第五章噬菌體載體和柯斯載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第1頁!本章主要內容噬菌體一般特性λ噬菌體柯斯質粒M13噬菌體1、M13噬菌體特性及基因組結構2、M13噬菌體載體類型及特點噬菌粒比較噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第2頁!節噬菌體的一般生物學特性（Bacteriophage，phage）

噬菌體可以在脫離寄主細胞的狀態下保持生命，但一旦脫離了寄主細胞，就不能生長和復制利用寄主的核糖體、蛋白質合成因子、氨基酸和產能體系，進行生長和繁殖噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第3頁!一、噬菌體的結構和其核酸類型結構：無尾部結構的二十面體型、具尾部結構的二十面體型、線狀體型核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環形DNA、單鏈環形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第4頁!不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復雜；對寄主的依賴性較低有些噬菌體的DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的。

Example：

T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第5頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第6頁!三、噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長的基本過程：1、吸附吸附到位于感染細胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過細胞壁注入寄主細胞3、轉變被感染的細胞成為制造噬菌體顆粒的場所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放子代噬菌體顆粒從寄主細胞內釋放出來噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第7頁!1、概念溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期。溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌溶源化：用溫和噬菌體感染細菌培養物使之形成溶源性細菌的過程噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第8頁!2、溶源周期的主要特征λ噬菌體和P1噬菌體λ噬菌體的特征：(1)噬菌體的DNA分子注入細菌細胞(2)經過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉(3)噬菌體的DNA分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體(4)細菌繼續生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第9頁!噬菌體P1基本特征：不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進行獨立復制的環形的質粒DNA分子。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第10頁!①超敏感免疫性阻遏－操縱體系：cⅠ基因編碼阻遏蛋白，啟動子PL和PR，操縱基因OL和OROLPLcⅠPROR阻遏蛋白同操縱基因結合使RNA聚合酶不能起始轉錄，這種狀態有充分的能力使原噬菌體保持“關閉”形式，溶源細菌能夠正常生長。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第11頁!整合酶必須首先與宿主編碼的宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)結合形成復合體，才能催化attP和attB在O區進行重組而形成原噬菌體。Hif噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第12頁!1、λ噬菌體特性及基因組結構2、λ噬菌體載體類型及特點第二節λ噬菌體載體back噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第13頁!λphage一、λ噬菌體的分子生物學概述1、基因組結構（1）cos位點線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12nt組成的彼此完全互補的5’突出單鏈注入宿主后，粘性末端互補形成雙鏈區，成為cos位點。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第14頁!cos位點的兩個作用：使進入細菌的DNA分子成為環狀，這是插入細菌基因組的先決條件。作為識別位點，由內切酶將滾環復制的多聯體DNA切開噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第15頁!左側區A～J中間區J～N右側區N右側（2）基因組噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第16頁!感染早期：從單一復制起點開始雙向θ型復制，由O基因和P基因產物激活；隨后開始滾環復制，產生的線性DNA為基因組首尾串連的多聯體DNA分子①DNA復制——O基因和P基因早期蛋白表達θ型復制cos噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第17頁!②溶源化控制基因——attintxisXis：控制一種蛋白質刪除酶的合成int：控制整合酶的合成att：提供整合酶的識別位點③控制基因cIII、N、cI、cro、cII④溶菌基因——S、R噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第18頁!1、插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的派生載體。只能插入較小分子量的外源（＜10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆2、替換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆較大分子量的外源，克隆高等真核生物DNA二、λ噬菌體載體的主要類型噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第19頁!

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

λgt10噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第20頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第21頁!Charon4A載體

Charon4A載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區段，同時將Lac5作為選擇標記使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內繁殖，并裂解E.coli，形成空斑Lac5

EcoRICharon4A噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第22頁!Charon40的中間可取代區段是一種DNA短片段多次重復而成，稱為多節段區，兩個短片段之間可被NaeⅠ識別，因此用它做載體可以有效的將其中的多節段區清除，從而得到的多是重組的噬菌體。克隆能力達到9～22kb短片段重復替換區

MCSMCSCharon40LA19.2RA9.6噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第23頁!替換型載體克隆外源DNA的步驟1、應用適當的核酸內切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2、將上述所得的

λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3、對重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第24頁!（三）凱倫噬菌體載體在λ噬菌體基礎上發展起來的，既有插入型又有替換型；在基因工程實驗中的用途十分廣泛承受外源DNA的能力：幾個kb到23kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第25頁!三、λ噬菌體載體的改良改良的目標：擴大克隆容量設計可對重組體分子作正選擇的克隆載體構建可以方便的通過轉錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針的克隆載體發展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第26頁!基因red和gam位于非必需區域內，外源DNA片段能置換基因red和gam形成重組體，其重組體不能在recA-的P2溶源菌中繁殖可以在recA＋的P2溶源菌中繁殖并且顯示出Spi-的表型。因此只要選用recA+的P2溶源菌作為宿主菌，就可以對重組體進行篩選。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第27頁!λDNA的復制是由θ型向滾環型的轉變，受到gam基因控制基因gam功能：蛋白產物和寄主細胞的外切核酸酶Ⅴ（宿主recB和recC基因產物）結合成復合物，失去對λDNA的作用活性，因而λ噬菌體能夠合成成熟的多聯體DNA，供作包裝底物基因red功能：參與裂解性生長早期發生的重組反應，是核酸外切酶，使θ型復制中的病毒DNA分離形成子代閉環DNA分子噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第28頁!chi位點的引入

red和gam基因缺失(red-和gam-)的λ噬菌體在P2溶源菌或野生型大腸桿菌中生長較差，形成的噬斑很少，然而當在λDNA中引人chi位點后，Spi-噬菌體在宿主菌中的繁殖力便會隨之增強，噬斑變大。chi位點（交換熱點激活區）由一段長度為八核苷酸的DNA序列組成，其序列為5’GCTGGTCG3’。野生型λDNA中并無此序列，但在大腸桿菌染色體DNA和真核基因組中都存在有chi序列，大腸桿菌DNA平均每5000bp出現一次chi序列。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第29頁!四、體外包裝1、λ重組體DNA分子的轉染作用λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經過體外包裝，然后以噬菌體感染（轉導）的方式將重組DNA導入E.coli細胞內。因為以感染方式導入細胞的頻率可達106~108/μgDNA，而以轉染（translation）的方式導入的頻率僅為103~104/μgDNA。

噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第30頁!2、λ重組體DNA的體外包裝在A蛋白（有終止復制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉入頭部。主要外殼蛋白是基因E的產物基因A的產物在cos位點切割后進入頭部包含在外殼中基因D的產物基因W和FⅡ的產物組裝成完整的尾部噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第31頁!使用具有cⅠ857突變基因的λ噬菌體的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養獲得頭部和尾部cⅠ857是溫度敏感性阻遏基因，32℃為溶源狀態，44～45℃誘發，溶菌的S基因突變，因而不會溶菌。大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組λDNA包裝噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第32頁!計算包裝范圍（KB）48×75%＝3648×105%＝51必需基因為28包裝范圍8kb～23kb《分子克隆試驗指南》78%～105%，包裝范圍在10～23kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第33頁!由于λ噬菌體頭部組裝時容納DNA的量是固定的，因此插入外源DNA長度必須控制在使重組DNA為野生型λDNA長度的75%~105%之間，否則難以正常組裝。③具有較高的感染效率，其感染宿主細胞的效率幾乎可達100%，而質粒DNA的轉化率卻只0.1%。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第34頁!第三節柯斯質粒載體（Cosmidvector）1978年，J.collins和B.Hohn等人發展出的一種人工載體

