第一章蛋白質(zhì)化學(xué)教學(xué)目標(biāo)：掌握蛋白質(zhì)的概念、重要性和分子組成。2?掌握a-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式和20種氨基酸的名稱、符號、結(jié)構(gòu)、分類；掌握氨基酸的重要性質(zhì)；熟悉肽和活性肽的概念。3?掌握蛋白質(zhì)的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及其重要化學(xué)鍵。了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系。熟悉蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)和分類導(dǎo)入：100年前，恩格斯指出“蛋白體是生命的存在形式”；今天人們?nèi)绾握J(rèn)識蛋白質(zhì)的概念和重要性？1839年荷蘭化學(xué)家馬爾德（G.J.Mulder）研究了乳和蛋中的清蛋白，并按瑞典化學(xué)家Berzelius的提議把提取的物質(zhì)命名為蛋白質(zhì)（Protein,源自希臘語，意指“第一重要的”）德國化學(xué)家費(fèi)希爾（E.Fischer）研究了蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，在1907年奠立蛋白質(zhì)化學(xué)。英國的鮑林（L.Pauling）在1951年推引出蛋白質(zhì)的螺旋；桑格（F.Sanger）在1953年測出胰島素的一級結(jié)構(gòu)。佩魯茨（M.F.Perutz）和肯德魯（J.C.kendrew）在1960年測定血紅蛋白和肌紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。1965年，我國生化學(xué)者首先合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)胰島素（insulin）。蛋白質(zhì)是由L-a-氨基酸通過肽鍵縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象和一定生物功能的生物大分子（biomacromolecule）。蛋白質(zhì)是生命活動所依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物體中含量最豐富的大分子。單細(xì)胞的大腸桿菌含有3000多種蛋白質(zhì)，而人體有10萬種以上結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白質(zhì)，人體干重的45%是蛋白質(zhì)。生命是物質(zhì)運(yùn)動的高級形式，是通過蛋白質(zhì)的多種功能來實(shí)現(xiàn)的。新陳代謝的所有的化學(xué)反應(yīng)幾乎都是在酶的催化下進(jìn)行的，已發(fā)現(xiàn)的酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)。生命活動所需要的許多小分子物質(zhì)和離子，它們的運(yùn)輸由蛋白質(zhì)來完成。生物的運(yùn)動、生物體的防御體系離不開蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在遺傳信息的控制、細(xì)胞膜的通透性，以及高等動物的記憶、識別機(jī)構(gòu)等方面都起著重要的作用。隨著蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起和發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識越來越深刻。第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成一、蛋白質(zhì)的元素組成經(jīng)元素分析，主要有C（50%?55%）、H（6%?7%）、O（19%?24%）、N（13%?19%）、S（0%?4%）。有些蛋白質(zhì)還含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。因此，可以用定氮法來推算樣品中蛋白質(zhì)的大致含量。每克樣品含氮克數(shù)X6.25X100=100g樣品中蛋白質(zhì)含量（g%）二、蛋白質(zhì)的基本組成單位——氨基酸蛋白質(zhì)在酸、堿或蛋白酶的作用下，最終水解為游離氨基酸（aminoacid），即蛋白質(zhì)組成單體或構(gòu)件分子。存在于自然界中的氨基酸有300余種，但合成蛋白質(zhì)的氨基酸僅20種（稱編碼氨基酸），最先發(fā)現(xiàn)的是天門冬氨酸（1806年），最后鑒定的是蘇氨酸（1938年）。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1?氨基連接在a-C上，屬于a-氨基酸（脯氨酸為a-亞氨基酸）。R是側(cè)鏈，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型。注意：構(gòu)型是指分子中各原子的特定空間排布，其變化要求共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。旋光性是異構(gòu)體的光學(xué)活性，是使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)的性質(zhì)，（-）表示左旋，（+）表示右旋。構(gòu)型與旋光性沒有直接對應(yīng)關(guān)系。（二）氨基酸的分類按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為脂肪族、芳香族、雜環(huán)、雜環(huán)亞氨基酸四類。按R基的極性和在中性溶液的解離狀態(tài)分為非極性氨基酸、極性不帶電荷、極性帶負(fù)電荷或帶正電荷的四類。帶有非極性R（烴基、甲硫基、吲哚環(huán)等，共9種）：甘（Gly）、丙（Ala）、纈（Val）、亮（Leu）、異亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、脯（Pro）、色（Trp）帶有不可解離的極性R（羥基、巰基、酰胺基等，共6種）：絲（Ser）、蘇（Thr）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、酪（Tyr）、半（Cys）帶有可解離的極性R基（共5種）：天（Asp）、谷（Glu）、賴（Lys）、精（Arg）、組（His），前兩個(gè)為酸性氨基酸，后三個(gè)是堿性氨基酸。蛋白質(zhì)分子中的胱氨酸是兩個(gè)半胱氨酸脫氫后以二硫鍵結(jié)合而成，膠原蛋白中的羥脯氨酸、羥賴氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白質(zhì)加工修飾而成。（三）氨基酸的重要理化性質(zhì)1．一般物理性質(zhì)a-氨基酸為無色晶體，熔點(diǎn)一般在200oC以上。各種氨基酸在水中的溶解度差別很大（酪氨酸不溶于水）。一般溶解于稀酸或稀堿，但不能溶解于有機(jī)溶劑，通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）有共軛雙鍵，在近紫外區(qū)有光吸收能力，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265nm。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)含Tyr、Trp殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。兩性解離和等電點(diǎn)（isoelectriepoint,pl）氨基酸在水溶液或晶體狀態(tài)時(shí)以兩性離子的形式存在，既可作為酸（質(zhì)子供體），又可作為堿（質(zhì)子受體）起作用，是兩性電解質(zhì)，其解離度與溶液的pH有關(guān)。在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢和程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。氨基酸的pl是由a-羧基和a-氨基的解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)pK1和pK2決定的。計(jì)算公式為：pI=l/2（pKl+pK2）。若1個(gè)氨基酸有3個(gè)可解離基團(tuán)，寫出它們電離式后取兼性離子兩邊的pK值的平均值，即為此氨基酸的等電點(diǎn)（酸性氨基酸的等電點(diǎn)取兩羧基的pK值的平均值，堿性氨基酸的等電點(diǎn)取兩氨基的pK值的平均值）。氨基酸的化學(xué)反應(yīng)氨基酸的化學(xué)反應(yīng)是其基團(tuán)的特征性反應(yīng)。重要的有：（1）茚三酮反應(yīng)所有具有自由a-氨基的氨基酸與過量茚三酮共熱形成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)）。用分光光度法可定量測定微量的氨基酸。藍(lán)紫色化合物的最大吸收峰在570nm波長處,黃色在440nm波長下測定。吸收峰值的大小與氨基酸釋放的氨量成正比。（2）與2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反應(yīng)在弱堿性溶液中，氨基酸的a-氨基很容易與DNFB作用生成穩(wěn)定的黃色2,4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），這一反應(yīng)在蛋白質(zhì)化學(xué)的研究史上起過重要作用，Sanger等人應(yīng)用它測定胰島素一級結(jié)構(gòu)。多肽順序自動分析儀是根據(jù)相類似的原理設(shè)計(jì)的，即利用多肽鏈N端氨基酸的a-氨基與異硫氰酸苯酯PITC反應(yīng)（Edman降解法）。三、肽（peptide）肽鍵與肽鏈一個(gè)氨基酸的a-羧基和另一個(gè)氨基酸的a-氨基脫水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。由氨基酸通過肽鍵相連而成的化合物稱為肽。肽鍵及其兩端的a-碳原子相連所形成的長鏈骨架，即一Ca—C—N—Ca—C—N—Ca—C—N—Ca…稱為多肽主鏈，一CaCN—是重復(fù)單位。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中的主要共價(jià)鍵。多肽鏈的方向性是從N末端指向C末端。肽分子中不完整的氨基酸稱為氨基酸殘基。肽按其序列從N端到C端命名。一般10肽以下屬寡肽，10肽以上為多肽。生物活性肽（1）谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由Glu、Cys、Gly組成的一種三肽，又叫Y-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（含Y-肽鍵）。Cys的-SH是主要功能基團(tuán)，GSH是一種抗氧化劑，是某些酶的輔酶，可保護(hù)蛋白質(zhì)分子中的-SH免遭氧化，保護(hù)巰基蛋白和酶的活性。在GSH過氧化物酶的作用下，GSH還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，生成H2O，2分子GSH被氧化成GSSG，后者在GSH還原酶催化下，又生成GSH。（2）多肽類激素和神經(jīng)肽人體內(nèi)有許多激素屬寡肽或多肽，如下丘腦—垂體分泌的催產(chǎn)素（9肽）、加壓素（9肽）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH，39肽）等。催產(chǎn)素和加壓素結(jié)構(gòu)僅第3、第8位兩個(gè)氨基酸殘基不同，前者使平滑肌收縮，有催產(chǎn)和使乳腺泌乳的作用；后者能使小動脈收縮，增高血壓，也有減少排尿的作用。神經(jīng)肽是在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的肽類。如腦啡肽（5肽）、B-內(nèi)啡肽（31肽）、強(qiáng)啡肽（17肽）等。隨著腦科學(xué)的發(fā)展，會發(fā)現(xiàn)更多的生物活性肽。第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是生物大分子，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，人們用4個(gè)層次來描述，包括蛋白質(zhì)的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)描述的是蛋白質(zhì)的線性（或一維）結(jié)構(gòu)，即共價(jià)連接的氨基酸殘基的序列，又稱初級或化學(xué)結(jié)構(gòu)。