導師：李澤庚教授清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型作用機理的對比研究研究生：張開宇導師：李澤庚教授清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型作用機理的匯報內容一、研究目標二、研究方案三、技術路線四、預期成果五、年度研究計劃及預期進展六、經費預算匯報內容一、研究目標研究目標本研究基于氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的致病理論，結合多年的肺氣虛證和我院長期應用清肺解毒飲治療老年肺炎實踐所展示的療效優勢,按照中醫藥規律開展肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型的清肺解毒、益氣活血，“菌毒并治”，清補并用干預治療的對比研究，宏觀與微觀相結合，體內和體外相結合，闡明清肺解毒飲治療老齡大鼠肺炎模型作用機理，為中醫藥治療老年肺炎奠定新的理論基礎。研究目標本研究基于氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的致1、提出氣虛是老年肺炎的始動和根本因素，外感六淫是發病誘因，痰阻血瘀是重要病理產物；氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的主要病理過程。氣虛血瘀、感邪痰阻是肺炎發病、治療、預后的關鍵因素。提出以清肺解毒化痰、益氣活血散瘀為治法，“菌毒并治”、清補并用的治療老年肺炎新思路。2、本課題率先開展中藥復方干預治療老齡大鼠肺炎模型的探索性研究，通過對比觀察肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型的肺部炎性病灶影像改變、肺組織病理改變、肺組織炎癥因子調節，闡明基于“菌毒并治”法干預治療老齡大鼠肺炎模型的作用機理，開創中醫藥干預治療老年肺炎研究的新方法。創新點1、提出氣虛是老年肺炎的始動和根本因素，外感六淫是發病誘因，研究方案1實驗藥物 清肺解毒飲：取人參，金銀花，桑白皮，貫眾，柴胡，栝樓，丹皮，虎杖、玉竹等中藥飲片（安徽中醫學院第一附屬醫院提供）加水，煎煮三次，過濾，合并濾液，濃縮至每毫升含生藥0.819g的藥液，置4℃冰箱中保存備用。2、實驗試劑2.1水合氯醛(2509/瓶):由北京北化精細化學品有限責任公司提供，批號:20070328，使用時配置成25%溶液。2.2 肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌：分別由我院細菌室臨床分離并經API細菌鑒定系統鑒定。分別營養瓊脂斜面存種，4℃冰箱保存;使用前接種于普通牛肉湯培養基內，置37℃恒溫箱內增殖48小時，用無菌生理鹽水稀釋適當濃度(2.4X109FU/ml)并計數。實驗中細菌的培養和菌液的準備由我微生物室協助完成研究方案1實驗藥物研究方案2.3多聚甲醛分析純(500g/瓶)：由北京化學試劑公司提供，批號:980107。用時配成4%的多聚甲醛固定液。方法為:多聚甲醛40g置于二角燒瓶中，加入500-800ml0.lmol/L的PBS溶液中，力熱至60℃左右，緩慢攪拌，使粉末完全溶解，通常需要Na0H溶液助溶，最后用0.1mol/L的PBS溶液加至1000ml，充分混勻，冷藏保存備用。2.4腫瘤壞死因子(TNF-a)、Y干擾素(IFN-Y)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、ELISA試劑盒由R&D公司國內分裝批號:201012。研究方案2.3多聚甲醛分析純(500g/瓶)：由北京化研究方案3、主要儀器生化培養箱； 可見紫外分光光度計； 精密天平； 數字移液器； 型冷凍離心機； 顯微鏡及顯微照相系統； 離心機； 六孔水浴鍋； 隔水式電熱恒溫培養箱; 凈化工作臺; 電熱手提壓力蒸氣消毒器等。研究方案3、主要儀器研究方案4方法4.1老齡大鼠肺炎模型建立4.1.1建立老齡大鼠肺炎模型的標準參照Yershov等分別采用肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌氣管內注入，肺炎大鼠模型成功的判定標準如下:1)臨床診斷標準:體溫≥40℃;氣管內膿性分泌物;呼吸困難和氣促,唇、舌、耳出現紫紺。當以上4項出現3項時判斷為陽性。2)放射學標準:進行性肺部浸潤性病變;空洞形成;胸腔積液。