免疫學(xué)基本知識山西省疾病預(yù)防控制中心吳立平2006.6.11免疫學(xué)基本知識山西省疾病預(yù)防控制中心1

抗原的概念抗原(antigen，Ag)是指能刺激機體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性質(zhì)：①免疫原性(immunogenicity)指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；抗原的概念抗原(antigen，Ag)是指能刺激機體免疫系2抗原的概念②反應(yīng)原性(immunoreactivity)指抗原與抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力，亦稱為反應(yīng)原性。有些物質(zhì)在獨立存在時只具有反應(yīng)原性而無免疫原性，稱為半抗原(hapten)；而免疫原通常同時具有免疫反應(yīng)能力。抗原的概念②反應(yīng)原性(immunoreactivity)指抗3抗體的概念抗原刺激機體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機體的漿細胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)就是抗體。Ig由漿細胞產(chǎn)生，存在于血液和其他體液（包括組織液和外分泌液）中，約占血漿蛋白總量的20％；還可分布在B細胞表面。抗體的概念抗原刺激機體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機體的漿細胞合成并4抗體的概念抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Moncloneantibody）。由多種抗原決定簇刺激機體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。抗體的概念抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇5

免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答（immuneresponse）是機體免疫系統(tǒng)對抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過程。這個過程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗原遞呈、淋巴細胞活化、免疫分子形成及免疫效應(yīng)發(fā)生等一系列的生理反應(yīng)。免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答（immuneresponse）是機體免疫6免疫應(yīng)答

通過有效的免疫應(yīng)答，機體得以維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定免疫應(yīng)答通過有效的免疫應(yīng)答，機體得以維護內(nèi)環(huán)境7免疫應(yīng)答的基本過程

抗原識別階段（antigen-recognitingphase）是抗原通過某一途徑進入機體，并被免疫細胞識別、遞呈和誘導(dǎo)細胞活化的開始時期，又稱感應(yīng)階段。一般，抗原進入機體后，首先被局部的單核－巨噬細胞或其他輔佐細胞吞噬和處理，然后以有效的方式（與MHCⅡ類分子結(jié)合）遞呈給TH細胞。(TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的基本過程抗原識別階段（antigen-rec8免疫應(yīng)答的基本過程B細胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直接與抗原結(jié)合，并且可將抗原遞呈給TH細胞。T細胞與B細胞可以識別不同種類的抗原，所以不同的抗原可以選擇性地誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答或抗體免疫應(yīng)答，或者同時誘導(dǎo)兩種類型的免疫應(yīng)答。（TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的基本過程B細胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直9免疫應(yīng)答的基本過程

另一方面，一種抗原顆粒或分子片段可能含有多種抗原表位，因此可被不同克隆的細胞所識別，誘導(dǎo)多種特異性的免疫應(yīng)答。

(TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的基本過程另一方面，一種抗原顆粒或分子片10免疫應(yīng)答的類型按參與細胞分類：

根據(jù)主導(dǎo)免疫應(yīng)答的活性細胞類型，可分為細胞介導(dǎo)免疫和體液免疫兩大類。T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，簡稱為細胞免疫，體液免疫是B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，也可稱抗體應(yīng)答，以血清中出現(xiàn)循環(huán)抗體為特征。（TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的類型按參與細胞分類：11免疫應(yīng)答的類型按抗原刺激順序分類：某抗原初次刺激機體與一定時期內(nèi)再次或多次刺激機體可產(chǎn)生不同的應(yīng)答效果。據(jù)此可分為初次應(yīng)答和再次應(yīng)答兩類。一般地說，不論是細胞免疫還是體液免疫，初次應(yīng)答比較緩慢柔和，再次應(yīng)答則較快速激烈。（TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的類型按抗原刺激順序分類：12免疫應(yīng)答的類型按應(yīng)答效果分類：一般情況下，免疫應(yīng)答的結(jié)果是產(chǎn)生免疫分子或效應(yīng)細胞，具有抗感染、抗腫瘤等對機體有利的效果，稱為免疫保護；但在另一些條件下，過度或不適宜的免疫應(yīng)答也可導(dǎo)致病理損傷，稱為超敏反應(yīng)，包括對自身抗原應(yīng)答產(chǎn)生的自身免疫病。與此相反，特定條件下的免疫應(yīng)答可不表現(xiàn)出任何明顯效應(yīng)，稱為免疫耐受。

（TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的類型按應(yīng)答效果分類：13免疫應(yīng)答的類型