二級以上的結(jié)構(gòu)稱高級結(jié)構(gòu)或構(gòu)象（conformation）。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）1953年，英國科學(xué)家F.Sanger首先測定了胰島素（insulin）的一級結(jié)構(gòu)，有51個(gè)氨基酸殘基，由一條A鏈和一條B鏈組成，分子中共有3個(gè)二硫鍵，其中兩個(gè)在A、B鏈之間，另一個(gè)在A鏈內(nèi)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定或稱序列分析常用的方法是Edman降解和重組DNA法。Edman降解是經(jīng)典的化學(xué)方法，比較復(fù)雜。首先要純化一定量的待測蛋白質(zhì)，分別作分子量測定、氨基酸組成分析、N-末端分析、C-末端分析；要應(yīng)用不同的化學(xué)試劑或特異的蛋白內(nèi)切酶水解將蛋白質(zhì)裂解成大小不同的肽段，測出它們的序列，對照不同水解制成的兩套肽段，找出重疊片段，最后推斷蛋白質(zhì)的完整序列。重組DNA法是基于分子克隆的分子生物學(xué)方法，比較簡單而高效，不必先純化該種蛋白質(zhì)，而是先要得到編碼該種蛋白質(zhì)的基因（DNA片段），測定DNA中核苷酸的序列，再按三個(gè)核苷酸編碼一個(gè)氨基酸的原則推測蛋白質(zhì)的完整序列。這兩種方法可以相互印證和補(bǔ)充。目前，國際互聯(lián)網(wǎng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已有3千多種一級結(jié)構(gòu)清楚。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指其分子中主鏈原子的局部空間排列，是主鏈構(gòu)象（不包括側(cè)鏈R基團(tuán)）。構(gòu)象是分子中原子的空間排列，但這些原子的排列取決于它們繞鍵的旋轉(zhuǎn)，構(gòu)象不同于構(gòu)型，一個(gè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象在不破壞共價(jià)鍵情況下是可以改變的。但是蛋白質(zhì)中任一氨基酸殘基的實(shí)際構(gòu)象自由度是非常有限的，在生理?xiàng)l件下，每種蛋白質(zhì)似乎是呈現(xiàn)出稱為天然構(gòu)象的單一穩(wěn)定形狀。20世紀(jì)30年代末，L.Panling和R.B.Corey應(yīng)用X射線衍射分析測定了一些氨基酸和寡肽的晶體結(jié)構(gòu)，獲得了一組標(biāo)準(zhǔn)鍵長和鍵角，提出了肽單元（peptideunit）的概念，還提出了兩種主鏈原子的局部空間排列的分子模型（a-螺旋）和（B-折疊）。1．肽單位肽鍵及其兩端的a-C共6個(gè)原子處于同一平面上，組成了肽單位（所在的平面稱肽鍵平面）。肽鍵C—N鍵長為0.132nm，比相鄰的單鍵（0.147nm）短，而較C=N雙鍵（0.128nm）長，有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵平面上各原子呈順反異構(gòu)關(guān)系，肽鍵平面上的0、H以及2個(gè)a-碳原子為反式構(gòu)型（transconfiguration）。主鏈中的Ca—C和Ca—N單鍵可以旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)角?、2決定了兩個(gè)相鄰的肽鍵平面相對關(guān)系。由于肽鍵平面的相對旋轉(zhuǎn)，使主鏈可以以非常多的構(gòu)象出現(xiàn)。事實(shí)上，肽鏈在構(gòu)象上受到很大限制，因?yàn)橹麈溕嫌?/3不能自由旋轉(zhuǎn)的肽鍵，另外主鏈上有很多側(cè)鏈R的影響。蛋白質(zhì)的主鏈骨架由許多肽鍵平面連接而成。a-螺旋（a-helix）a-螺旋是肽鍵平面通過a-碳原子的相對旋轉(zhuǎn)形成的一種緊密螺旋盤繞，是有周期的一種主鏈構(gòu)象。其特點(diǎn)是：螺旋每轉(zhuǎn)一圈上升3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距約0.54nm（每個(gè)殘基上升0.15nm，旋轉(zhuǎn)1000）。相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。典型a-螺旋一對氫鍵0與N之間共有13個(gè)原子（3.613），前后間隔3個(gè)殘基。螺旋的走向絕大部分是右手螺旋，殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)。R基團(tuán)的大小、荷電狀態(tài)及形狀均對a-螺旋的形成及穩(wěn)定有影響。B-折疊（B-pleatedsheet）B-折疊是一種肽鏈相當(dāng)伸展的周期性結(jié)構(gòu)。相鄰肽鍵平面間折疊成1100角，呈鋸齒狀。兩個(gè)以上具B-折疊的肽鏈或同一肽鏈內(nèi)不同肽段相互平行排列，形成B-折疊片層，其穩(wěn)定因素是肽鏈間的氫鍵。逆向平行的片層結(jié)構(gòu)比順向平行的穩(wěn)定。a-螺旋和B-折疊是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式。毛發(fā)中的a-角蛋白和蠶絲中的絲心蛋白是其典型，在許多球蛋白中也存在，但所占比例不一樣。膠原蛋白中存在的螺旋結(jié)構(gòu)不同于一般的a-螺旋，是由3條具有左手螺旋的鏈相互纏繞形成右手超螺旋分子。鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持其穩(wěn)定性。B-轉(zhuǎn)角（B-turn）為了緊緊折疊成球蛋白的緊密形狀，多肽鏈1800回折成發(fā)夾或B-轉(zhuǎn)角。其處由4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成，常有Gly和Pro存在，穩(wěn)定B-轉(zhuǎn)角的作用力是第一個(gè)氨基酸殘基羰基氧（0）與第四個(gè)氨基酸殘基的氨基氫（H）之間形成的氫鍵°B-轉(zhuǎn)角常見于連接反平行B-折疊片的端頭。無規(guī)卷曲（randomcoil）多肽鏈的主鏈呈現(xiàn)無確定規(guī)律的卷曲。典型球蛋白大約一半多肽鏈?zhǔn)沁@樣的構(gòu)象。超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)二級至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象。超二級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)中兩個(gè)或三個(gè)具有二級結(jié)構(gòu)的肽段在空間上相互接近，形成一特殊的組合體，又稱為模體（motif）。通常有aa，BB，BaB等，例如鈣結(jié)合蛋白質(zhì)中的螺旋-環(huán)-螺旋模序及鋅指結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位，是在超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊有獨(dú)特構(gòu)象和部分生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)。對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)是一個(gè)意思，即這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的；對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上的相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域締合成三級結(jié)構(gòu)。三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（tertiarystrueture）指一條多肽鏈中所有原子的整體排布，包括主鏈和側(cè)鏈。維系三級結(jié)構(gòu)的作用力主要是次級鍵（疏水相互作用、靜電力、氫鍵等）。在序列中相隔較遠(yuǎn)的氨基酸疏水側(cè)鏈相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基往往鑲嵌其內(nèi)，形成功能活性部位，而親水基團(tuán)則在外，這也是球狀蛋白質(zhì)易溶于水的原因。1963年Kendrew等從鯨肌紅蛋白的X射線衍射圖譜測定它的三級結(jié)構(gòu)（153個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)血紅素輔基，相對分子質(zhì)量為17800）。由A-H8段a-螺旋盤繞折疊成球狀，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部形成一個(gè)袋形空穴，血紅素居于其中，富有極性及電荷的則在分子表面形成親水的球狀蛋白。四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）有些蛋白質(zhì)的分子量很大，由2條或2條以上具有獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價(jià)鍵相互結(jié)合而成，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。構(gòu)成四級結(jié)構(gòu)的每條多肽鏈稱為亞基（subunit），亞基單獨(dú)存在時(shí)一般沒有生物學(xué)功能，構(gòu)成四級結(jié)構(gòu)的幾個(gè)亞基可以相同或不同。如血紅蛋白（hemoglobin,Hb）是由兩個(gè)a-亞基和兩個(gè)B-亞基形成的四聚體（a2B2）。五、蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是由共價(jià)鍵形成的，如肽鍵和二硫鍵。而維持空間構(gòu)象穩(wěn)定的是非共價(jià)的次級鍵。如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華引力等。第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)20世紀(jì)60年代初，美國科學(xué)家C.Anfinsen進(jìn)行牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的命題。核糖核酸酶由124個(gè)氨基酸殘基組成，有4對二硫鍵。用尿素和B-巰基乙醇處理該酶溶液，分別破壞次級鍵和二硫鍵，肽鏈完全伸展，變性的酶失去催化活性；當(dāng)用透析方法去除變性劑后，酶活性幾乎完全恢復(fù)，理化性質(zhì)也與天然的酶一樣。概率計(jì)算表明，8個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合成4對二硫鍵，可隨機(jī)組合成105種配對方式，而事實(shí)上只形成了天然酶的構(gòu)象，這說明一級結(jié)構(gòu)未破壞，保持了氨基酸的排列順序就可能回復(fù)到原來的三級結(jié)構(gòu)，功能依然存在。（二）種屬差異大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似，不同種屬的同源蛋白質(zhì)有同源序列，反映其共同進(jìn)化起源，通過比較可以揭示進(jìn)化關(guān)系。例如哺乳動物的胰島素，其一級結(jié)構(gòu)僅個(gè)別氨基酸差異（A鏈5、6、10位，B鏈30位），它們對生物活性調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能不起決定作用。從各種生物的細(xì)胞色素C（cytochromee）的一級結(jié)構(gòu)分析，可以了解物種進(jìn)化間的關(guān)系。進(jìn)化中越接近的生物，它們的細(xì)胞色素e的一級結(jié)構(gòu)越近似。（三）分子病分子病是指機(jī)體DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子異常和蛋白質(zhì)生物合成的異常，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體某些功能和結(jié)構(gòu)隨之變異的遺傳病。