食品（飼料）中氨基酸的測定

王金娥

食品（飼料）中氨基酸的測定

王金娥1目錄一、氨基酸分析儀簡介

二、氨基酸

三、氨基酸分析儀基本分析原理

四、氨基酸分析儀法與HPLC的比較

五、樣品的制備

六、影響氨基酸分析的各種因素

七、應用目錄一、氨基酸分析儀簡介2日立氨基酸分析儀簡介一、氨基酸分析儀：（一）氨基酸分析儀的構成（見圖1)（二）氨基酸分析儀的流程圖（見圖2)（三）特點日立氨基酸分析儀簡介一、氨基酸分析儀：3日立氨基酸分析儀的構成、流程圖及特點（一）氨基酸分析儀的構成

1、輸液單元（泵與管路）

作用：輸送緩沖液、反應液在流路系統中流動。

2、進樣單元（自動進樣器）

作用：將樣品在流動相的帶動下送入儀器體系中。

3、分離單元（離子交換柱、柱溫箱）日立氨基酸分析儀的構成、流程圖及特點4

作用：主要是樣品的分離、將混合的樣品分離成單一組分。

4、反應單元（反應柱、反應溫度加熱設備）

作用：被分離的單一組分物質與反應液在反應單元反應、生成可檢測物質。

5、檢測單元（分光光度計）

作用：準確檢測單一組分物質的電能信號（mv).

6、程序控制、數據處理（工作站）作用：主要是樣品的分離、將混合的樣品分離成單一組分。5作用：儀器的運行程序控制、檢測結果的處理。

從圖、表面看（1）自動進樣器（2）泵1、泵2單元（3）電磁閥（4）除氣（5）廢液槽（6）檢測器（7）氮氣單元（8）柱溫箱（9）過濾器（10）混合器（11）反應柱單元（12）試劑和清洗液（13）保護罩。左側：電源開關。后部通訊接口、電源連接器、氮氣源連接器。作用：儀器的運行程序控制、檢測結果的處理。6食品飼料中氨基酸的測定課件7(二）氨基酸分析儀流程圖

見圖（2）(二）氨基酸分析儀流程圖8食品飼料中氨基酸的測定課件9（三）日立氨基酸分析儀特點（三）日立氨基酸分析儀特點10氨基酸

二、氨基酸

（一）氨基酸的定義（二）氨基酸的分類（三）氨基酸的化學性質氨基酸二、氨基酸11自然界中的氨基酸種類很多，但組成蛋白質的氨基酸只有20多種，從結構式上來看組成蛋白質的氨基酸除甘氨酸以外，都有一個不對稱碳原子、即a-碳原子，a-碳原子有四個不同的取代基：COOH羧基、NH2氨基、H氫原子、和R基團，不同氨基酸的R基團不同。氨基酸的R基團又稱為側鏈，由于不同氨基酸的側鏈不同它們的分子量、解離程度和化學反應、性能均不同。除甘氨酸外每種氨基酸都有L-構型、D-構型。蛋白質中的氨基酸都是L-型的，從形狀自然界中的氨基酸種類很多，但組成蛋白質的氨基酸只有20多種，12上看氨基酸是無色的結晶物質，它們在水溶液中顯中性、微酸性或微堿性。蛋白質成分中任何氨基酸均可用圖中的通式來表示（脯氨酸除外）：見下圖上看氨基酸是無色的結晶物質，它們在水溶液中顯中性、微酸性或微13氨基酸 組成蛋白質的20種氨基酸除甘氨酸外，

R都有一個不對稱碳原子，即а-碳原子。

HCCOOHа-碳原子有四個不同取代基：羧基、

NH2氨基、氫原子和R基團，不同氨基酸的R 基團不同。

每種氨基酸有D-構型和L-構型，蛋白質中的氨基酸都是L-構型。氨基酸 14（一）氨基酸的定義

（略）（一）氨基酸的定義

（略）15（二）氨基酸的分類它的分類有兩種：

1.按氨基酸具有的酸性和堿性基團的多少分類：2、按人體營養的需求又可分為必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸（二）氨基酸的分類16（三）氨基酸的化學性質氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它們都能產生氨基與羧基的一般反應，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸堿的中和作用等。有些氨基酸由于存在其它基團而產生特殊反應，如半胱氨酸的巰基（－SH)（三）氨基酸的化學性質17

茚三酮與羥脯氨酸反應不釋放NH3

，直接生成黃色化合物，吸收波長在440nm氨基酸的化學反應

與茚三酮反應：茚三酮與氨基酸一起加熱，形成深蘭紫色復合物,最大吸收波長為570nm

茚三酮與羥脯氨酸反應不釋放NH3，直接生成黃色18與茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮共同加熱被氧化分解產生CO2、氨和比氨基酸少一個碳原子的醛，此時茚三酮被還原。在弱酸性溶液中，還原茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合成藍紫色化合物茚二酮胺（DYDA）DYDA在570nm處有最大吸收。脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色物質，在440nm處吸收峰最大。除氨基酸以外，如NH2肽類也可與茚三酮反應生成有色物質（這種反應機理現應用于我們使用的氨基酸分析儀之中）。與茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮共同加熱被氧化分解產19氨基酸分析儀分析原理三、氨基酸分析儀基本分析原理