另外，在免疫系統(tǒng)發(fā)育不全時，可表現(xiàn)出某一方面或全面的免疫缺陷；而免疫系統(tǒng)的病理性增生而稱為免疫增殖病。免疫應(yīng)答的類型另外，在免疫系統(tǒng)發(fā)育不全時，可表現(xiàn)14免疫應(yīng)答間的關(guān)系免疫應(yīng)答間的關(guān)系15免疫學(xué)基本知識課件16免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)17抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)(antigen-antibodyreaction)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補體、固相載體等）不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清反應(yīng)（serologicreaction）。抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)(antigen-antibody18第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段。第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補體）的影響下，進一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時。實際上這兩個階段難以嚴格區(qū)分，而且兩階段的反應(yīng)所需時間亦受多種因素和反應(yīng)條件的影響，若反應(yīng)開始時抗原抗體濃度較大且兩者比較適合，則很快能形成可見反應(yīng)。第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段。19第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點（一）特異性抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。這種特異性如同鑰匙和鎖的關(guān)系。例如白喉抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。較大分子的蛋白質(zhì)常含有多種抗原表位。如果兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，皆可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點（一）特異性20（二）按比例在抗原抗體特異性反應(yīng)時，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發(fā)現(xiàn)只有在兩者分子比例合適時才出現(xiàn)最強的反應(yīng)。以沉淀反應(yīng)為例，若向一排試管中中入一定量的抗體，然后依次向各管中加入遞增量的相應(yīng)可溶性抗原，根據(jù)所形成的沉淀物及抗原抗體的比例關(guān)系可繪制出反應(yīng)曲線（圖1）。（二）按比例在抗原抗體特異性反應(yīng)時，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的21圖1沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系A(chǔ)g：抗原；Ab：抗體圖1沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系22從圖中可見，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價帶（zoneofequivalence）。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。其中有一管反應(yīng)最快，沉淀物形成最多，上清液中幾乎無游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比（optimalratio）。

在等價帶前后分別為抗體過剩則無沉淀物形成，這種現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象（zonephenomenon）。出現(xiàn)在抗體過量時，稱為前帶（prezone），出現(xiàn)在抗原過剩時，稱為后帶（postzone）。從圖中可見，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為23在用沉淀反應(yīng)對不同來源的抗血清進行比較后，發(fā)現(xiàn)抗體可按等價帶范圍大小分為兩種類型，即R型抗體和H型抗體。R型抗體以家兔免疫血清為代表，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，只在抗原過量時，才易出現(xiàn)溶性免疫復(fù)合物，大多數(shù)動物的免疫血均屬此型。H型抗體以馬免疫血清為代表，其抗原與抗體的合適比例范圍較窄，抗原或抗體過量，均可形成可溶性免疫復(fù)合物。人和許多大動物的抗血清皆屬H型。在用沉淀反應(yīng)對不同來源的抗血清進行比較后，發(fā)現(xiàn)抗體可按等價24（三）可逆性抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動力學(xué)反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為：[Ab-Ag]／[Ab].[Ag]=k1/k2=k式中各反應(yīng)項的單位以mol表示，k1表示反應(yīng)速度常數(shù)，k2為逆反應(yīng)速度常數(shù)，K是反應(yīng)平衡時的速度常數(shù)。由上式可知，K值是反映抗原抗體間結(jié)合能力的指示，所以抗體親和力通常以K值表示。（三）可逆性抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動力學(xué)反應(yīng)原則，其反25（三）可逆性抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素，一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。反之，低親和性抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。解離后的抗原或抗體均能保持未結(jié)合前的結(jié)構(gòu)、活性及特異性。（三）可逆性抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素，一是抗體對26（三）可逆性在環(huán)境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素都會使逆向反應(yīng)加快，復(fù)合物解離增加。如pH改變，過高或過低的pH值均可破壞離子間電引力消失。對親合力本身較弱的反應(yīng)體系而言，僅增加離子強度即可解離抗原抗體復(fù)合物的目的；增加溫度可增加分子間的熱動能，加速已結(jié)合的復(fù)合物的解離，但由于溫度變化易致蛋白變性，所以實際工作中極少應(yīng)用。改變pH和離子強度是最常用的促解離方法，免疫技術(shù)中的親和層析就是以此為根據(jù)純化抗原或抗體。（三）可逆性在環(huán)境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素27影響抗原抗體反應(yīng)的因素（一）電解質(zhì)抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體，若溶液中無電解質(zhì)參加，仍不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85％氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1－，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢下降。當(dāng)電勢降至臨界電勢（12～15mV）以下時，則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。影響抗原抗體反應(yīng)的因素（一）電解質(zhì)28影響抗原抗體反應(yīng)的因素（二）酸堿度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進行。蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點。抗原抗體反應(yīng)一般在pH為6～8進行。pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達到或接近抗原的等電點時，即使無相應(yīng)抗體存在，也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應(yīng)。影響抗原抗體反應(yīng)的因素（二）酸堿度29（三）溫度在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運動，抗原與抗體碰撞機會增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56℃時，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40℃時，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37℃。每種試驗都有其獨特的最適反應(yīng)溫度，例如冷凝集素在4℃左右與紅細胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。此外，適當(dāng)振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。（三）溫度在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運動，抗原與抗體碰30沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原（細菌培養(yǎng)濾液、細胞或組織的浸出液、血清蛋白等）與相應(yīng)抗體在液相中特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原（precipitinogen），可以是類脂、多糖或蛋白質(zhì)等；抗體稱為沉淀素（precipitin）。沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原（細菌培養(yǎng)濾液、細胞或組織的浸31第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗受到抗原和抗體比例的直接影響，因而產(chǎn)生了兩種最適比例的基本測定方法。