在1904年，發(fā)現(xiàn)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病。大約化費(fèi)了40多年才清楚患病原因，患者的血紅蛋白（HbS）與正常人的（HbA）相比，僅B-鏈的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已發(fā)現(xiàn)有異常血紅蛋白400種以上。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，空間結(jié)構(gòu)變化，其功能也隨之改變。肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）是典型的例子。肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）都能與氧進(jìn)行可逆的結(jié)合，氧結(jié)合在血紅素輔基上。然而Hb是四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運(yùn)氧；Mb是單體，可以儲存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地?cái)U(kuò)散。它們的氧合曲線不同，Mb為一條雙曲線，Hb是一條S型曲線。在低p（02）下，肌紅蛋白比血紅蛋白對氧親和性高很多，p（02）為2.8torr（ltorr~133.3Pa）時(shí)，肌紅蛋白處于半飽和狀態(tài)。在高p（O2）下，如在肺部（大約100torr）時(shí)，兩者幾乎都被飽和。其差異形成一個(gè)有效的將氧從肺轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉的氧轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Hb未與氧結(jié)合時(shí)，其亞基處于一種空間結(jié)構(gòu)緊密的構(gòu)象（緊張態(tài)，T型），與氧的親和力小。只要有一個(gè)亞基與氧結(jié)合，就能使4個(gè)亞基間的鹽鍵斷裂，變成松弛的構(gòu)象（松弛態(tài)，R型）。T型和R型的相互轉(zhuǎn)換對調(diào)節(jié)Hb運(yùn)氧的功能有重要作用。一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后能促進(jìn)另一亞基與配體的結(jié)合是正協(xié)同效應(yīng)，其理論解釋是Hb是別構(gòu)蛋白，有別構(gòu)效應(yīng)。第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和氨基酸相似，有兩性解離及等電點(diǎn)、紫外吸收和呈色反應(yīng)。作為生物大分子，還有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點(diǎn)。要了解和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系就要利用其特殊的理化性質(zhì)，采取鹽析、透析、電泳、層析及離心等不損傷蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的物理方法分離純化蛋白質(zhì)。一、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在1萬~100萬，其顆粒平均直徑約為4.3nm（膠粒范圍是l~100nm）。準(zhǔn)確可靠的測定方法是超離心法，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可用沉降系數(shù)（S）表示。在球狀蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成時(shí)，親水基團(tuán)位于分子表面，在水溶液中與水起水合作用，因此，蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì)。顆粒表面的水化膜和電荷是其穩(wěn)定的因素，調(diào)節(jié)pH至pl、加入脫水劑等，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。透析法是利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，去掉小分子物質(zhì)，達(dá)到純化的目的。大小不同的蛋白質(zhì)分子可以通過凝膠過濾分開。又稱分子篩層析。二、蛋白質(zhì)的兩性解離蛋白質(zhì)和氨基酸一樣是兩性電解質(zhì)，在溶液中的荷電狀態(tài)受pH值影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)°pH>pI時(shí)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。在人體體液中多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)接近pH5,所以在生理pH7.4環(huán)境下，多數(shù)蛋白質(zhì)解離成陰離子。少量蛋白質(zhì)，如魚精蛋白、組蛋白的pl偏于堿性，稱堿性蛋白質(zhì)，而胃蛋白酶和絲蛋白為酸性蛋白。三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下，空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致理化性質(zhì)改變，生物學(xué)活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性（denaturation）。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是多肽鏈從卷曲到伸展的過程，不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變（如加熱破壞氫鍵，酸堿破壞鹽鍵等）。變性作用不過于劇烈，是一種可逆反應(yīng)，去除變性因素，有些蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象和功能可恢復(fù)或部分恢復(fù)，稱為復(fù)性（denaturation）。蛋白質(zhì)變性的主要表現(xiàn)是失去生物學(xué)活性，如酶失去催化能力、血紅蛋白失去運(yùn)輸氧的功能、胰島素失去調(diào)節(jié)血糖的生理功能等。變性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白質(zhì)變性具有重要的實(shí)際意義。蛋白質(zhì)自溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的沉淀。鹽析、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑都可沉淀蛋白質(zhì)。鹽析沉淀蛋白質(zhì)不變性，是分離制備蛋白質(zhì)的常用方法。如血漿中的清蛋白在飽和的硫酸銨溶液中可沉淀，而球蛋白則在半飽和硫酸銨溶液中發(fā)生沉淀。乙醇、丙酮均為脫水劑，可破壞水化膜，降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的解離程度降低，表面電荷減少，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。低溫時(shí)，用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，可保留原有的生物學(xué)活性。但用乙醇，時(shí)間較長則會導(dǎo)致變性。重金屬鹽（Hg2+、Cu2+、A計(jì)），生物堿（如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸）與蛋白質(zhì)結(jié)合成鹽而沉淀，是不可逆的。蛋白質(zhì)變性不一定沉淀（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用變性后仍然能溶解于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液中，將pH調(diào)至等電點(diǎn)，出現(xiàn)絮狀物，仍可溶解于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液，加熱則變成凝塊，不再溶解）。凝固是蛋白質(zhì)變性發(fā)展的不可逆的結(jié)果。沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性（如鹽析）。四、蛋白質(zhì)的紫外吸收和呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸，在280nm波長處有特征性吸收峰，用于定量測定。蛋白質(zhì)分子中的多種化學(xué)基團(tuán)具有特定的化學(xué)性能，與某些試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)，可用于定性、定量分析。如蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，在堿性溶液與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)）。酪氨酸含酚基，與米倫試劑生成白色沉淀，加熱后變紅色。Folin-酚試劑與酪氨酸反應(yīng)生成藍(lán)色。色氨酸與乙醛酸反應(yīng)，慢慢注入濃硫酸，出現(xiàn)紫色環(huán)。第五節(jié)蛋白質(zhì)的分類自然界蛋白質(zhì)分布廣泛，種類繁多，有1012~1013種。目前仍無法按蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的分類，一般按蛋白質(zhì)的分子形狀、分子組成、生物功能進(jìn)行分類。1．按分子形狀分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。2．按分子組成分為簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)。簡單蛋白質(zhì)完全水解的產(chǎn)物僅為a-氨基酸。這類蛋白質(zhì)按其溶解度等理化性質(zhì)分為7類。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、組蛋白和硬蛋白。結(jié)合蛋白質(zhì)由簡單蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)（輔基）組成。根據(jù)輔基的不同，這類蛋白質(zhì)可分為5類。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。細(xì)胞核中的核蛋白是DNA與組蛋白結(jié)合而成，細(xì)胞質(zhì)中的核糖體是RNA與蛋白質(zhì)組成的，已知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白是一類糖蛋白，由蛋白質(zhì)與糖以共價(jià)鍵相連而成；脂蛋白由蛋白質(zhì)與脂類通過非共價(jià)鍵相連，存在生物膜和動物血漿中。3．按蛋白質(zhì)功能分為活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)。活性蛋白質(zhì)包括有催化功能的酶、有調(diào)節(jié)功能的激素、有運(yùn)動、防御、接受和傳遞信息的蛋白質(zhì)以及毒蛋白、膜蛋白等。膠原、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等是非活性蛋白質(zhì)。第二章核酸的化學(xué)教學(xué)目標(biāo)：掌握DNA和RNA在化學(xué)組分、分子結(jié)構(gòu)和生物功能上的特點(diǎn)。掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和t-RNA二級結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)，了解核酸的三級結(jié)構(gòu)。3?熟悉核酸的性質(zhì)（一般性質(zhì)、DNA熱變性、復(fù)性與分子雜交）。4?掌握基因組的概念，原核生物和真核生物基因組的特點(diǎn)。了解DNA測序的原理。導(dǎo)入：核酸是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。