至少1項出現為陽性。研究方案4方法研究方案3)實驗室標準:肺功能損害;PaO2/fiO2<26.6kPa;WBC>11000或<4000/μ連續≥2d;支氣管肺泡灌洗液細胞數≥1×103/μL。3項中至少出現2項認為是陽性。4)微生物學標準:至少1個標本中細菌含量≥1×104CFU/g肺組織;支氣管肺泡灌洗液中細菌濃度≥1×104CFU/mL。以上2項任意1項出現認為是陽性。5)肉眼觀察標準:至少1個肺葉損傷評分≥3，至少1個胸膜腔出現滲出或纖維蛋白沉積。至少出現項為陽性。6)組織學標準:至少1個標本在毛細血管和鄰近的肺泡區域出現多核白細胞的聚集。肺組織肉眼觀察評分標準為:正常,0分；疤痕,1分;輕度充血,2分;紅色度,分;灰色度,4分;黃色度,5分。研究方案3)實驗室標準:肺功能損害;PaO2/fiO2<2研究方案4.1.2建立老齡大鼠肺炎模型的方法選用SD老齡大鼠20-22月齡，體重560g士90g經口咽滴入氣管法腹腔注射(0.2-0.25)ml0.65%的戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，并經上中切牙點懸吊。用一接注射器的鈍圓針頭經口插入氣管，分別滴入40μL約含有107CFU處于對數生長期的肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌混懸液(在滴入時堵住鼻孔)，使接種物入肺。急性肺炎很快誘導成功,1-4h后即出現菌血癥,未治療的小鼠2-3d死亡，死亡時肺組織勻漿細菌計數超過108CFU/mL。并通過肺炎大鼠模型建立判定標準證實肺炎模型建立成功。研究方案4.1.2建立老齡大鼠肺炎模型的方法研究方案4.2實驗動物分組：將140只（SPF級）SD老齡雄性大鼠隨機分為7組，分別為正常對照組、肺炎鏈球菌老齡大鼠模型組、肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型組及兩種模型治療的清肺解毒飲高、低劑量組(分別簡稱肺鏈高、低劑量組和肺克高、低劑量組)。每組均20只。4.3實驗給藥與劑量：按上述方法造模后給藥，每組給藥劑量均根據大鼠體重按成人一日劑量折算[按公式大鼠等效劑量(mg/kg)=折算系數×成人劑量(mg/kg)]計算出大鼠等效劑量：中藥：8.19g/kg，中藥高、低劑量組分別給予中藥46、11.5g/(kg·d)灌胃;正常對照組和兩種老齡大鼠肺炎模型組分別灌以生理鹽水。連續給藥3天，然后分組分批處死肺炎老齡模型大鼠。每日觀察小鼠的生存率、死亡率、體重、體溫的變化至感染后14d。研究方案4.2實驗動物分組：將140只（SPF級）SD老齡4.4觀察指標與檢測方法4.4.1一般指標 觀察接種后動物的臨床表現包括實驗大鼠的神態、毛色、攝食、飲水、活動等情況的變化；體重、肛溫測定，并做好記錄；觀察生存時間、死亡時間及死亡數，對各組大鼠的死亡情況進行登記；4.4.2各組外周血象和支氣管肺泡灌洗液(BALS)白細胞和中性粒細胞計數；4.4.3實驗前后大鼠肺部X線。研究方案4.4觀察指標與檢測方法研究方案4.4.4肺指數的測定將大鼠處死，解剖取肺,準確稱質量,計算肺指數、肺指數抑制率。 小鼠肺質量/g肺指數=——————； 小鼠體質量/g (對照組肺指數均值-治療組肺指數均值)肺指數抑制率=------------------------------------×100% 對照組肺指數均值4.4.5光學顯微鏡檢查：肺組織經梯度酒精系列脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察各組肺炎老齡大鼠肺組織病理形態學改變并照相;4.4.6肺組織TNF-ɑ、IFN-Y、IL-6、IL-10等炎性因子的測定;研究方案4.4.4肺指數的測定研究方案研究方案5、統計分析 實驗數據采用SPSS16．0軟件進行統計學分析。計量資料以均值±標準差(x珋±s)表示，多組間差異采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩兩組間比較用LSD法;計數資料用χ2檢驗統計，P＜0．05為有顯著性差異。研究方案5、統計分析技術路線