帶有cos位點的質粒載體

4-6kb，帶有選擇標記，在構建cDNA文庫中很有用。可攜帶大的外源DNA片段，克隆45kb基因。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第35頁!cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第36頁!二、柯斯質粒載體的特點1、具有λ噬菌體的特性；插入合適長度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進入細胞后環化，并且不形成子代噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第37頁!3、具有較高容量的克隆能力；分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達到45kb最低極限，如果柯斯質粒有5kb，外源必需要至少30kb4、具有與同源性序列的質粒進行重組的能力在同一個宿主中的柯斯質粒和質粒會形成共合體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第38頁!三、柯斯克隆柯斯克隆（cosmindcloning）：在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA的技術依據原理:λ噬菌體在生命周期可以產生數百個由cos位點連接的多連體分子噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第39頁!DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidclone噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第40頁!四、柯斯克隆的改良優點：1、兼具質粒和噬菌體的特性，提高了克隆容量，對于構建真核生物基因文庫十分有用；2、形成的非重組體克隆本底比較低噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第41頁!②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結果使在基因組內本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第42頁!1、Ish－Horowicz－Burke柯斯克隆方案pJB8是由高拷貝的質粒pAT153派生而來，能夠克隆大片段的外源DNA，適合于真核基因文庫構建特點：在BamHⅠ兩端各有一個EcoRⅠ噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第43頁!2、Bates－Swift柯斯克隆方案c2XB具有兩個cos位點，一個BamH和SmaⅠ切點c2XB6.8kbcoscosBamHⅠSmaⅠSmaⅠBamHⅠcoscosSmaⅠ平末端BamHⅠBamHⅠSmaⅠ平末端真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第44頁!第四節單鏈DNA噬菌體載體單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd優越性：1、單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環形的DNA為媒介的，這種復制形式的DNA簡稱RFDNA；2、不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第45頁!一、M13噬菌體生物學特性M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第46頁!10個基因，90％以上都編碼蛋白質僅有2個基因間隔區間隔區基因Ⅷ——噬菌體顆粒的主要結構蛋白基因Ⅲ——噬菌體顆粒的次要結構蛋白基因Ⅱ——在RFDNA上形成切口

基因Ⅴ作用——單鏈DNA結合蛋白噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第47頁!3、進行θ復制后，在基因Ⅱ的作用下，在RFDNA正鏈的特定位點上作切割反應4、利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，M13（－）為模板合成正鏈5、基因Ⅱ切割出完整的M13（＋）6、環化返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第48頁!形態建成：

基因Ⅴ蛋白－DNA（正鏈）復合物移動至細菌的細胞膜的同時，基因Ⅴ蛋白脫落，病毒基因組從細菌溢出時被衣殼蛋白包裹噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第49頁!proAB：細菌脯氨酸合成酶編碼區，proAB常出現在F’附加體上，可以彌補宿主的基因缺失，以確保F’在宿主體內穩定traD36：抑制F’接合轉移△（lac－proAB）：缺失乳糖操縱子及比鄰的脯氨酸生物合成酶類的編碼基因，這類寄主不能利用乳糖，生長必需脯氨酸噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第50頁!M13克隆載體分子結構圖噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第51頁!3、對克隆基因的調節控制——lacIqlacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，合成大量的阻遏物阻止M13載體表達。加入誘導物IPTG，可以誘導合成Xgal顯色底物噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第52頁!返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第53頁!返回噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第54頁!M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRI

BP

PBBP

BPPBBamHI&PstI噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第55頁!非展示系統展示系統噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第56頁!LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達型噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第57頁!biotin

antigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第58頁!Washtoremoveunboundphageparticles.噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第59頁!AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和擴增二、噬菌體抗體庫展示技術back噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第60頁!噬菌粒的特點比M13小，約為3000bp，易于體外操作，可以克隆10kb外源兩種復制方式可以得到直接用于測序的單鏈結構，免去了從質粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第61頁!二、噬菌粒載體pUC118和pUC119

在pUC18和19的NdeⅠ位點上插入來源于M13的IG區，長度476bp，含有M13的復制起點噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第62頁!在pUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當中的一個可轉錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉錄出負鏈DNA；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第63頁!三、輔助噬菌體M13KO7輔助噬菌體（一）結構M13的衍生株，大小為8.7kb來自p15A質粒的復制起點，因此可以象質粒一樣復制，且可以與帶ColE1的質粒共存于同一個宿主菌中。來自轉座子Tn903的卡那霉素抗性基因（kanr）基因Ⅱ帶有一個G至T的突變（第6125核苷酸），40位氨基酸由甲硫氨酸變為異亮氨酸。

噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第64頁!當M13K07感染帶有噬菌粒的大腸桿菌后，如E.coli（pUC118），進入宿主細胞內的單鏈DNA，在宿主胞內酶的作用下轉變為雙鏈形式，后者可在質粒p15A的復制起點控制下進行復制。細胞內M13K07雙鏈DNA的積累并不需要病毒基因產物，細胞內的噬菌粒幾乎沒有機會干擾所進入的M13K07病毒基因組的早期復制。（二）作用噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第65頁!三、pBluescript噬菌粒載體（一）基本結構