它的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展如何？1868年瑞士青年醫(yī)生Miescher從膿細(xì)胞核中分離出一種含磷量很高的酸性化合物，稱為核素。其繼任者Altman發(fā)展了從酵母和動物組織中制備不含蛋白質(zhì)的核酸的方法，于1889年提出核酸（nucleicacid）這一名稱。早期核酸研究因“四核苷酸假說”的錯(cuò)誤進(jìn)展緩慢。1943年Chargaff等揭示了DNA的堿基配對規(guī)律，1944年美國Avery利用致病肺炎球菌中提取的DNA使另一種非致病性的肺炎球菌的遺傳性狀發(fā)生改變而成為致病菌，發(fā)現(xiàn)正是DNA攜帶遺傳信息。Astbury、Franklin和Wilkins用X射線衍射法研究DNA分子結(jié)構(gòu)，得到清晰衍射圖。Watson和Crick在此基礎(chǔ)上于1953年提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了基因結(jié)構(gòu)、信息和功能三者之間的關(guān)系，奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。1958年Crick提出“中心法則”60年代破譯遺傳密碼，闡明3類RNA參與蛋白質(zhì)生物合成的過程；70年代誕生了基因重組和DNA測序生物技術(shù)，90年代提出人類基因組計(jì)劃，21世紀(jì)進(jìn)入后基因組時(shí)代。核酸的研究成了生命科學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一。第一節(jié)核酸的化學(xué)組成天然存在的核酸有兩類，即脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）。DNA分子是生物體的遺傳信息庫，分布在原核細(xì)胞的核區(qū)，真核細(xì)胞的核和細(xì)胞器以及病毒中；RNA分子參與遺傳信息表達(dá)的一些過程，主要存在于細(xì)胞質(zhì)。一、核酸的基本組成單位核酸是一種多聚核苷酸，用不同的降解法得到其組成單位——核苷酸。而核苷酸又由堿基、戊糖和磷酸組成。（一）戊糖DNA含B-D-2-脫氧核糖，RNA含B-D-核糖。這是核酸分類的依據(jù)。核糖中的C記為1，……5\（二）堿基（base）核酸中的堿基有兩類：嘌吟堿和嘧啶堿。有5種基本的堿基外，還有一些含量甚少的稀有堿基。DNA和RNA中常見的兩種嘌吟堿是腺嘌吟（adenine，A）、鳥嘌吟（guanine，G）。而嘧啶堿有所不同：RNA主要含胞嘧啶（cytosine,C）、尿嘧啶（uracil,U）,DNA主要含胞嘧啶、胸腺嘧啶（thymine,T）。tRNA中含有較多的稀有堿基（修飾堿基），多為甲基化的。（三）核苷是堿基和戊糖生成的糖苷。通過C1'-N9或C1'-N1糖苷鍵連接，用單字符表示，脫氧核苷則在單字符前加d。常見的修飾核苷有：次黃苷或肌苷為I、黃嘌吟核苷X、二氫尿嘧啶核苷D、假尿苷甲等。注意符號的意義，如m5dC。（四）核苷酸是核苷的磷酸酯。生物體內(nèi)游離存在的多是5'-核苷酸（如pA、pdG等）。常見的核苷酸為AMP、GMA、CMP、UMP。常見的脫氧核苷酸有dAMP、dGMA、dCMP、dTMP。AMP是一些重要輔酶的結(jié)構(gòu)成分（如NAD+、NADP+、FAD等）；環(huán)化核苷酸（cAMP/cGMP）是細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)分子和信號分子。ATP在能量代謝中起重要作用。核苷酸是兩性電解質(zhì),有等電點(diǎn)。核苷酸有互變異構(gòu)和紫外吸收。（含氧的堿基有酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體，在生理pH條件下主要以酮式存在）二、核苷酸的連接方式RNA和DNA鏈都有方向性，從5'f3\前一位核苷酸的3'-OH與下一位核苷酸的5/位磷酸基之間形成3'，5'-磷酸二酯鍵，從而形成一個(gè)沒有分支的線性大分子，兩個(gè)末端分別稱為5'末端和3'末端。大分子的主鏈由相間排列的戊糖和磷酸構(gòu)成，而堿基可看作主鏈上的側(cè)鏈基團(tuán)，主鏈上的磷酸基是酸性的，在細(xì)胞pH下帶負(fù)電荷；而堿基有疏水性。討論：列表說明DNA和RNA在化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)和生物功能方面的主要特點(diǎn)。第二節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)一、DNA的一級結(jié)構(gòu)（primarystucture）DNA的一級結(jié)構(gòu)是指分子中脫氧核苷酸的排列順序，常被簡單認(rèn)為是堿基序列（basesequence）。堿基序有嚴(yán)格的方向性和多樣性。一般將5'-磷酸端作為多核苷酸鏈的“頭”寫在左側(cè)，如pACUGA（5、3'。在DNA一級結(jié)構(gòu)中，有一種回文結(jié)構(gòu)的特殊序列，所謂回文結(jié)構(gòu)即DNA互補(bǔ)鏈上一段反向重復(fù)順序，正讀和反讀意義相同，經(jīng)反折可形成“十字形”結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄成RNA后可形成“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)，有調(diào)控意義。fGCTAGTTCACTCTGAACAATT——CGATCAAGTGAGACTTGTTAA—DNA分子很大，最小的病毒DNA約含5000b。1965年Holley用片段重疊法完成酵母tRNAala76nt序列測定；1977年Sanger利用雙脫氧法（酶法）測定了?X174單鏈DNA5386b的全序列。1990年實(shí)施的人類基因組計(jì)劃（HGP）,用15年，投資30億美元，完成人類單倍體基因組DNA3X109bp全序列的測定。該計(jì)劃由美、英、日、法、德、中六國科學(xué)家合作，于2003年提前完成，生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時(shí)代，研究重點(diǎn)從測序轉(zhuǎn)向?qū)蚪M功能的研究。二、DNA的二級結(jié)構(gòu)雙螺旋（doublehelix）1953年，Watson和Crick根據(jù)Wilkins和Franklin拍攝的DNAX-射線照片（DNA有0.34nm和3.4nm兩個(gè)周期性變化）以及Chargaff等人對DNA的堿基組成的分析（A二T,G=C，A+G=C+T），推測出DNA是由兩條相互纏繞的鏈形成。Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型如下圖：兩條反向平行的多核苷酸鏈形成右手螺旋。一條鏈為5'—3'另一條為3'—5'（某些病毒的DNA是單鏈分子ssDNA）堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)，A與T，G與C配對，A與T形成兩個(gè)氫鍵，G與C形成三個(gè)氫鍵。糖基-磷酸基骨架在外側(cè)。表面有一條大溝和一小溝。螺距為3.4nm,含10個(gè)堿基對（bp），相鄰堿基對平面間的距離為0.34nm。螺旋直徑為2nm。氫鍵維持雙螺旋的橫向穩(wěn)定。堿基對平面幾乎垂直螺旋軸，堿基對平面間的疏水堆積力維持螺旋的縱向穩(wěn)定。堿基在一條鏈上的排列順序不受限制。遺傳信息由堿基序所攜帶。DNA構(gòu)象有多態(tài)性。Watson和Crick根據(jù)Wilkins和Franklin拍攝的DNAX-射線照片是相對濕度92%的DNA鈉鹽所得的衍射圖，因此Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)稱B-DNA。細(xì)胞內(nèi)的DNA與它非常相似。另外還有A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979年Rich發(fā)現(xiàn)Z-DNA（左手螺旋、螺距4.5nm、直徑1.8nm）三、DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋進(jìn)一步盤曲所形成的空間構(gòu)象稱DNA的三級結(jié)構(gòu)。某些病毒、細(xì)菌、真核生物線粒體和葉綠體的DNA是環(huán)形雙螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的DNA是很長的線形雙螺旋，通過組裝形成非常致密的超級結(jié)構(gòu)。環(huán)形DNA可形成超螺旋當(dāng)將線性過旋或欠旋的雙螺旋DNA連接形成一個(gè)環(huán)時(shí)，都會自動形成額外的超螺旋來抵消過旋或欠旋造成的應(yīng)力，目的是維持B構(gòu)象。過旋DNA會自動形成額外的左手螺旋（正超螺旋），而欠旋形成額外的右手螺旋（負(fù)超螺旋）。一段雙螺旋圈數(shù)為10的B-DNA連接成環(huán)形時(shí)，不發(fā)生進(jìn)一步扭曲，稱松弛環(huán)形DNA（雙螺旋的圈數(shù)=鏈繞數(shù)，即T=L，超螺旋數(shù)W=0；L=T+W），但將這一線形DNA的螺旋先擰松一圈再連接成環(huán)時(shí)，解鏈環(huán)形DNA存在的扭曲張力，可導(dǎo)致雙鏈環(huán)向右手方向扭曲形成負(fù)超螺旋（T=10,L=9,W=-1）。在生物體內(nèi)，絕大多數(shù)超螺旋DNA以負(fù)超螺旋的形式存在，也就是說，一旦超螺旋解開，則會形成解鏈環(huán)形DNA，有利于DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。螺旋具有相同的結(jié)構(gòu)，但L值不同的分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷一條鏈或兩條鏈，拓?fù)洚悩?gòu)體可以相互轉(zhuǎn)變。W的正表示雙鏈閉環(huán)的螺旋圈在增加，W的負(fù)表示減少。L和T的正負(fù)表示螺旋方向，右手為正，左手螺旋為負(fù)；L值必定是整數(shù)。2．真核細(xì)胞染色體真核細(xì)胞DNA是線形分子，與組蛋白結(jié)合，其兩端固定也形成超螺旋結(jié)構(gòu)。DNA被緊密地包裝成染色體來自三個(gè)水平的折疊：核小體、30nm纖絲和放射環(huán)。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，是DNA包裝的第一步，它由DNA結(jié)合到組蛋白上形成復(fù)合物，在電鏡下顯示為成串的“念珠”狀。組蛋白是富含精氨酸和賴氨酸的堿性蛋白質(zhì)，其氨基酸序列在進(jìn)化中是高度保守的。組蛋白有5種，H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成的八聚體是核小體核心顆粒，DNA纏繞其上，相鄰核小體間的DNA稱為連接DNA且結(jié)合H1。200bpDNA的長度約為68nm，被壓縮在10nm的核小體中。壓縮比約為7。30nm纖絲是第二級壓縮，每圈含6個(gè)核小體，壓縮比是6。30nm螺旋管再纏繞成超螺旋圓筒，壓縮比是40。再進(jìn)一步形成染色單體，總壓縮近一萬倍。典型人體細(xì)胞的DNA理論長度應(yīng)是180cm，被包裝在46個(gè)5口m的染色體中。四、DNA和基因組DNA分子中的最小功能單位稱作基因，為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因稱結(jié)構(gòu)基因，DNA中具調(diào)節(jié)功能而不轉(zhuǎn)錄生成RNA的片段稱調(diào)節(jié)基因。基因組（genome）是某生物體所含的全部基因，即全部DNA或完整的單套遺傳物質(zhì)（配子中的整套基因）。細(xì)菌、噬菌體、大多數(shù)動植物病毒的基因組即指單個(gè)DNA分子。最小病毒如SV40的基因組僅有5226b，含5個(gè)基因。大腸桿菌含4.6X106bp，有3000~4000個(gè)基因，DNA完全伸展總長約1.3mm。原核生物基因組的特點(diǎn)是：結(jié)構(gòu)簡煉，絕大部分為蛋白質(zhì)編碼（結(jié)構(gòu)基因）；有轉(zhuǎn)錄單元，即功能相關(guān)的基因常串聯(lián)一起，并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA（多順反子mRNA）中；有基因重疊現(xiàn)象，即同一段DNA攜帶兩種不同蛋白質(zhì)的信息。