第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗32（一）抗原稀釋法將可溶性抗原作一系列稀釋，與恒定濃度的抗血清等量混合，置室溫或37℃反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗原的變化而不同。（二）抗體稀釋法（Ramon）法用恒定的抗原量與不同程度稀釋的抗體反應(yīng)二、環(huán)狀沉淀試驗（一）抗原稀釋法將可溶性抗原作一系列稀釋，與恒定濃度的抗血清33第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形34一、單向擴散試驗是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。可分為試管法和平板法兩種一、單向擴散試驗是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液35（二）平板法是目前最常用的簡易抗原定量技術(shù)，其要點是：將抗體或抗血清混入0.9％瓊脂糖內(nèi)（約50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37℃讓其向四周擴散，24～48h后可見周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)由于試驗中抗原向四周擴散，故又稱單向輻射狀免疫擴散單向瓊脂免疫擴散法作為抗原的定量方法，其重復(fù)性和線性皆是可信賴的，唯敏感度稍差（不能測μg/ml以下含量）。（二）平板法是目前最常用的簡易抗原定量技術(shù)，其要點是：36二、雙向擴散試驗在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可作出對抗原或抗體的定性分析。雙向擴散也可分為試管法和平板法兩種方法。二、雙向擴散試驗在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U散，在最恰當(dāng)37免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這38免疫學(xué)基本知識課件39一、免疫電泳二、對流免疫電泳三、火箭免疫電泳四、免疫固定電泳經(jīng)典的沉淀試驗有4個缺點無法克服，即操作繁瑣、敏感度低（10～100μg/ml）、時間長和難以自動化。一、免疫電泳40凝集反應(yīng)凝集作用（反應(yīng)）（agglutination）:特異性抗體引起抗原顆粒凝集或形成塊狀的作用（反應(yīng)）。凝集素（agglutinin）:凝集素即凝集抗體。在凝集反應(yīng)中與顆粒性抗原起反應(yīng)的抗體。凝集原（agglutinogen）:在凝集反應(yīng)中，刺激凝集素產(chǎn)生或與抗體反應(yīng)的抗原，這種抗原通常是顆粒性抗原。

凝集反應(yīng)凝集作用（反應(yīng)）（agglutination）:特異41免疫學(xué)基本知識課件42凝集反應(yīng)的特點凝集反應(yīng)的發(fā)生分兩階段：①抗原抗體的特異結(jié)合；②出現(xiàn)可見的顆粒凝集。凝集試驗是一個定性的檢測方法，也可以進行半定量檢測，凝集試驗靈敏度高，方法簡便。凝集反應(yīng)的特點凝集反應(yīng)的發(fā)生分兩階段：43凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)；間接凝集反應(yīng)；自身紅細胞凝集試驗抗球蛋白參與的凝集試驗是兩種特殊的凝集反應(yīng)

凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)可分為是兩種特殊的凝集反應(yīng)44第二節(jié)直接凝集反應(yīng)細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)（directagglutination）。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。第二節(jié)直接凝集反應(yīng)細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當(dāng)電45（一）玻片凝集試驗玻片凝集試驗為定性試驗方法，一般用已知抗體作為診斷血清、與受檢顆粒抗原如菌液或紅細胞懸液各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。玻片法還用于紅細胞ABO血型的鑒定。（一）玻片凝集試驗玻片凝集試驗為定性試驗方法，一般用已知抗體46（二）試管凝集試驗為半定量試驗方法，常用已知細菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價，亦稱為滴度。在試驗中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍颍梢鹂乖姆翘禺愋阅霈F(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對照組。常用的直接試管凝集試驗為肥達試驗（Widaltest）和外斐試驗（Weil-Felixtest）。（二）試管凝集試驗為半定量試驗方法，47第三節(jié)間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirectagglutination）或被動凝集反應(yīng)（passiveagglutination）。其敏感度高于沉淀反應(yīng)第三節(jié)間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的48一、間接凝集反應(yīng)的類型1．（正向）間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體：（正向）間接凝集反應(yīng)原理示意圖（正向）間接凝集反應(yīng)原理示意圖（正向）間接凝集反應(yīng)原理示意圖一、間接凝集反應(yīng)的類型1．（正向）間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體492．反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。反向間接凝集反應(yīng)原理示意圖2．反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)503．間接凝集抑制反應(yīng)診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體，用于檢測標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。檢測方法為將標(biāo)本先與抗體試劑作用，然后再加入致敏的載體，若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明標(biāo)本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結(jié)合，因此仍與載體上的抗原起作用。如標(biāo)本中存在相同抗原，則凝集反應(yīng)被抑制。可用抗體致敏的載體及相應(yīng)的抗原作為診斷試劑，以檢測標(biāo)本中的抗體，此時稱反向間接凝集抑制反應(yīng)。3．間接凝集抑制反應(yīng)診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體51間接凝集抑制反應(yīng)原理示意圖A：標(biāo)本中含抗原B：標(biāo)本中不含抗原間接凝集抑制反應(yīng)原理示意圖524．協(xié)同凝集反應(yīng)協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination）與間接凝集反應(yīng)的原理相類似，但所用載體是一種金黃色葡萄球菌。它的菌體細胞壁中含有A蛋白（staphylococcusprotienA，SPA）。SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，因此當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。協(xié)同凝集反應(yīng)也適用于細菌的直接檢測。4．協(xié)同凝集反應(yīng)協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination53中和反應(yīng)細菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)(neutralization)