1、在多克隆位點的兩側，有一對T3和T7噬菌體的啟動子，可以定向指導外源基因的轉錄活動；

2、同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，在不同的情況下，可以采取不同的復制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第66頁!T7T3用于體外轉錄總結噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第67頁!可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能：1、保護自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環境化學物質的破壞；2、將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞；3、將被感染的細菌細胞轉變成制造噬菌體的體系，從而生長出大量的子代噬菌體顆粒；4、使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第68頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第69頁!二、噬菌體的感染性噬菌斑形成噬菌體感染高濃度細菌在未發生次裂解前涂布平板噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第70頁!噬菌體的感染過程尾部粘至細胞壁尾部蛋白質收縮核酸注入細菌利用細菌的RNA聚合酶和核糖體翻譯得到噬菌體蛋白使細菌的DNA降解合成自身的DNA至數百個拷貝合成頭部尾部蛋白進行組裝噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第71頁!四、噬菌體的溶源生命周期溶源生長周期：是指在感染過程中沒有產生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。現知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第72頁!整合：噬菌體的DNA是被包容在寄主細胞染色體DNA中原噬菌體：在溶源細菌內存在的整合的或非整合的噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第73頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第74頁!3、超感染免疫性（1）溶源細菌的兩個重要特點：不能被頭一次感染的噬菌體再次感染，稱為超感染免疫性；經過許多世代以后，溶源性細菌可以進入溶菌周期，稱為溶源性誘發。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第75頁!②溶源噬菌體的誘發依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉錄。需要刪除酶將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環形的DNA分子，恢復溶源周期開始時的狀態。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第76頁!五、重組噬菌體的分離大腸桿菌培養至對數生長期?加入λ噬菌體懸浮液，37℃培養1小時?用新鮮培養稀釋，繼續培養4-12小時?高速離心，沉淀噬菌體?苯酚抽提，釋放λ-DNA?乙醇或異丙醇沉淀DNA。back噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第77頁!λ噬菌體分子量31×106dal，中等大小的溫和噬菌體，目前已經定位61個基因，其中一半參與了生命周期，為必要基因；余下的為非必要基因。溶菌階段(復制和釋放)

溶源階段

(整合寄主染色體)噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第78頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第79頁!

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第80頁!COSAWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxis

gamredcIIIN

COS頭部基因尾部基因功能不明區溶源化重組早期控制阻遏DNA合成溶菌生長非必要區段cI基因：溶源過程控制基因λ噬菌體的基因組結構噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第81頁!早期蛋白不表達，晚期蛋白表達噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第82頁!DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第83頁!（一）插入式載體λ噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。1、cI基因插入失活如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶源化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第84頁!LacZ基因插入失活：如charon16A，λgt11載體，在非必需區段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRⅠ位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

lacZLA19.9RA21.9EcoRIcharon16A噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第85頁!（二）λ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109

轉化株/ug載體DNA，比質粒高100-倍)替換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。eg:

EMBL3,DASH噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第86頁!λEMBL3/4、Charon40噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第87頁!在λNM781替換型載體中，可取代的EcoRⅠ片段，編碼有一個supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種λNM781噬菌體感染細胞后，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養基上產生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養基上只能產生出無色的噬菌斑。λNM781噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第88頁!λ取代載體2、組裝連接3、侵染噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第89頁!（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第90頁!1、Spi-正選擇的λ噬菌體載體λ1059、λL47.1Spi-重組體的篩選野生型λ噬菌體不能在攜帶有P2原噬菌體的溶源菌中生長，λ的這種表型稱為Spi+(對P2的干擾敏感)但是當λ基因組中缺少參與重組的兩個基因red和gam時，λ突變體可以在P2溶原菌中生長，其表型稱為Spi-。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第91頁!recA＋的P2溶源菌噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第92頁!recA＋的P2溶原菌red-gam-：利用大腸桿菌的重組酶（recA＋），通過單體λDNA間的重組作用，產生出成熟的多聯體λDNA以進行包裝，大腸桿菌的重組系統依賴于recA基因。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第93頁!chi位點：與重組事件有關聯的DNA序列，激活以rec為媒介的交換反應，是recB、C系統催化重組作用的底物。但RecB、C重組酶的活性可被基因gam的產物所抑制。因此對于red-、gam-突變體或因外源DNA的插入而呈Spi-表型的重組體而言，chi位點的引人會使噬菌體生長繁殖力變強，噬斑增大。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第94頁!體外包裝：把重組體DNA分子包裝成成熟的噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導入宿主細胞，可以提高轉染效率，可達107左右。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第95頁!λ重組體DNA的體外包裝：在體外試管中完成上述反應，利用D基因突變和E基因突變。E基因琥珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部D基因琥珀突變（Dam），λ重組體DNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第96頁!由于λ噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%～105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長度上限是51kb，必需基因為28kb，外源極限在23kb。3、λ噬菌體的包裝限制噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第97頁!λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價值的克隆載體，具有很多優點：①其分子遺傳學背景十分清楚；②載體容量較大，一般質粒載體只能容納10多個kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第98頁!back噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第99頁!一、柯斯質粒載體的構建cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第100頁!柯斯質粒pHC79系由質粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構成全長4.3kb，克隆能力為31～45kb，能夠被包裝成具有感染性能的噬菌體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第101頁!2、具有質粒載體的特性；含有質粒復制子，進入寄主后可以象質粒一樣復制，抗菌素抗性標記可以進行篩選噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第102頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第103頁!末端酶（Ter體系）：能識別兩個相距適宜的cos位點，將多聯體切割成單位長度的片段，并包裝至頭部，作用有效范圍，兩個cos之間相距38～54kb。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第104頁!噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第105頁!采用柯斯質粒作載體的困難①載體自身只相當于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現載體同載體自身連接，結果在一個重組分子內可有幾個柯斯質粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第106頁!③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間。現雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質粒制成的基因文庫常常不太穩定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第107頁!cosBamHⅠHindⅢpJB8SalⅠHindⅢ、磷酸酶SalⅠ、磷酸酶cosOHOHSalⅠBamHⅠBamHⅠcosOHOHSalⅠppcosOHOHBamHⅠBamHⅠcosOHOHppHindⅢ真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第108頁!3、其他柯斯克隆方案（1）在多克隆位點兩側引入T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子（圖5-23）（2）構建與大腸桿菌質粒沒有同源性序列的克斯載體，避免重組（3）導入真核生物的選擇性標記，做為穿梭載體噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第109頁!3、單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4、容易測定外源DNA片斷的插入取向；5、可產生含外源片斷的單鏈DNA分子。噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第110頁!感染方式M13噬菌體是大腸桿菌特有的噬菌體，只能感染帶有F性須的菌株通過人工方式可以轉染雌性的大腸桿菌噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第111頁!RFDNA復制方式：1、M13正鏈在基因Ⅲ編碼的蛋白作用下進入大腸桿菌細胞，合成出M13（－）鏈，雙鏈DNA為復制型（RFDNA）2、開始θ型復制噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第112頁!PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolI±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第113頁!二、M13噬菌體載體的寄主菌由于M13噬菌體通過F因子編碼的菌毛進入宿主細胞，故只能用雄性細菌來增殖病毒。lacZ△M15：缺失lacZ基因中β-半乳糖苷酶的N端部分編碼序列，很多宿主菌的F’附加體帶有這種缺失的lacZ基因。lacIq：lacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，很多宿主菌的F’附加體帶有這種lacIq和lacZ△M15基因。JM101：△（lac－proAB）

F’traD36

proAB＋

lacIqlacZ△M15噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第114頁!1、M13載體系列的發展IGIG區段：位于基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，長度507核苷酸

M13mpn：由M13mp1衍生而來三、M13克隆體系噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第115頁!2、α互補作用M13載體：編碼β-半乳糖苷酶的N端，來源于β-半乳糖苷酶基因的HindⅡ酶切片段F’附加體：含有lacZ△M15基因，缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第11-41個氨基酸的lacZ基因，不能形成四聚體。藍白篩選噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第116頁!Blue-whiteselection噬菌體載體和柯斯載體共132頁，您現在瀏覽的是第117頁!四、M13載體系列的優點1、在這類載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段（HindⅡ片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點的序列；2、M13載體系列是應用基因工程技術成對地構建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。