技術路線預期成果1、闡明清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型的肺部炎性病灶影像學改變、肺組織病理改變、肺組織炎癥因子調節三者變化的相關性；“菌毒并治”法運用清肺解毒飲治療老齡大鼠肺炎模型的作用機理，形成研究技術報告。2、發表國內核心期刊論文4-6篇；3、申報成果1項。預期成果1、闡明清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型的肺部炎性病年度研究計劃及預期進展（1）2012年8月～2012年12月 ①文獻查新，完善研究方案和研究方法； ②訂購實驗動物、相關試劑；（2）2013年1月～2013年12月 ①動物實驗； ②相關指標檢測； ③數據初步處理，發表階段性研究論文2篇； ④參加全國性學術活動一次并進行大會交流；（3）2014年1月～2014年8月 ①實驗資料的全面整理、實驗數據分析、總結，完成研究技術報告； ②發表學術論文2-4篇。年度研究計劃及預期進展（1）2012年8月～2012年12月經費預算科研業務費 2.1 x線檢查、病理光鏡觀察、炎癥因子 檢測，文獻檢索、查詢、方案論證、 論文發表版面費等實驗材料費 0.7 實驗動物及飼養、試劑儀器設備費 0.1 實驗儀器、設備使用費協作費 0.1 指標檢測協作費合計 3.0 經費預算謝謝敬請各位專家指正謝謝敬請各位專家指正導師：李澤庚教授清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型作用機理的對比研究研究生：張開宇導師：李澤庚教授清肺解毒飲對兩種老齡大鼠肺炎模型作用機理的匯報內容一、研究目標二、研究方案三、技術路線四、預期成果五、年度研究計劃及預期進展六、經費預算匯報內容一、研究目標研究目標本研究基于氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的致病理論，結合多年的肺氣虛證和我院長期應用清肺解毒飲治療老年肺炎實踐所展示的療效優勢,按照中醫藥規律開展肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型的清肺解毒、益氣活血，“菌毒并治”，清補并用干預治療的對比研究，宏觀與微觀相結合，體內和體外相結合，闡明清肺解毒飲治療老齡大鼠肺炎模型作用機理，為中醫藥治療老年肺炎奠定新的理論基礎。研究目標本研究基于氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的致1、提出氣虛是老年肺炎的始動和根本因素，外感六淫是發病誘因，痰阻血瘀是重要病理產物；氣虛血瘀，易感外邪，毒損肺絡是老年肺炎的主要病理過程。氣虛血瘀、感邪痰阻是肺炎發病、治療、預后的關鍵因素。提出以清肺解毒化痰、益氣活血散瘀為治法，“菌毒并治”、清補并用的治療老年肺炎新思路。2、本課題率先開展中藥復方干預治療老齡大鼠肺炎模型的探索性研究，通過對比觀察肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型的肺部炎性病灶影像改變、肺組織病理改變、肺組織炎癥因子調節，闡明基于“菌毒并治”法干預治療老齡大鼠肺炎模型的作用機理，開創中醫藥干預治療老年肺炎研究的新方法。創新點1、提出氣虛是老年肺炎的始動和根本因素，外感六淫是發病誘因，研究方案1實驗藥物 清肺解毒飲：取人參，金銀花，桑白皮，貫眾，柴胡，栝樓，丹皮，虎杖、玉竹等中藥飲片（安徽中醫學院第一附屬醫院提供）加水，煎煮三次，過濾，合并濾液，濃縮至每毫升含生藥0.819g的藥液，置4℃冰箱中保存備用。2、實驗試劑2.1水合氯醛(2509/瓶):由北京北化精細化學品有限責任公司提供，批號:20070328，使用時配置成25%溶液。2.2 肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌：分別由我院細菌室臨床分離并經API細菌鑒定系統鑒定。分別營養瓊脂斜面存種，4℃冰箱保存;使用前接種于普通牛肉湯培養基內，置37℃恒溫箱內增殖48小時，用無菌生理鹽水稀釋適當濃度(2.4X109FU/ml)并計數。實驗中細菌的培養和菌液的準備由我微生物室協助完成研究方案1實驗藥物研究方案2.3多聚甲醛分析純(500g/瓶)：由北京化學試劑公司提供，批號:980107。用時配成4%的多聚甲醛固定液。方法為:多聚甲醛40g置于二角燒瓶中，加入500-800ml0.lmol/L的PBS溶液中，力熱至60℃左右，緩慢攪拌，使粉末完全溶解，通常需要Na0H溶液助溶，最后用0.1mol/L的PBS溶液加至1000ml，充分混勻，冷藏保存備用。