中和試驗是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用的一種抗原抗體反應(yīng)試驗方法，用以測定抗體，中和病毒感染性或細菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。能與細菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體稱為抗毒素。中和試驗可以在敏感動物體內(nèi)(包括雞胚)，體外組織(細胞)培養(yǎng)或試管內(nèi)進行。觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應(yīng)或中和毒素對細胞的毒作用；以及測定抗體的其他生物學(xué)效應(yīng)。中和反應(yīng)細菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)(ne54免疫學(xué)基本知識課件55免疫標(biāo)記技術(shù)經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)：熒光抗體技術(shù)、放射免疫分析和酶免疫技術(shù)。首先被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是熒光素；放射性核素作為標(biāo)記物在免疫技術(shù)中的應(yīng)用又開創(chuàng)了特異性的超微量測定；酶用作免疫技術(shù)標(biāo)記物是從抗原定位開始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物顯色的作用而得到與熒光抗體技術(shù)相似的結(jié)果。免疫標(biāo)記技術(shù)經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)：熒光抗體技術(shù)、放射免疫分析和56酶免疫技術(shù)這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位，屬于免疫組化技術(shù)（immunohistochemicaltechnique）范疇，另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測定。稱為免疫測定（immunoassay）。酶免疫技術(shù)這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其57ELISA的原理和類型基本原理：1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。ELISA的原理和類型基本原理：58ELISA的基本原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA的基本原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并59免疫學(xué)基本知識課件60ELISA的基本原理在測定時，把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的基本原理在測定時，把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不61ELISA有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。ELISA有3種必要的試劑：62（一）雙抗體夾心法

檢測抗原最常用的方法

（一）雙抗體夾心法

檢測抗原最常用的方法63（二）雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，它應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。

（二）雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分64免疫學(xué)基本知識課件65鉤狀效應(yīng)一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。鉤狀效應(yīng)一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect66（三）間接法測抗體

是檢測抗體最常用的方法

（三）間接法測抗體

是檢測抗體最常用的方法67（四）競爭法

可用于測定抗原，也可用于測定抗體

（四）競爭法

可用于測定抗原，也可用于測定抗體68（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法。（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和69免疫學(xué)基本知識課件70ELISA的技術(shù)要點（一）固相載體最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。最常用的載體為微量反應(yīng)板，國際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。

ELISA的技術(shù)要點（一）固相載體71ELISA的固相載體好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。

ELISA的固相載體好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值72（二）抗原和抗體要求：抗原純度高，抗體效價高、親和力強。抗原有三個來源：天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。

（二）抗原和抗體要求：抗原純度高，抗體效價高、親和力強。73抗原和抗體抗體有多克隆的和單克隆。抗血清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當(dāng)稀釋后直接進行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純。抗原和抗體抗體有多克隆的和單克隆。74（三）免疫吸附劑固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)。通常將抗原或抗體溶于緩沖液（最常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。（三）免疫吸附劑固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。75包被如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面沒有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。可再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫(-20℃)可放置一段時間而不失去其免疫活性。包被如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面沒有能被此蛋白76（四）酶和底物最常用的酶：辣根過氧化酶（HRP）:在蔬菜作物辣根中含量很高，是一種糖蛋白.堿性磷酸酶（AP）:從牛腸粘膜或大腸桿菌提取。從大腸桿菌提取的AP作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP最適pH為9.6。一般用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)。AP敏感性高于HRP，空白值也較低。但AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。（四）酶和底物最常用的酶：77HRP催化下列反應(yīng)：上式中DH2為供氫體，H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物.ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3‘，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。

HRP催化下列反應(yīng)：上式中DH2為供氫體，H2O2為受氫體78底物OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計中定量；因此應(yīng)用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。底物OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便79HRP催化OPD的反應(yīng)如下：