真核生物基因一般分布在若干條染色體上，其特點(diǎn)是：有重復(fù)序列（按重復(fù)次數(shù)分單拷貝序、中度重復(fù)序和高度重復(fù)序）；有斷裂基因（由不編碼的內(nèi)含子和編碼的外顯子組成）。酵母基因組有1.35X107bp，含6374個(gè)基因。人類基因組有3X109bp，含4萬個(gè)基因。第三節(jié)RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA通常以單鏈形式存在，比DNA分子小得多，由數(shù)十個(gè)至數(shù)千個(gè)核苷酸組成。RNA鏈可以回折且通過A與U,G與C配對形成局部的雙螺旋，不能配對的堿基則形成環(huán)狀突起，這種短的雙螺旋區(qū)和環(huán)稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RNA的C2/位羥基是游離的，是一個(gè)易發(fā)生不良反應(yīng)的位置，它使RNA的化學(xué)性質(zhì)不如DNA穩(wěn)定，能較DNA產(chǎn)生更多的修飾組分。RNA的種類、大小、結(jié)構(gòu)都比DNA多樣化，按照功能的不同和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，RNA主要分為tRNA、rRNA和mRNA三類。此外，細(xì)胞的不同部位還存在著另一些小分子RNA，如核內(nèi)小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞質(zhì)小RNA（scRNA）等，分別參與mRNA的前體（hnRNA）和rRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和加工過程。一、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA，tRNA）分子量最小的RNA，約占總RNA的15%。主要功能是在蛋白質(zhì)生物合成過程中，起著轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。2.1965年Holley等測定了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結(jié)構(gòu)，并提出二級結(jié)構(gòu)模型。一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：核苷酸殘基數(shù)在73~95；含有較多的稀有堿基（如mG、DHU等）；5/-末端多為pG,3/-末端都是-CCA。tRNA的二級結(jié)構(gòu)為“三葉草”形，包括4個(gè)螺旋區(qū)、3個(gè)環(huán)及一個(gè)附加叉。各部分的結(jié)構(gòu)都和它的功能有關(guān)。5＇端1~7位與近3＇端67~72位形成的雙螺旋區(qū)稱氨基酸臂，似“葉柄”，3＇端有共同的-CCA-OH結(jié)構(gòu)，用于連接該RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸。3個(gè)環(huán)是二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、反密碼子環(huán)、T甲C環(huán)。1973~1975年S.H.Kim的X射線衍射分析表明，tRNA的三級結(jié)構(gòu)呈倒L字母形，反密碼環(huán)和氨基酸臂分別位于倒L的兩端。二、信使RNA（messengerRNA，mRNA）細(xì)胞內(nèi)含量較少的一類RNA，約占總RNA的3%。其功能是將核內(nèi)DNA的堿基順序（遺傳信息）按堿基互補(bǔ)原則轉(zhuǎn)錄至核糖體，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。種類多，作為不同蛋白質(zhì)合成的模板，其一級結(jié)構(gòu)差異很大。真核細(xì)胞的mRNA有不同于原核細(xì)胞的特點(diǎn)：3'-末端有多聚A（polyA）尾，5'-末端加有一個(gè)“帽”式結(jié)構(gòu)，（m7Gppp）。代謝活躍，壽命較短。三、核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）約占細(xì)胞總RNA的80%。主要功能是與多種蛋白質(zhì)組成核糖體，是蛋白質(zhì)合成的場所。核糖體在結(jié)構(gòu)上可分離為大小兩個(gè)亞基。原核細(xì)胞的rRNA有3種，23S與5SrRNA在大亞基，16S在小亞基。真核細(xì)胞有4種rRNA，其中大亞基含28S、5.8S、5S,小亞基只有18S。各種rRNA的一級結(jié)構(gòu)中的核苷酸殘基數(shù)及其順序都不相同，且有特定的二級結(jié)構(gòu)。第四節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般理化性質(zhì)DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有機(jī)溶劑。常用乙醇從溶液中沉淀核酸。具有大分子的一般特性。分子大小可用Da、b或bp、S、鏈長（口m）表示。一個(gè)bp相當(dāng)?shù)暮塑账崞骄肿恿繛?60Da；1口m長的DNA雙螺旋相當(dāng)3000bp或2X106Da。兩性電解質(zhì)。各種核酸的大小及所帶的電荷不同，可用電泳和離子交換法分離ORNA在室溫下易被稀堿水解，DNA較穩(wěn)定，此特性用來測定RNA的堿基組成和純化DNA。紫外吸收，最大吸收峰在260nm處，核酸的變性或降解，吸光度A升高，稱為增色效應(yīng)。二、核酸的變性和復(fù)性變性的概念在理化因素作用下，核酸的雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無規(guī)線團(tuán)狀態(tài)的過程。變性的因素有熱、酸、堿、乙醇、尿素等。變性的本質(zhì)是次級鍵的變化。變性的結(jié)果是紫外吸收值明顯增加（增色效應(yīng)），DNA粘度下降，生物學(xué)功能部分或全部喪失。DNA的熱變性和TmDNA熱變性過程中，紫外吸收值增高，有一個(gè)特征性曲線稱熔解曲線，通常將熔解曲線的中點(diǎn)，即紫外吸收值達(dá)到最大值50%時(shí)的溫度稱為解鏈溫度，又叫熔點(diǎn)（Tm）。DNA的熱變性是爆發(fā)式的，像結(jié)晶的溶解一樣，只在很狹窄的溫度范圍內(nèi)完成，一般在70~800C之間。變性溫度與堿基組成、DNA長度及變性條件有關(guān)。GC含量越高，Tm越大；DNA越長，Tm越大；溶液離子強(qiáng)度增高，Tm增加。DNA的復(fù)性與分子雜交變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新配對，恢復(fù)天然雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火（annealing）。影響復(fù)性速度的因素很多，如單鏈DNA的起始濃度、溫度（最適復(fù)性溫度是比Tm約低250C）、鹽濃度、片斷長度、序列復(fù)雜性等。分子雜交是以核酸的變性和復(fù)性為基礎(chǔ)，只要不同來源的核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對的片段，就可以形成DNA/DNA，RNA/RNA或DNA/RNA雜化雙鏈，這個(gè)現(xiàn)象稱為核酸分子雜交（hybridization）。標(biāo)記一個(gè)來源的核酸（放射性同位素或熒光標(biāo)記），通過雜交可以檢測與其有互補(bǔ)關(guān)系的DNA或RNA,這種標(biāo)記的核酸稱為基因探針（geneprobe），也就是一段帶有檢測標(biāo)記，且順序已知，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列。基因探針的“集成化"就是基因芯片（genechip）。是把已經(jīng)測序的基因固定在硅片或玻璃片上制成的。在醫(yī)療診斷和科學(xué)研究中已被快速地運(yùn)用。三、核酸的序列測定DNA序列是指攜帶遺傳信息的DNA分子中的A、C、G、T的序列。分析方法主要有兩種，一種是Maxam-Gilbert化學(xué)法，另一種是Sanger的雙脫氧法。現(xiàn)在一般都采用后者，其基本原理是：用凝膠電泳分離待測的DNA片段（用作模板）。將模板、引物、4種dNTP、合適的聚合酶置于4個(gè)試管，每一試管按精確比例各加入一種ddNTP，用同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記。利用ddNTP可特異地終止DNA鏈延長的特點(diǎn)，4個(gè)試管的聚合反應(yīng)可以得到一系列大小不等、被標(biāo)記的片段。將4個(gè)反應(yīng)管同時(shí)加到聚丙烯凝膠上電泳，標(biāo)記片段按大小分離，放射自顯影后可按譜型讀出DNA序列。在以上兩種方法的基礎(chǔ)上，通過與計(jì)算機(jī)技術(shù)和熒光技術(shù)的結(jié)合，發(fā)明了自動測序儀。目前，常用的測序策略是“鳥槍法”，形象地說是將較長的基因片段打斷，構(gòu)建一系列的隨機(jī)亞克隆，然后測定每個(gè)亞克隆的序列，用計(jì)算機(jī)分析以發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)域，最終對大片段的DNA定序。第二章酶教學(xué)目標(biāo)：掌握酶的概念和作用特點(diǎn)，了解酶的分類與命名。熟悉酶的分子組成、結(jié)構(gòu)與功能（單純酶和結(jié)合酶，酶的輔因子、維生素的類別與功能，酶的活性部位，酶原激活，同工酶、變構(gòu)酶和抗體酶）。熟悉酶的作用機(jī)制。熟悉影響酶促反應(yīng)的因素（酶濃度、底物濃度、溫度、pH、激活劑與抑制劑；掌握酶促反應(yīng)速度的表示、米氏方程和米氏常數(shù)的意義）。了解酶的制備與應(yīng)用。第一節(jié)概論導(dǎo)入：酶學(xué)知識來源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。我們祖先很早就會制醬和釀酒。西方國家于1810年發(fā)現(xiàn)酵母可將糖轉(zhuǎn)化為酒精；1833年，Payen及Persoz從麥芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一種熱不穩(wěn)定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德國科學(xué)家屈內(nèi)（Kuhne）首先把這類物質(zhì)稱為酶（enzyme，其意“在酵母中”）。1860年法國科學(xué)家巴斯德（Pasteur）認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞生命活動的結(jié)果，細(xì)胞破裂則失去發(fā)酵作用。1897年，Buchner兄弟首次用不含細(xì)胞的酵母提取液實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵，證明發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，獲得1911年諾貝爾化學(xué)獎。1926年，美國生化學(xué)家Sumner第一次從刀豆得到脲酶結(jié)晶，并證明是蛋白質(zhì)。1930年，Northrop得到胃蛋白酶的結(jié)晶（1946年二人共獲諾貝爾化學(xué)獎）。1963年測定第一個(gè)牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)（129aa）。一、酶的概念酶是由活細(xì)胞合成的，對其特異底物起高效催化作用的生物催化劑（biocatalyst）。已發(fā)現(xiàn)的有兩類：主要的一類是蛋白質(zhì)酶（enzyme），生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)4000多種，數(shù)百種酶得到結(jié)晶。美國科學(xué)家Cech于1981年在研究原生動物四膜蟲的RNA前體加工成熟時(shí)發(fā)現(xiàn)核酶“ribozyme”，為數(shù)不多，主要做用于核酸（1989年的諾貝爾化學(xué)獎）。二、酶的作用特點(diǎn)酶所催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。在酶促反應(yīng)中被催化的物質(zhì)稱為底物，反應(yīng)的生成物稱為產(chǎn)物。酶所具有的催化能力稱為酶活性。