,2006,37(2):259-261.[6]林存鑾,裘維蕃.植物保護學報[J],1987,14(4):218～221.[7]DuarteLML.MicrobiosLetters[J],1990,45:131～137.[8]AbidAli,KhanMM,VermaHN.AnnalsofAppliedBiology[J],1990,117(3):617～623.[9]許玉娟,范素素等.蒼耳多糖對煙草花葉病毒的抑制作用及對煙草幾種防御酶活性的影響.山東農業大學學報（自然科學版）,2010,41（4）:485-488.[10]王晶英,鄭雅鶯,張建光,等.食用菌代謝產物研究及其在農業上的應用[J].中國食用菌,1997,16(2):6—7.[11]高木康至,島田和純.傘菌類鋸木屑培養物提取液對TMV的防治效果[J].日植病報,1977,43:211—214.[12]王先彬,王啟燕.香菇培養物水浸液對煙草花葉病毒(TMV)侵染心葉煙的抑制作用[J].微生物學報,1986,26(4):363—365.[13]付鳴佳,吳祖建,林奇英,等.榆黃蘑中一種抗病毒蛋白的純化及其抗煙草花葉病毒和乙型肝炎病毒的活性[J].中國病毒學,2002,17(4):350—353.[14]付鳴佳,吳祖建,林奇英,等.金針菇中一種抗病毒蛋白的純化及其抗煙草花葉病毒特性[J].福建農林大學學報(自然科學版),2003,2(1):84—88.[15]付鳴佳,林健清,吳祖建,等.杏鮑菇抗煙草花葉病毒蛋白