HRP催化OPD的反應(yīng)如下：80（五）結(jié)合物酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為酶結(jié)合物（conjugate）。制備酶結(jié)合物的方法通常有：1．戊二醛交聯(lián)法2．過碘酸鹽氧化法（五）結(jié)合物酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為酶結(jié)合物（conjuga81ELISA測定的注意事項測定方法要標(biāo)準(zhǔn)化：要使ELISA測定得到準(zhǔn)確的結(jié)果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規(guī)定的方法制備試劑和實施測定。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應(yīng)觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。ELISA測定的注意事項測定方法要標(biāo)準(zhǔn)化：82（一）加樣ELISA在定性測定（臨床標(biāo)本）中有時不強調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在非臨床標(biāo)本和半定量的測定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。（一）加樣ELISA在定性測定（臨床標(biāo)本）中有時不強調(diào)加樣量83（二）保溫ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)（二步法），即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后；反應(yīng)的溫度和時間嚴格按規(guī)定的要求；保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當(dāng)時，即可終止酶反應(yīng)。(實驗室應(yīng)裝空調(diào))（二）保溫ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)（二步法），即加84（三）洗滌洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的－洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，在洗滌時應(yīng)把非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。（三）洗滌洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)，但卻是決定實驗成敗85（三）洗滌在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）類物質(zhì)即可達到去非特異物的目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號；結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。（三）洗滌在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫86ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；將洗滌液注滿板孔；放置2min，略作搖動；吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；87（四）比色用酶標(biāo)儀測定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于：ELISA板底的平整度；ELISA板的透明度；選用的波長是否正確：OPD→490/492，TMB→450/620或630；酶標(biāo)儀的質(zhì)量。（四）比色用酶標(biāo)儀測定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于：88免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗原（抗體）鑒定抗體（抗原）的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進行特異性檢測。免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白89免疫印跡技術(shù)例如，將經(jīng)SDS分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到膜上后，膜用封閉液處理，然后與第一抗體(樣品)反應(yīng)，膜經(jīng)漂洗后再與偶有辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗體反應(yīng)，加人生色底物反應(yīng)之后，即可顯示出目標(biāo)蛋白（樣品中的抗體）的位置。免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，其優(yōu)點是方法簡便、標(biāo)本可長期保存、結(jié)果便于比較，故廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等領(lǐng)域，成為免疫學(xué)、微生物學(xué)及其他生命科學(xué)常用的一種研究方法。免疫印跡技術(shù)例如，將經(jīng)SDS分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到膜90免疫印跡免疫印跡91熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。很早92

有關(guān)熒光的基本知識一、熒光現(xiàn)象（一）熒光的產(chǎn)生一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)反應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。有關(guān)熒光的基本知識一、熒光現(xiàn)象93（二）熒光效率熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。（二）熒光效率熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或94（三）熒光的猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍、堿性復(fù)紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。（三）熒光的猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射95二、熒光物質(zhì)（一）熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：二、熒光物質(zhì)（一）熒光色素961．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocy972．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色98（二）其他熒光物質(zhì)1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。（二）其他熒光物質(zhì)1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身99熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體的制備（一）抗體的熒光素標(biāo)記（二）熒光抗體的鑒定熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體的制備100二、免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。二、免疫熒光顯微技術(shù)免疫熒顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與101（一）標(biāo)本的制作標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。標(biāo)本主要有組織、細胞和細菌三大類；組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片；細胞或細菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻；涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝。置－10℃保存或立即使用。（一）標(biāo)本的制作標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢102（二）熒光抗體染色于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。（二）熒光抗體染色于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。103（三）熒光顯微鏡檢查熒光抗體染色的標(biāo)本，在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進行。首先要選擇好光源或濾光片。濾光片的其作用是提供合適的激發(fā)光。（三）熒光顯微鏡檢查熒光抗體染色的標(biāo)本，在染色當(dāng)天即作鏡檢104激發(fā)濾光片有兩種：MG為紫外光濾片，只允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG為藍紫外光濾片，只允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度為410nm。靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過。透光范圍為410～650nm，代號有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。觀察FITC標(biāo)記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標(biāo)記物時，可選用BG12與OG5配合。激發(fā)濾光片有兩種：MG為紫外光濾片，只允許波長275～400105（四）實驗的類型1．直接法用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上，使之與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。（本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。（四）實驗的類型1．直接法用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上，106直接免疫熒光法原理示意圖直接免疫熒光法原理示意圖107實驗的類型2．間接法：可用于檢測抗原和抗體。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）為針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。實驗的類型2．間接法：可用于檢測抗原和抗體。108間接免疫熒光法原理示意圖3．補體結(jié)合法：較少應(yīng)用。4．標(biāo)記法本法用FITC及羅丹明分別標(biāo)記不同的抗體，而對同一標(biāo)本作熒光染色。在有兩種相應(yīng)抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。間接免疫熒光法原理示意圖109熒光免疫測定一、時間分辨熒光免疫測定熒光素作為標(biāo)記物的熒光免疫測定易受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光及激發(fā)光源的雜射光干擾，使靈敏度受到限制。時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）是針對這缺點加以改進的一種新型檢測技術(shù)。熒光免疫測定一、時間分辨熒光免疫測定110TR-FIA的基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)有長熒光壽命的特點，延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。其中增強液的作用是使熒光信號增強。因為免疫反應(yīng)完成后，生成的抗原－抗體－銪標(biāo)記物復(fù)合物在弱堿性溶液中，經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光信號甚弱。在增強液中pH可至2～3，銪離子很容易解離出來，并與增強液中的β-二酮體生成帶有強烈熒光的新的銪螯合物，大大有利于熒光測量。用檢測儀器為時間分辨熒光計，與一般的熒光分光光度計不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1000次的氙燈），照射樣品后即短暫熄滅，以電子設(shè)備控制延緩時間，待非特異本底熒光衰退后，再測定樣品發(fā)出的長鑭系熒光。檢測靈敏度可達0.2～1ng/ml。TR-FIA的基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作熒光標(biāo)記111TR-FIA測定原理示意圖TR-FIA測定原理示意圖112雙抗體夾心法TR-FIA反應(yīng)程序示意圖雙抗體夾心法TR-FIA反應(yīng)程序示意圖113熒光偏振免疫測定熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光藍光（波長485nm）照射后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)；在恢復(fù)至基態(tài)時，釋放能量并發(fā)出單一平面的偏振熒光（波長525nm）。偏振熒光的強度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時分子轉(zhuǎn)動的速度成反比。大分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)慢，發(fā)出的偏振熒光強；小分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱。利用這一現(xiàn)象建立了熒光偏振免疫測定（floutescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA），用于小分子物質(zhì)特別是藥物的測定。熒光偏振免疫測定熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光藍光（波長485n114放射免疫分析放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達ng甚至pg水平。測定的準(zhǔn)確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測定。放射免疫分析放射免疫分析是由Yalow和Berson于196115一、基本原理放射免疫分析的基本原理是標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結(jié)合反應(yīng)。它的反應(yīng)式為：一、基本原理放射免疫分析的基本原理是標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)116