酶作為生物催化劑，具有一般催化劑的共性，如在反應(yīng)前后酶的質(zhì)和量不變；只催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)，即自由能由高向低轉(zhuǎn)變的化學(xué)反應(yīng)；不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。但是，酶是生物大分子，又具有與一般催化劑不同的特點(diǎn)。1．極高的催化效率酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高108?1020倍，比一般催化劑高107?1013倍。例如，脲酶催化尿素的水解速度是H+催化作用的7X1012倍；碳酸酐酶每一酶分子每秒催化6X105CO2與水結(jié)合成H2CO3,比非酶促反應(yīng)快107倍。2．高度的特異性酶對催化的底物有高度的選擇性，即一種酶只作用一種或一類化合物，催化一定的化學(xué)反應(yīng)，并生成一定的產(chǎn)物，這種特性稱為酶的特異性或?qū)Ｒ恍浴Ｓ薪Y(jié)構(gòu)專一性和立體異構(gòu)專一性兩種類型。結(jié)構(gòu)專一性又分絕對專一性和相對專一性。前者只催化一種底物，進(jìn)行一種化學(xué)反應(yīng)。如脲酶僅催化尿素水解。后者可作用一類化合物或一種化學(xué)鍵。如酯酶可水解各種有機(jī)酸和醇形成的酯。在動物消化道中幾種蛋白酶專一性不同，胰蛋白酶只水解Arg或Lys羧基形成的肽鍵；胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽鍵。立體異構(gòu)專一性指酶對底物立體構(gòu)型的要求。例如乳酸脫氫酶催化L-乳酸脫氫為丙酮酸，對D-乳酸無作用；L-氨基酸氧化酶只作用L-氨基酸，對D-氨基酸無作用。3．酶活性的可調(diào)節(jié)性酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，通過改變酶的合成和降解速度可調(diào)節(jié)酶的含量；酶在胞液和亞細(xì)胞的隔離分布構(gòu)成酶的區(qū)域化調(diào)節(jié)；代謝物濃度或產(chǎn)物濃度的變化可以抑制或激活酶的活性；激素和神經(jīng)系統(tǒng)的信息，可通過對關(guān)鍵酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)和共價(jià)修飾來影響整個(gè)酶促反應(yīng)速度。所以酶是催化劑又是代謝調(diào)節(jié)元件，酶水平的調(diào)節(jié)是代謝調(diào)控的基本方式。4．酶的不穩(wěn)定性酶主要是蛋白質(zhì)，凡能使蛋白質(zhì)變性的理化因素均可影響酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用一般需要比較溫和的條件(37°C、1atm、pH7)。三、酶的分類與命名酶的分類根據(jù)國際酶學(xué)委員會(InternationalEnzymeCommission，IEC)的規(guī)定，按照酶促反應(yīng)的性質(zhì)，分為六大類：氧化還原酶(oxidoreductases)催化底物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。如乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等。轉(zhuǎn)移酶(transferases)催化底物之間某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移或交換。如甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸化酶等。水解酶(hydrolases)催化底物發(fā)生水解反應(yīng)。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。裂解酶(lyases)催化底物裂解或移去基團(tuán)(形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng))。如碳酸酐酶、醛縮酶、檸檬酸合成酶等。異構(gòu)酶(isomerases)催化各種同分異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化。如磷酸丙糖異構(gòu)酶、消旋酶等。合成酶(ligases)催化兩分子底物合成一分子化合物，同時(shí)偶聯(lián)有ATP的分解釋能。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-RNA連接酶等。酶的命名1961年，國際酶學(xué)委員會(IEC)主要根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，把酶分為6大類，制定了系統(tǒng)命名法。規(guī)定每一酶只有一個(gè)系統(tǒng)名稱，它標(biāo)明酶的所有底物與催化反應(yīng)性質(zhì)，底物名稱之間以“：”分隔，同時(shí)還有一個(gè)由4個(gè)數(shù)字組成的系統(tǒng)編號。如谷丙轉(zhuǎn)氨酶的系統(tǒng)名稱是丙氨酸：a-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(酶表中的統(tǒng)一編號是EC2.6.1.2)。乳酸脫氫酶的編號是EC1.1.1.27。第二節(jié)酶的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能一、酶的分子組成(一)單純酶和結(jié)合酶單純酶是僅由肽鏈構(gòu)成的酶。如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。結(jié)合酶由蛋白質(zhì)部分和非蛋白質(zhì)部分組成，前者稱為酶蛋白(apoenzyme)，決定酶的特異性和高效率；后者稱為輔助因子(cofactor),決定反應(yīng)的種類和性質(zhì)。兩者結(jié)合形成的復(fù)合物稱為全酶(holoenzyme)，這兩部分對于催化活性都是必需的。酶蛋白有單條肽鏈和多個(gè)亞基組成的。前者稱為單體酶，為數(shù)不多，均為水解酶，如胰蛋白酶、核糖核酸酶、溶菌酶等；多個(gè)相同或不同亞基以非共價(jià)鍵連接的酶稱為寡聚酶，如磷酸化酶a,3-磷酸甘油醛脫氫酶等。細(xì)胞內(nèi)存在著許多由幾種不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶復(fù)合體，即多酶體系，它利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，如丙酮酸脫氫酶體系、脂肪酸合成酶復(fù)合體。在多酶體系中，能影響整條代謝途徑方向和速度的酶稱為關(guān)鍵酶，關(guān)鍵酶通常催化單向不平衡反應(yīng)，或者是該多酶體系中催化活性最低的限速酶。（二）酶的輔因子酶的輔助因子指金屬離子或小分子有機(jī)化合物（又稱輔酶與輔基）。金屬離子約2/3的酶含有金屬離子，常見的是K+、Na+、Mg2+、Cu2+（Cu+）、Zn2+、Fe2+（Fe3+）等。金屬離子的作用是多方面的：參與酶的活性中心；在酶蛋白與底物之間起橋梁作用；維持酶分子發(fā)揮催化作用所必需的構(gòu)象；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力。輔酶與輔基輔酶與輔基是一些化學(xué)穩(wěn)定的小分子有機(jī)物，是維生素樣的物質(zhì)，參與酶的催化過程，在反應(yīng)中傳遞電子、質(zhì)子或一些基團(tuán)。輔酶與酶蛋白的結(jié)合疏松，可以用透析或超濾方法除去；輔基則與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用上述方法除去。一種酶蛋白只能與一種輔助因子結(jié)合成一種特異的酶，但一種輔助因子可以與不同的酶蛋白結(jié)合構(gòu)成多種特異性酶，以催化各種化學(xué)反應(yīng)。維生素（Vitamin）是維持機(jī)體正常生命活動所必需的一類小分子有機(jī)物，基本不能在體內(nèi)合成，即使有幾種能自行合成，也因合成量不足而必須從食物中攝取。維生素的需要量及缺乏癥是營養(yǎng)學(xué)的課題。維生素原意是“生命中必不可少的胺”，波蘭學(xué)者凡克把從米糠中提取出治療腳氣病有效的成分命名為維生素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13種，按溶解性分為水溶性和脂溶性兩大類。脂溶性維生素以獨(dú)立發(fā)揮作用為主，A、D、E、K具有一些特殊的生理功能。以下8種水溶性的維生素都以輔酶的形式參與結(jié)合酶的組成。也有些本身就是輔酶，如硫辛酸、抗壞血酸。含維生素的輔酶及其主要功能維生素輔酶形式反應(yīng)類型硫胺素（B1）焦磷酸硫胺素（TPP）a-酮酸氧化脫羧反應(yīng)核黃素（B2）黃素單核苷酸（FMN）黃素腺嘌吟二核苷酸（FAD）氧化還原反應(yīng)煙酸或煙酰胺（PP）煙酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD+）煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸（NADP+）氧化還原反應(yīng)泛酸輔酶A（CoA-SH）酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺（B6）磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺轉(zhuǎn)氨基作用、脫羧作用生物素生物胞素CO2的固定葉酸四氫葉酸一碳單位轉(zhuǎn)移鉆胺素（B12）5＇-脫氧腺苷鈷胺素甲鈷胺素1，2--氫原子轉(zhuǎn)移甲基轉(zhuǎn)移二、酶的活性部位酶的活性部位（activesite）是它結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，又稱活性中心。它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維小區(qū)（為裂縫或?yàn)榘枷荩Ｃ富钚圆课坏幕鶊F(tuán)屬必需基團(tuán)，有二種：一是結(jié)合基團(tuán)，其作用是與底物結(jié)合，生成酶-底物復(fù)合物；二是催化基團(tuán)，其作用是影響底物分子中某些化學(xué)鍵的穩(wěn)定性，催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并促進(jìn)底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，也有的必需基團(tuán)同時(shí)有這兩種功能。還有一些化學(xué)基團(tuán)位于酶的活性中心以外的部位，為維持酶活性中心的構(gòu)象所必需，稱為酶活性中心以外的必需基團(tuán)。構(gòu)成酶活性中心的常見基團(tuán)有組氨酸的咪唑基、絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基等。如絲氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶，都催化蛋白質(zhì)的肽鍵使之水解，但底物的專一性由它們的底物-結(jié)合部位中氨基酸基團(tuán)的性質(zhì)所決定，與其作用的底物互補(bǔ)。像胰蛋白酶，在它的底物-結(jié)合部位有帶負(fù)電荷的Asp殘基，可與底物側(cè)鏈上帶正電荷的Lys和Arg相互作用，切斷其羧基側(cè)；胰凝乳蛋白酶在它的底物-結(jié)合部位有帶小側(cè)鏈的氨基酸殘基，如Gly和Ser，使底物龐大的芳香的和疏水氨基酸殘基得以進(jìn)入，切斷其羧基側(cè)；彈性蛋白酶有相對大的Val和Thr不帶電荷的氨基酸側(cè)鏈，凸出在它的底物-結(jié)合部位，阻止了除Ala和Gly小側(cè)鏈以外的所有其他氨基酸。三、酶原激活沒有活性的酶的前體稱為“酶原”，酶原轉(zhuǎn)變成酶的過程稱為酶原激活。其實(shí)質(zhì)是酶活性部位形成或暴露的過程。一些與消化作用有關(guān)的酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶在最初合成和分泌時(shí)，沒有催化活性。胃蛋白酶原在H+作用下，自N端切下幾個(gè)多肽碎片，形成酶催化所需的空間結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為胃蛋白酶。胰蛋白酶原隨胰液進(jìn)入小腸時(shí)被腸激酶激活，自N端切除一個(gè)6肽，促使酶的構(gòu)象變化，形成活性中心，轉(zhuǎn)變成有活性的胰蛋白酶。酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中進(jìn)行。酶原的激活具有重要的生理意義，不僅保護(hù)細(xì)胞本身不受酶的水解破壞，而且保證酶在特定的部位與環(huán)境中發(fā)揮催化作用。四、同工酶、變構(gòu)酶、抗體酶（一）同工酶（isozymes）具有不同的分子形式但卻催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶稱為同工酶。1959年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)同工酶是乳酸脫氫酶（LDH）,它在NADH存在下，催化丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化生成乳酸。它是一個(gè)寡聚酶，由兩種不同類型的亞基組成5種分子形式：H4、H3M、H2M2、HM3、M4，它們的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和電泳行為不同，但催化同一反應(yīng)，因?yàn)樗鼈兊幕钚圆课辉诮Y(jié)構(gòu)上相同或非常相似。M亞基主要存在骨骼肌和肝臟，而H亞基主要在心肌。心肌梗死的情況可通過血液LDH同工酶的類型的檢測確定。（二）變構(gòu)酶（allostericenzyme）變構(gòu)酶又稱別構(gòu)酶，是一類調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的酶。一般是寡聚酶，酶分子有與底物結(jié)合的活性部位和與變構(gòu)劑非共價(jià)結(jié)合的調(diào)節(jié)部位，具有變構(gòu)效應(yīng)。引起變構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)稱為變構(gòu)效應(yīng)劑。降低酶活性的稱變構(gòu)抑制劑或負(fù)效應(yīng)物；反之，稱為變構(gòu)激活劑或正效應(yīng)物。變構(gòu)酶與血紅蛋白一樣，存在著協(xié)同效應(yīng)。變構(gòu)酶催化的反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系常呈S形曲線，這和非調(diào)節(jié)酶的動力學(xué)曲線——雙曲線不同。變構(gòu)酶多為限速酶。在多酶體系，限速酶一般位于代謝途徑的起點(diǎn)或分支點(diǎn)上，對控制反應(yīng)總速度起關(guān)鍵作用。如異檸檬酸脫氫酶就是一個(gè)變構(gòu)酶，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，NAD+、ADP和檸檬酸是該酶的變構(gòu)激活劑，而NADH和ATP是變構(gòu)抑制劑。（三）抗體酶（abzyme）既是抗體又具有催化功能的蛋白質(zhì)稱為“抗體酶或催化性抗體”，其本質(zhì)是免疫球蛋白，但是在易變區(qū)賦予了酶的屬性。1986年科學(xué)家根據(jù)過渡態(tài)理論和免疫學(xué)原理，運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)成功地制備了具有酶活性的抗體。這加深了人們對酶作用原理的理解，而且在臨床醫(yī)學(xué)及制藥業(yè)等方面有很好的應(yīng)用。第三節(jié)酶的作用機(jī)制一、酶的催化本質(zhì)現(xiàn)代化學(xué)反應(yīng)速度理論是過渡態(tài)理論。在一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，反應(yīng)物從“初態(tài)”到“過渡態(tài)”，轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物即到達(dá)“終態(tài)”。“過渡態(tài)”是底物分子被激活的不穩(wěn)定態(tài)，不同于反應(yīng)中間物，它具有最高能量，又處在一個(gè)短暫的分子瞬間，某些化學(xué)鍵正在斷裂和形成并達(dá)到能生成產(chǎn)物或再返回生成反應(yīng)物的程度。酶催化的反應(yīng)速度快是降低反應(yīng)的能壘，即降低底物分子所必須具有的活化能。催化和非催化反應(yīng)，其反應(yīng)物和產(chǎn)物間總的標(biāo)準(zhǔn)自由能差是一樣的。二、中間產(chǎn)物學(xué)說和誘導(dǎo)契合學(xué)說酶的作用機(jī)制包含酶如何同底物結(jié)合以及怎樣加快反應(yīng)速度兩個(gè)內(nèi)容。20世紀(jì)初和40年代，科學(xué)家就提出了酶-底物復(fù)合物的形成和過渡態(tài)概念，即E+S-ES-E+P。酶和底物形成中間產(chǎn)物的學(xué)說已為實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，且分離到若干種ES結(jié)晶。已有兩種模型解釋酶如何結(jié)合它的底物。1894年Fischer提出鎖和鑰匙模型，底物的形狀和酶的活性部位彼此相適合，這是一種剛性的和固定的組合。1958年Koshland提出誘導(dǎo)契合模型，底物的結(jié)合在酶的活性部位誘導(dǎo)出構(gòu)象變化；酶也可使底物變形，迫使其構(gòu)象近似于它的過渡態(tài)。這種作用是相互誘導(dǎo)、相互變形、相互適應(yīng)的柔性過程。酶的誘導(dǎo)契合三、影響酶催化效率的因素酶促反應(yīng)高效率的原因常常是多種催化機(jī)制的綜合應(yīng)用，除酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說外，還有：（一）鄰近效應(yīng)與定向排列在兩個(gè)以上底物參與的反應(yīng)中，由于酶的作用，底物被聚集到酶分子表面，彼此相互靠近并形成正確的定向關(guān)系，大大提高了底物的局部濃度，底物被催化的部位定向地對準(zhǔn)酶的活性中心，實(shí)際上是將分子間的反應(yīng)變成類似于分子內(nèi)的反應(yīng)，從而大大提高催化效率。（二）多元催化酶分子中含有多種不同功能基團(tuán)，如氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基等。既可作質(zhì)子供體，又可作質(zhì)子受體，使同一酶分子常可起廣義酸催化和堿催化；即可起親核催化，又可起親電子催化。這些因素并不是在所有的酶中同時(shí)都一樣的起作用，對不同的酶起主要作用的因素不完全相同。第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率和影響此速率的各種因素的科學(xué)。一、酶反應(yīng)速度的測量反應(yīng)的速率也稱速度（velocity）,是以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來表示。測定酶反應(yīng)速度時(shí)，一般要求非常高的底物濃度以使實(shí)驗(yàn)測定的起始反應(yīng)速率與酶濃度成正比。以產(chǎn)物的生成量對時(shí)間作圖，繪制反應(yīng)過程曲線，不同時(shí)間的反應(yīng)速度就是時(shí)間為不同值時(shí)曲線的斜率。通常采用反應(yīng)的初速度Vo,即以零時(shí)點(diǎn)為起點(diǎn)作一與曲線的線性部分相切的直線，這一直線的斜率即等于Vo,這可以避免底物濃度因被消耗而相對降低以及反應(yīng)物堆積等因素對反應(yīng)速度的抑制作用。（產(chǎn)物出現(xiàn)的速率或底物消失速率可根據(jù)特殊波長下吸收光的變化用分光光度計(jì)測定。）二、酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)研究某一因素對酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，體系中的其他因素保持不變，而只變動所要研究的因素。當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，酶促反應(yīng)速度與酶濃度的變化成正比。三、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響（一）米-曼氏方程式1913年，Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說進(jìn)行數(shù)學(xué)推導(dǎo)，得出V與［S］的數(shù)學(xué)方程式，即米-曼氏方程式。1925年Briggs和Haldane提出穩(wěn)態(tài)理論，對米氏方程做了一項(xiàng)重要的修正。底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響呈雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，V與［S］呈正比關(guān)系（一級反應(yīng)）；隨著［S］的增高，V的增加逐步減慢（混合級反應(yīng)）；增到一定程度，V不再增加而是趨于穩(wěn)定（零級反應(yīng)）。當(dāng)［S］VVKm時(shí)，v=Vmax［S］/Km，反應(yīng)速度與底物濃度成正比；當(dāng)［S］>>Km時(shí),v竺Vmax，反應(yīng)速度達(dá)到最大速度，再增加［S］也不影響V。（二）Km的意義當(dāng)V/v=2時(shí)，Km=［S］,Km是反應(yīng)速率v等于最大速率V—半時(shí)的底物濃度，單位為摩爾/升（mol/L）。Km=K2+K3/K1，當(dāng)K2>>K3時(shí)，Km值可用來表示酶對底物的親和力。Km值越小，酶與底物的親和力越大；反之，則越小。Km是酶的特征性常數(shù)，它只與酶的結(jié)構(gòu)和酶所催化的底物有關(guān)，與酶濃度無關(guān)。Km和Vmax可用圖解法根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測出。通過測定在不同底物濃度下的V0，再用1/Vo對1/［S］的雙倒數(shù)作圖，又稱Lineweaver-BurK作圖法，即取米氏方程式倒數(shù)形式。四、pH對反應(yīng)速度的影響每一種酶只能在一定限度的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)活力，酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的pH稱為酶的最適pH。最適pH的微小偏離可使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化而降低酶的活性，較大偏離時(shí)，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價(jià)鍵受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白的變性。酶的最適pH不是固定的常數(shù)，受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖液的種類和濃度等的影響。一般酶的最適pH在4~8之間，植物和微生物體內(nèi)的酶最適pH多在4.5~6.5,而動物體內(nèi)的最適pH多在6.5~8,多在6.8左右。但也有例外，如胃蛋白酶最適pH為1.9,胰蛋白酶的最適pH為8.1,肝精氨酸酶的最適pH為9.0。Vo對pH的關(guān)系圖形是鐘形曲線。五、溫度對反應(yīng)速度的影響溫度對Vo關(guān)系的圖形是一條曲線，它可清楚地表示出最適溫度。多數(shù)哺乳動物的酶最適溫度在37°C左右，植物體內(nèi)酶的最適溫度在50~60C。也有些微生物的酶適應(yīng)在高溫或低溫下工作。溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)速率，是升高溫度提高反應(yīng)速率和酶遇熱易變性失活兩個(gè)相反效應(yīng)間的平衡。六、激活劑對反應(yīng)速度的影響凡能使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)稱為酶的激活劑（activator）。必需激活劑常是金屬離子，如Mg2+、K+、Mn2+等，Mg2+是多種激酶和合成酶的必需激活劑；非必需激活劑是有機(jī)化合物和Cl-等，如膽汁酸鹽是胰脂肪酶，Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活劑。七、抑制劑對反應(yīng)速度的影響使酶活性下降而不導(dǎo)致酶變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。