2.4腫瘤壞死因子(TNF-a)、Y干擾素(IFN-Y)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、ELISA試劑盒由R&D公司國內分裝批號:201012。研究方案2.3多聚甲醛分析純(500g/瓶)：由北京化研究方案3、主要儀器生化培養箱； 可見紫外分光光度計； 精密天平； 數字移液器； 型冷凍離心機； 顯微鏡及顯微照相系統； 離心機； 六孔水浴鍋； 隔水式電熱恒溫培養箱; 凈化工作臺; 電熱手提壓力蒸氣消毒器等。研究方案3、主要儀器研究方案4方法4.1老齡大鼠肺炎模型建立4.1.1建立老齡大鼠肺炎模型的標準參照Yershov等分別采用肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌氣管內注入，肺炎大鼠模型成功的判定標準如下:1)臨床診斷標準:體溫≥40℃;氣管內膿性分泌物;呼吸困難和氣促,唇、舌、耳出現紫紺。當以上4項出現3項時判斷為陽性。2)放射學標準:進行性肺部浸潤性病變;空洞形成;胸腔積液。至少1項出現為陽性。研究方案4方法研究方案3)實驗室標準:肺功能損害;PaO2/fiO2<26.6kPa;WBC>11000或<4000/μ連續≥2d;支氣管肺泡灌洗液細胞數≥1×103/μL。3項中至少出現2項認為是陽性。4)微生物學標準:至少1個標本中細菌含量≥1×104CFU/g肺組織;支氣管肺泡灌洗液中細菌濃度≥1×104CFU/mL。以上2項任意1項出現認為是陽性。5)肉眼觀察標準:至少1個肺葉損傷評分≥3，至少1個胸膜腔出現滲出或纖維蛋白沉積。至少出現項為陽性。6)組織學標準:至少1個標本在毛細血管和鄰近的肺泡區域出現多核白細胞的聚集。肺組織肉眼觀察評分標準為:正常,0分；疤痕,1分;輕度充血,2分;紅色度,分;灰色度,4分;黃色度,5分。研究方案3)實驗室標準:肺功能損害;PaO2/fiO2<2研究方案4.1.2建立老齡大鼠肺炎模型的方法選用SD老齡大鼠20-22月齡，體重560g士90g經口咽滴入氣管法腹腔注射(0.2-0.25)ml0.65%的戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，并經上中切牙點懸吊。用一接注射器的鈍圓針頭經口插入氣管，分別滴入40μL約含有107CFU處于對數生長期的肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌混懸液(在滴入時堵住鼻孔)，使接種物入肺。急性肺炎很快誘導成功,1-4h后即出現菌血癥,未治療的小鼠2-3d死亡，死亡時肺組織勻漿細菌計數超過108CFU/mL。并通過肺炎大鼠模型建立判定標準證實肺炎模型建立成功。研究方案4.1.2建立老齡大鼠肺炎模型的方法研究方案4.2實驗動物分組：將140只（SPF級）SD老齡雄性大鼠隨機分為7組，分別為正常對照組、肺炎鏈球菌老齡大鼠模型組、肺炎克雷伯菌老齡大鼠模型組及兩種模型治療的清肺解毒飲高、低劑量組(分別簡稱肺鏈高、低劑量組和肺克高、低劑量組)。每組均20只。4.3實驗給藥與劑量：按上述方法造模后給藥，每組給藥劑量均根據大鼠體重按成人一日劑量折算[按公式大鼠等效劑量(mg/kg)=折算系數×成人劑量(mg/kg)]計算出大鼠等效劑量：中藥：8.19g/kg，中藥高、低劑量組分別給予中藥46、11.5g/(kg·d)灌胃;正常對照組和兩種老齡大鼠肺炎模型組分別灌以生理鹽水。連續給藥3天，然后分組分批處死肺炎老齡模型大鼠。每日觀察小鼠的生存率、死亡率、體重、體溫的變化至感染后14d。研究方案4.2實驗動物分組：將140只（SPF級）SD老齡4.4觀察指標與檢測方法4.4.1一般指標 觀察接種后動物的臨床表現包括實驗大鼠的神態、毛色、攝食、飲水、活動等情況的變化；體重、肛溫測定，并做好記錄；觀察生存時間、死亡時間及死亡數，對各組大鼠的死亡情況進行登記；4.4.2各組外周血象和支氣管肺泡灌洗液(BALS)白細胞和中性粒細胞計數；4.4.3實驗前后大鼠肺部X線。研究方案4.4觀察指標與檢測方法研究方案4.4.4肺指數的測定將大鼠處死，解剖取肺,準確稱質量,計算肺指數、肺指數抑制率。 小鼠肺質量/g肺指數=——————； 小鼠體質量/g (對照組肺指數均值-治療組肺指數均值)肺指數抑制率=------------------------------------×100% 對照組肺指數均值4.4.5光學顯微鏡檢查：肺組織經梯度酒精系列脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察各組肺炎老齡大鼠肺組