在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的。抗體的量一般取用能結(jié)合40％～50％的標(biāo)記抗原，而受檢標(biāo)本中的非標(biāo)記抗原是變化的。根據(jù)標(biāo)本中抗原量的不同，得到不同的反應(yīng)結(jié)果。將抗原抗體復(fù)合物與游離標(biāo)記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原（B）與游離態(tài)的標(biāo)記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結(jié)合率[B/(B＋F)]，這與標(biāo)本中的抗量呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)抗原進行反應(yīng)，計算相應(yīng)的B/F，可以繪制出一條劑量反應(yīng)曲線。受檢標(biāo)本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線上查出標(biāo)本中抗原的含量。在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的。抗117放射免疫分析原理示意圖放射免疫分析原理示意圖118劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線119（一）標(biāo)記物標(biāo)記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。（一）標(biāo)記物標(biāo)記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。120

（二）標(biāo)記方法標(biāo)記125I的方法可分兩大類，即直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。（三）標(biāo)記物的鑒定（四）抗血清的檢定（二）標(biāo)記方法121二、測定方法（一）抗原抗體反應(yīng)將抗原（標(biāo)準(zhǔn)品和受檢標(biāo)本）、標(biāo)記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應(yīng)一定時間，使競爭抑制反應(yīng)達到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標(biāo)本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15～37℃）進行較短時間的溫育，反之應(yīng)在低溫（4℃）作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復(fù)合物較為牢固。二、測定方法（一）抗原抗體反應(yīng)122（二）B、F分離技術(shù)在RIA反應(yīng)中，標(biāo)記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標(biāo)記抗原（F）的分離。另外對小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。（二）B、F分離技術(shù)123第一節(jié)有關(guān)發(fā)光的基本知識發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的方法。其既具有免疫反應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，在免疫學(xué)檢驗中應(yīng)用日趨廣泛。1．光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2．生物發(fā)光（bioluminescence）典型例子為螢火蟲發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲光素（fireflyluciferin），在熒光素酶（luciferase）的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素（oxyluciferin），后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。第一節(jié)有關(guān)發(fā)光的基本知識發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與1243．化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。化學(xué)發(fā)光是一個多步驟的過程，其機制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。3．化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）在常溫下由125第二節(jié)化學(xué)發(fā)光底物在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。常用的化學(xué)發(fā)光底物有：1．氨基苯二酰肼類：主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：第二節(jié)化學(xué)發(fā)光底物在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射126魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物酶的底物。異魯米諾衍生物ASEI和ABMI等也是常用的標(biāo)記物。2．吖啶酯（acridiniumester，AE）類這類發(fā)光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。反應(yīng)式見電化學(xué)發(fā)光原理圖：魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過氧化物酶的底物1273．電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）反應(yīng)在電極表面進行。發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]，另一反應(yīng)物為三丙胺（TPA）。在陽電極表面，以上兩化學(xué)物質(zhì)可同時失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)（圖18-1）。二價的Ru(bpy)32+被氧化成三價Ru(bpy)33+，TPA被氧化成陽離子自由基TPA+●，后者失去一個質(zhì)子（H+），成為自由基TPA●，這是一個強還原劑，可將一個電子遞給三價的Ru(bpy)32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化產(chǎn)物。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時發(fā)射一個波長為620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進行，產(chǎn)生許多光子，使信號得以增強。3．電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminesce128電化學(xué)發(fā)光原理