抑制劑作用有可逆和不可逆抑制兩類。以可逆抑制最為重要。（一）不可逆抑制作用這類抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心上的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活，一般不能用透析、超濾等物理方法去除。這類抑制作用可用某些藥物解毒，使酶恢復(fù)活性。如農(nóng)藥敵百蟲、敵敵畏、1059等有機(jī)磷化合物能特異地與膽堿酯酶活性中心的絲氨酸羥基結(jié)合，使酶失活，導(dǎo)致乙酰膽堿不能水解而積存。迷走神經(jīng)興奮呈現(xiàn)中毒狀態(tài)。解磷定（PAM）可解除有機(jī)磷化合物對羥基酶的抑制作用，顯然這類解毒藥物和有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合的強(qiáng)度大于和酶結(jié)合。重金屬鹽引起的巰基酶中毒，可用絡(luò)合劑或加入其他過量的巰基化合物，如二巰基丙醇（BAL）來解毒。（二）可逆抑制作用這類抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶可逆性結(jié)合，使酶活性降低或失活，采用透析、超濾的方法可去除抑制劑，恢復(fù)酶活性。可逆抑制有競爭、非競爭、反競爭3種類型，以競爭性抑制研究的最多。三種作用的共同點(diǎn)是因Km和Vmax值的變化導(dǎo)致酶促反應(yīng)初速度下降。競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物類似，且在酶的同一部位（活性中心）和酶結(jié)合，僅在加大底物濃度時(shí)才逐漸抵消，顯然Km值要增加，Vmax不變。非競爭性抑制劑不直接影響酶與底物的結(jié)合，酶同時(shí)和二者結(jié)合生成的中間產(chǎn)物是三元復(fù)合物，也無正常產(chǎn)物生成，所以Km不變，而Vmax減小。反競爭抑制劑促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，形成的三元復(fù)合物也不能形成正常產(chǎn)物，所以Km變小，Vmax也變小。藥物是酶的抑制劑。競爭性抑制原理應(yīng)用范例是磺胺藥的研制。磺胺藥和細(xì)菌合成葉酸所需的對氨基苯甲酸僅一個(gè)碳原子之別（變成了S）,使細(xì)菌的葉酸不能正常合成，導(dǎo)致細(xì)菌的核苷酸合成受阻而死亡。而人以攝入葉酸為主，故磺胺藥對人的核酸合成無影響。第五節(jié)酶的制備和應(yīng)用一、酶的制備酶可以從動物、植物、微生物等各種原料中提取或用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑。酶在生物體內(nèi)與大量其他物質(zhì)共同存在，含量很少，又是有催化活性蛋白質(zhì)，除了采用分離純化蛋白質(zhì)的一般方法，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、凝膠過濾、超離心法外，還要注意防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等，以避免酶活力的損失。胞內(nèi)酶和胞外酶的提取在處理方法上有所不同。胞內(nèi)酶需要先用搗碎、砂磨、凍融、或自溶等方法將細(xì)胞破壞，然后再用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化技術(shù)提出。酶的活力（activity）就是酶加快其所催化的化學(xué)反應(yīng)速度的能力。一般用催化反應(yīng)的起始速率（Vo）表示，Vo的單位是微摩爾/分，也可用國際單位（U）和“開特”（Kat）表示。1分鐘內(nèi)催化1微摩爾的作用物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的酶量為1U；1秒鐘內(nèi)催化1摩爾的作用物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的酶量為1Kat°1微摩爾/分=1U=16.67nKat（1Kat=6X107U）。比較酶制劑的純度可用比活力（specificactivity），即每毫克蛋白質(zhì)中所含的U數(shù)。二、酶的應(yīng)用早在19世紀(jì)末，就有酶制劑的商品生產(chǎn)，目前已有1千多種，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及科學(xué)研究中日益發(fā)揮它的巨大作用。例如淀粉酶用于紡織品的退漿，可節(jié)約大量的堿并提高棉布的質(zhì)量。處理飼料以增加其營養(yǎng)價(jià)值。脂肪酶用于食品增香、羊毛洗滌。蛋白酶用于皮革業(yè)的脫毛、蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清、洗滌劑去污等。葡萄糖異構(gòu)酶用來制造果糖漿，葡糖氧化酶用來除去罐頭中殘余的氧。酶可作為試劑用于臨床檢驗(yàn)，如酶聯(lián)免疫測定；作為藥物用于臨床治療，如胃蛋白酶、胰蛋白酶助消化，鏈激酶、尿激酶治療血栓的形成；基因工程中應(yīng)用各種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行科研和生產(chǎn)。酶的開發(fā)和利用是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要內(nèi)容。1971年命名了酶工程（enzymeengineering），這是把酶學(xué)原理與化學(xué)工程技術(shù)及基因重組技術(shù)相結(jié)合而形成的新型應(yīng)用技術(shù)。酶工程可分為化學(xué)酶工程和生物酶工程。前者指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及人工模擬酶的研究和生產(chǎn)；后者指克隆酶、突變酶和合成新酶等內(nèi)容的研究和應(yīng)用。第四章新陳代謝總論與生物氧化教學(xué)目標(biāo)：掌握新陳代謝的概念與特點(diǎn)，了解新陳代謝研究方法。了解生物體內(nèi)能量代謝的基本規(guī)律。掌握生物氧化的概念、特點(diǎn)、部位，主要酶類和體系。熟悉生物氧化中二氧化碳、水的生成，掌握呼吸鏈的組成、類型和傳遞體順序。掌握氧化磷酸化的概念、類型、偶聯(lián)部位和P/O比值，熟悉影響氧化磷酸化因素、胞液中NADH的氧化和偶聯(lián)機(jī)制。第一節(jié)新陳代謝總論一、新陳代謝的概念與特點(diǎn)生物體是一個(gè)與環(huán)境保持著物質(zhì)、能量和信息交換的開放體系。通過物質(zhì)交換建造和修復(fù)生物體（按人的一生計(jì),交換物質(zhì)的總量約為體重的1200倍,人體所含的物質(zhì)平均每10天更新一半）。通過能量交換推動生命運(yùn)動，通過信息交換進(jìn)行調(diào)控，保持生物體和環(huán)境的適應(yīng)。新陳代謝（metabolism）是指生物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和能量交換的全過程。包括生物體內(nèi)所發(fā)生的一切合成和分解作用（即同化作用和異化作用）。人和動物的物質(zhì)代謝分為三個(gè)階段：食物、水、空氣進(jìn)入機(jī)體（攝取營養(yǎng)物的消化和吸收）、中間代謝和代謝產(chǎn)物的排泄。中間代謝是指物質(zhì)在細(xì)胞中的合成與分解過程，合成是吸能反應(yīng)，分解是放能反應(yīng)。它們是矛盾對立和統(tǒng)一的。所以，新陳代謝的功能是：從周圍環(huán)境中獲得營養(yǎng)物質(zhì)；將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨硇枰慕Y(jié)構(gòu)元件；將結(jié)構(gòu)元件裝配成自身的大分子；形成或分解生物體特殊功能所需的生物分子；提供機(jī)體生命活動所需的一切能量。各種生物具有各自特異的新陳代謝類型，這決定于遺傳和環(huán)境條件。綠色植物及某些細(xì)菌有光合作用，若干種細(xì)菌有固氮作用，是自養(yǎng)型的；動物與人是異養(yǎng)生物，同化作用必須從外界攝取營養(yǎng)物質(zhì)，通過消化吸收進(jìn)入中間代謝。同一生物體的各個(gè)器官或不同組織還具有不同的代謝方式。各種生物的新陳代謝過程雖然復(fù)雜，卻有共同的特點(diǎn)：生物體內(nèi)的絕大多數(shù)代謝反應(yīng)是在溫和條件下，由酶催化進(jìn)行的。物質(zhì)代謝通過代謝途徑，在一定的部位，嚴(yán)格有序地進(jìn)行。各種代謝途徑彼此協(xié)調(diào)組成有規(guī)律的反應(yīng)體系（網(wǎng)絡(luò)）。生物體對內(nèi)外環(huán)境條件有高度的適應(yīng)性和靈敏的自動調(diào)節(jié)。二、新陳代謝的研究方法代謝途徑的研究比較復(fù)雜，可從不同水平，主要對中間代謝進(jìn)行研究。新陳代謝途徑的闡明凝集了許多科學(xué)家的智慧與實(shí)驗(yàn)成果。如1904年德國化學(xué)家Knoop提出的脂肪酸的B氧化學(xué)說，1937年Krebs提出的檸檬酸循環(huán)。活體內(nèi)（invivo）和活體外（invitro）實(shí)驗(yàn)同位素示蹤法和核磁共振波譜法（NMR）代謝途徑阻斷法三、生物體內(nèi)能量代謝的基本規(guī)律服從熱力學(xué)原理。熱力學(xué)第一定律是能量守恒定律，熱力學(xué)第二定律指出，熱的傳導(dǎo)自高溫流向低溫。機(jī)體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)朝著達(dá)到其平衡點(diǎn)的方向進(jìn)行。2?生化反應(yīng)最重要的熱力學(xué)函數(shù)是吉布斯自由能G。自由能是在恒溫、恒壓下，一個(gè)體系作有用功的能力的度量。用于判斷反應(yīng)可否自發(fā)進(jìn)行，是放能或耗能反應(yīng)。AGV0,表示體系自由能減少，反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行，但是不等于說該反應(yīng)一定發(fā)生或以能覺察的速率進(jìn)行，是放能反應(yīng)。AG>0,反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行，吸收能量才推動反應(yīng)進(jìn)行。AG=0,體系處在平衡狀態(tài)。自由能與另外兩個(gè)函數(shù)有關(guān)，AG=AH-TAS（AH是總熱量的變化，AS是總熵的改變，T是體系的絕對溫度）。標(biāo)準(zhǔn)自由能變化用AGO,表示（25OC,1個(gè)大氣壓，pH為7,反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度為1mol/L時(shí)所測得，單位是kj/mol）。AGO,和化學(xué)平衡的關(guān)系A(chǔ)G=AGO，+RTln[C][D]/[A][B]AG=0時(shí)，AGO，=-RTln[C][D]/[A][B]=-RTlnK=-2.303RTlgK（R為氣體常數(shù)，lnK為平衡常數(shù)的自然對數(shù)。K>1,AGO,為負(fù)值，反應(yīng)趨于生成物的方向進(jìn)行；KV1,AGO，為正值。）注意：AG只取決于產(chǎn)物與反應(yīng)物的自由能之差，與反應(yīng)歷程無關(guān)。總自由能變化等于各步反應(yīng)自由能變化的代數(shù)和。熱力學(xué)上不利的吸能反應(yīng)可以偶聯(lián)放能反應(yīng)來推動以保持代謝途徑一連串反應(yīng)的進(jìn)行。四、高能化合物與ATP的作用高能化合物（high-energycompound）指化合物含有的自由能特多，且隨水解反應(yīng)或基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)釋放。最重要的有高能磷酸化合物，還有硫酯類和甲硫類高能化合物。高能磷酸化合物的酸酐鍵常用?P表示，水解時(shí)釋放的自由能大于20kJ,稱為高能磷酸鍵。生化中“高能鍵”的含義與化學(xué)中的“鍵能”完全不同。“鍵能”指斷裂一個(gè)化學(xué)鍵需提供的能量。ATP是細(xì)胞內(nèi)特殊的自由能載體。在標(biāo)準(zhǔn)狀況，ATP水解為ADP和Pi的AGO，=-30kJ/mol，水解為AMP和PPi的AGO,=-32kJ/moloATP的AGO，在所有的含磷酸基團(tuán)的化合物中處于中間位置，這使ATP在機(jī)體起