高效液相色譜分析法一、高效液相色譜儀HPLC二、高效液相色譜法的特點(diǎn)featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器highperformanceliquidchromatograph（HPLC）featureandinstrumentofHPLC2022/12/91引言高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑1~5cm,長(zhǎng)50~500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150~200m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(<1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說(shuō)柱效下降了。為了解決分析時(shí)間及柱效問(wèn)題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10m）！

直到60年代末70年代初，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問(wèn)題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。2022/12/921.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。2.HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用小；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。2022/12/933.應(yīng)用

由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過(guò)HPLC來(lái)完成的。右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對(duì)象極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過(guò)濾分子量2022/12/94一、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2022/12/95液相色譜儀（2）2022/12/96液相色譜儀（3）2022/12/97液相色譜儀（4）2022/12/98高效液相色譜儀（5）AgilentTechnologies11002022/12/99二、高效液相色譜法的特點(diǎn)

featureofHPLC

液相色譜法：流動(dòng)相為液體的色譜分離分析技術(shù)

特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、高度自動(dòng)化高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2022/12/910三、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程HPLC儀器結(jié)構(gòu)示意圖（方框圖）2022/12/911檢測(cè)器高壓輸液泵高壓輸液泵輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2022/12/9122.主要部件p80-90(1)高壓輸液泵p80主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性（動(dòng)畫）2022/12/913(2)梯度淋洗

（洗提、洗脫）

裝置p82內(nèi)（高壓）梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。外（低壓）梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)改變載液中溶劑即流動(dòng)相的配比和極性以提高分離效果（類似GC中的程序升溫）2022/12/914(3)進(jìn)樣裝置p83

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/915(4)高效分離柱p84

柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)徑4.6或3.9mm，柱長(zhǎng)15～30cm，填料顆粒粒度5－10μm,柱效7000-10000。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度(3－5μm)和柱徑以提高柱效。2022/12/916(5)液相色譜檢測(cè)器p84-90

a.紫外檢測(cè)器(ultravioletphotometricdetector)原理：朗伯比爾定律。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)，靈敏度高，線性范圍寬。是高效液相色譜儀的標(biāo)準(zhǔn)配置。它的最重要特征是對(duì)流動(dòng)相的流速（脈沖）和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫。其次，流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL)。固定波長(zhǎng)－汞燈254、280nm,可變波長(zhǎng)－氘燈200－450nm.光路長(zhǎng)5－10mm。缺點(diǎn)：對(duì)無(wú)紫外吸收的組分不響應(yīng)，而對(duì)紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動(dòng)相使用。

雙光路紫外檢測(cè)器2022/12/917b.光電二極管陣列檢測(cè)器(photo-diodearraydetector;PDAD)紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/9182022/12/919光電二極管陣列檢測(cè)器2022/12/920c.示差折光檢測(cè)器

p87（differentialrefractiveindexdetector）

原理：通過(guò)連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折射率之差值來(lái)測(cè)定樣品濃度（折射率差值與濃度呈正比）。

特點(diǎn)：通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折射率）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫。結(jié)構(gòu)：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種入射角不變時(shí)，光速折射偏轉(zhuǎn)角是介質(zhì)中成分變化的函數(shù)。2022/12/921示差折光檢測(cè)器2022/12/922d.熒光檢測(cè)器

p88（fluorescencedetector）特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。原理：有機(jī)共軛芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后發(fā)出熒光。結(jié)構(gòu)：直角型結(jié)構(gòu)。2022/12/923e.電導(dǎo)檢測(cè)器p89

（electricalconductivitydetector）原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后產(chǎn)生電導(dǎo)變化來(lái)測(cè)定電離物質(zhì)的含量。特點(diǎn)：廣泛用于離子色譜儀中。應(yīng)用于能電離成離子物質(zhì)的檢測(cè)。響應(yīng)受溫度影響較大。結(jié)構(gòu)：由一對(duì)平行的鉑電極（表面鍍鉑黑以增加表面積）和池體構(gòu)成電導(dǎo)檢測(cè)池，兩電極構(gòu)成電橋的一個(gè)測(cè)量臂。2022/12/924請(qǐng)選擇內(nèi)容第一節(jié)高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器featureandinstrumentofHPLC第二節(jié)基本原理與主要分離類型basicprincipleandmainseparatingtype第三節(jié)固定相與流動(dòng)相stationary