上式反應(yīng)迅速，在1～5s內(nèi)即可完成；具有背景低、信比高的優(yōu)點，其檢測極限可達5×10-9mol，發(fā)光量與AE濃度呈良好的線性反應(yīng)，是一類的標(biāo)記物。電化學(xué)發(fā)光原理129第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測定一、化學(xué)發(fā)光酶免疫測定從標(biāo)記免疫測定來看，化學(xué)發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）應(yīng)屬酶免疫測定。測定中2次抗原抗體反應(yīng)步驟均與酶免疫測定相同，僅最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。兩種常用的標(biāo)記酶，辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）均有其發(fā)光底物，第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測定一、化學(xué)發(fā)光酶免疫測定130（一）HRP標(biāo)記的CLEIA：常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)可被某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶等加強。加強劑的作用是增強發(fā)光和延長發(fā)光時間，由此可提高敏感度。（一）HRP標(biāo)記的CLEIA：常用的底物為魯米諾或其衍生物131（二）AP標(biāo)記的CLEIA

在以AP為標(biāo)記酶的CLEIA中，應(yīng)用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應(yīng)用。發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)式如下：（二）AP標(biāo)記的CLEIA在以AP為標(biāo)記酶的CLEIA中，132二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測定亦稱化學(xué)發(fā)光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫測定方法。用作標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力；④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾類和吖啶酯類發(fā)光劑等均是常用的標(biāo)記發(fā)光劑。二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測定亦稱化學(xué)發(fā)光免133魯米諾類的發(fā)光反應(yīng)須有催化劑（例如過氧化物酶）催化，且與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類在CLEIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標(biāo)記。吖啶酯類更為適用，其顯著的優(yōu)點：①氧化反應(yīng)不需催化劑，只要堿性環(huán)境中就可以進行。反應(yīng)物在加入H2O2后再加氫化鈉溶液，發(fā)光反應(yīng)迅速，本底低。②在氧化反應(yīng)過程中，結(jié)合物被分解，因此游離的吖啶酯的發(fā)光不受抑制。試劑穩(wěn)定性好。魯米諾類的發(fā)光反應(yīng)須有催化劑（例如過氧化物酶）催化，且與蛋白134三、電化學(xué)發(fā)光免疫測定在電化學(xué)發(fā)光免疫測定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI）中應(yīng)用的標(biāo)記物為電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗原分子結(jié)合，制成標(biāo)記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分二個步驟進行。以雙抗體夾心法測定抗原為例：第一步在試管中進行，反應(yīng)物為Ru(bpy)32+標(biāo)記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標(biāo)本，反應(yīng)式如圖。三、電化學(xué)發(fā)光免疫測定在電化學(xué)發(fā)光免疫測定（electroc135

ECLI中的抗原抗體反應(yīng)反應(yīng)后除由標(biāo)記抗體、固相抗體與標(biāo)本中的抗原形成的夾心復(fù)合物外，尚有多余的標(biāo)記抗體和固相抗體。第二步是將反應(yīng)液輸入特殊的檢測儀器的反應(yīng)室中，隨即用含三丙胺（TPA）的緩沖液沖洗。反應(yīng)室電極下有磁鐵。含磁性微球的夾心復(fù)合物及游離的固相抗體被吸附在電極表面，游離的標(biāo)記抗體隨沖洗液流出。此時在反應(yīng)室中即發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。發(fā)出的光由光電倍增管轉(zhuǎn)為信號，通過電信號的測定反映標(biāo)本中抗原的含量。ECLI中的抗原抗體反應(yīng)136ECLI中的ECL反應(yīng)ECLI中的ECL反應(yīng)137ECLI具有以下優(yōu)點：①標(biāo)記物在再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，＞104；④反應(yīng)時間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。ECLI具有以下優(yōu)點：①標(biāo)記物在再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、138金免疫技術(shù)金免疫技術(shù)的特點是以膠體金作為標(biāo)記物。這一技術(shù)在70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。迄今為止，金標(biāo)記仍主要用于免疫組織化學(xué)中。在免疫測定中，金標(biāo)記常與膜載體配合，形成特定的測定模式，典型的如斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等，已是目前應(yīng)用廣泛的簡便、快速檢驗方法。金免疫技術(shù)金免疫技術(shù)的特點是以膠體金作為標(biāo)記物。這一技術(shù)在139第一節(jié)免疫膠體金的制備（一）膠體金的結(jié)構(gòu)：膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。第一節(jié)免疫膠體金的制備（一）膠體金的結(jié)構(gòu)：140（二）膠體金的特性膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金對電解質(zhì)的敏感。電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有保護膠體金、加強其穩(wěn)定性的作用。呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個光吸收峰的波長（λmax）在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長波長，反之，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長。（二）膠體金的特性膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1～100nm，141（三）膠體金的制備制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料。肉眼觀察是最基本也是最簡單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計制得的金顆粒的大小。也可用分光光度計掃描λmax來估計金顆粒的粒徑。制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時會有細菌生長或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標(biāo)記，使用時為提高標(biāo)記效率可先低速離心去除凝集顆粒。（三）膠體金的制備制備方法膠體金的制備多采用還原法。142二、免疫金的特性和制備（一）免疫金的特性膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡稱免疫金（immunogold）。膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機制尚有十分清楚，一般認為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽性電荷通過靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會影響蛋白質(zhì)的吸附。二、免疫金的特性和制備（一）免疫金的特性143膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機制尚有十分清楚，一般認為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽性電荷通過靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會影響蛋白質(zhì)的吸附。膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機制尚有十分清楚，一般認為是物理吸附性的144第二節(jié)金免疫測定一、斑點金免疫滲濾試驗基本原理是：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。斑點免疫滲濾試驗最初是從斑點ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的，稱為斑點酶免疫滲濾試驗。又名滴金免疫測定法（簡稱滴金法）。不需酶對底物的反應(yīng)，更加簡便、快速。第二節(jié)金免疫測定一、斑點金免疫滲濾試驗145以雙抗體夾心法為例在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點。以雙抗體夾心法為例在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為146（三）質(zhì)量控制滴金法的質(zhì)量控制常采用在硝酸纖維素膜上點加質(zhì)控點的方法。質(zhì)控小圓點多位于反應(yīng)斑點的正下方。雙抗體夾心法的質(zhì)控點最好是相應(yīng)抗原，若該抗原試劑不易制備或價格昂貴時，也可用SPA或針對金標(biāo)抗體的抗抗體來充當(dāng)。間接法的質(zhì)控點采用鹽析法粗提的人IgG最為經(jīng)濟、方便。（三）質(zhì)量控制滴金法的質(zhì)量控制常采用在硝酸纖維素膜上點加質(zhì)控147DIGFA滲濾裝置及操作示意圖DIGFA滲濾裝置及操作示意圖148有將包被斑點由圓點改成短線條式的：質(zhì)控斑點橫向包被成橫線條，如“－”；反應(yīng)斑點縱向包被成豎線條，如“∣”；兩者相交成“＋”。這樣，陽性反應(yīng)結(jié)果在膜上顯示紅色的正號（＋），陰性反應(yīng)結(jié)果則為負號（－），目視判斷直觀、明了。

有將包被斑點由圓點改成短線條式的：149斑點免疫層析試驗（dotimmunochromatographicassay，DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。免疫層析試驗原理示意圖斑點免疫層析試驗（dotimmunochromatograp150斑點免疫層析試驗測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標(biāo)本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T）。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質(zhì)控線條（R）。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。斑點免疫層析試驗測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材151免疫金銀染色一、原理金免疫技術(shù)測定的產(chǎn)物上的金顆粒可將銀離子還原成銀顆粒，在金顆粒表面形成一色澤更深的黑色層，因而增強了金免疫技術(shù)的敏感性。IGSS多用于組織化學(xué)檢測。

免疫金銀染色原理示意圖免疫金銀染色一、原理免疫金銀染色原理示意圖152謝謝謝謝153免疫學(xué)基本知識課件154免疫學(xué)基本知識山西省疾病預(yù)防控制中心吳立平2006.6.11免疫學(xué)基本知識山西省疾病預(yù)防控制中心155

抗原的概念抗原(antigen，Ag)是指能刺激機體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性質(zhì)：①免疫原性(immunogenicity)指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；抗原的概念抗原(antigen，Ag)是指能刺激機體免疫系156抗原的概念②反應(yīng)原性(immunoreactivity)指抗原與抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力，亦稱為反應(yīng)原性。有些物質(zhì)在獨立存在時只具有反應(yīng)原性而無免疫原性，稱為半抗原(hapten)；而免疫原通常同時具有免疫反應(yīng)能力。抗原的概念②反應(yīng)原性(immunoreactivity)指抗157抗體的概念抗原刺激機體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機體的漿細胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)就是抗體。Ig由漿細胞產(chǎn)生，存在于血液和其他體液（包括組織液和外分泌液）中，約占血漿蛋白總量的20％；還可分布在B細胞表面。抗體的概念抗原刺激機體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機體的漿細胞合成并158抗體的概念抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Moncloneantibody）。由多種抗原決定簇刺激機體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。抗體的概念抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇159

免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答（immuneresponse）是機體免疫系統(tǒng)對抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過程。這個過程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗原遞呈、淋巴細胞活化、免疫分子形成及免疫效應(yīng)發(fā)生等一系列的生理反應(yīng)。免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答（immuneresponse）是機體免疫160免疫應(yīng)答

通過有效的免疫應(yīng)答，機體得以維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定免疫應(yīng)答通過有效的免疫應(yīng)答，機體得以維護內(nèi)環(huán)境161免疫應(yīng)答的基本過程

抗原識別階段（antigen-recognitingphase）是抗原通過某一途徑進入機體，并被免疫細胞識別、遞呈和誘導(dǎo)細胞活化的開始時期，又稱感應(yīng)階段。一般，抗原進入機體后，首先被局部的單核－巨噬細胞或其他輔佐細胞吞噬和處理，然后以有效的方式（與MHCⅡ類分子結(jié)合）遞呈給TH細胞。(TOBECONTINUE）免疫應(yīng)答的基本過程抗原識別階段（antigen-rec162免疫應(yīng)答的基本過程B細胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直接與抗原結(jié)合，并且可將抗原遞呈給TH細胞。T細胞與B細胞可以識別不同種類的抗原，所以不同的抗原可以選