（一）離子交換柱

（二）離子交換樹脂

（三）離子交換原理

（四）氨基酸分析儀洗脫過程氨基酸分析儀分析原理三、氨基酸分析儀基本分析原理20氨基酸分析儀與HPLC法的比較四、氨基酸分析儀與HPLC法的比較

（一）OPA法（鄰苯二甲醛）

（二）PITC法

（三）D—CL法

（四）2-4—二硝基氟苯法氨基酸分析儀與HPLC法的比較四、氨基酸分析儀與HPLC法的21氨基酸分析儀與HPLC常規比較氨基酸分析儀與HPLC常規比較22樣品的制備五、樣品的制備

（一）蛋白質的水解

（二）游離氨基酸樣品的制備

（三）生理體液樣品的前處理樣品的制備五、樣品的制備23（一）蛋白質的水解：用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質形式存在的都要進行水解處理，水解方法有三種：

1、酸水解法：標準水解法，是普遍采用的水解方法，此方法的特點是水解徹底，但色氨酸遭破壞。（6NHCL、110℃真空水解24小時）

優點：HCL本身加熱可以蒸發除掉。缺點：溶液顯黒褐色、與含醛基化合物作用的結果。

2、堿水解法：用NaOH(LiOH、Ba(OH)2)作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、胱氨酸遭不同程度的破壞。

優點：水解液清亮。缺點：放出氨氣和硫化氫.（一）蛋白質的水解：243、酶水解法：酶是有機催化劑，它不需要高溫高壓，而是在常溫常壓下即可催化有機物質的合成與分解。特點是水解條件溫和，無需特殊設備，氨基酸不受破壞；產物中除氨基酸外尚有較多肽類；此方法主要用于生產水解蛋白及蛋白肽。缺點：水解時間長、而且不易水解完全。

目前日本、歐洲和我國植物蛋白水解生產上采用的工藝均為酸水解法。3、酶水解法：酶是有機催化劑，它不需要高溫高壓，而是在常溫常25（二）游離氨基酸樣品的制備游離氨基酸的樣品在分析前必需進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進行分析前建議使用C18過濾柱處理一下為好。（三）生理體液樣品的處理：生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質，獲得游離氨基酸。除去蛋白質化學方法為：

1、苦味酸法用1%的苦味酸沉淀，然后過柱子除苦味酸，在把氨基酸從柱子上洗脫下來進行分析。（二）游離氨基酸樣品的制備262、三氯醋酸法

生物堿沉淀劑醫院臨床生化、常用此類試劑沉淀血漿中的蛋白質。

3、乙醇沉淀法

當乙醇加入含蛋白質的水溶液中，可使蛋白質表面失去水膜，并增大顆粒間的引力，引起蛋白質沉淀。

4、磺基水楊酸法（常用的方法）2、三氯醋酸法27影響氨基酸分析的各種因素六、影響氨基酸分析的各種因素

（一）樣品中氨基酸濃度的影響

（二）緩沖液PH值、鈉離子濃度的影響

（三）柱溫的影響

（四）氨的影響

（五）氧存在的影響

（六）光源的影響（鎢燈）影響氨基酸分析的各種因素六、影響氨基酸分析的各種因素28應用七、應用

（一）醫學上的應用

（二）飼料上的應用

（三）農業、食品、飲料及其它應用七、應用29氨基酸自動分析儀法測定食品（飼料）氨基酸含量1.原理

食品（飼料）蛋白質經鹽酸水解成為游離氨基酸，經氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產生顏色反應，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。2.試劑3.儀器4.測定方法5.結果計算氨基酸自動分析儀法測定食品（飼料）氨基酸含量30酸水解原理與步驟酸水解原理與步驟31酸水解原理與步驟酸水解原理與步驟32氧化水解原理與步驟氧化水解原理與步驟33食品飼料中氨基酸的測定課件34堿水解原理與步驟堿水解原理與步驟35食品飼料中氨基酸的測定課件36水解技術水解方式：真空（充N）封管法開放式回流水解法培養管水解法水解技術水解方式：37培養管水解法培養管水解法38氮吹儀氮吹儀39水解液蒸干技術水解液蒸干技術40冷井杜瓦瓶

-196℃液氮冷井杜瓦瓶-196℃液氮冷井杜瓦瓶

-196℃液氮冷井杜瓦瓶-196℃液氮41氨基酸標準溶液譜圖氨基酸標準溶液譜圖42食品飼料中氨基酸的測定課件43

氨基酸分離技術在各個領域中應用非常廣泛，已成為我國科學領域中必不可少的一種檢測手段。

謝謝大家！

44食品（飼料）中氨基酸的測定

王金娥

食品（飼料）中氨基酸的測定

王金娥45目錄一、氨基酸分析儀簡介

二、氨基酸

三、氨基酸分析儀基本分析原理

四、氨基酸分析儀法與HPLC的比較

五、樣品的制備

六、影響氨基酸分析的各種因素

七、應用目錄一、氨基酸分析儀簡介46日立氨基酸分析儀簡介一、氨基酸分析儀：（一）氨基酸分析儀的構成（見圖1)（二）氨基酸分析儀的流程圖（見圖2)（三）特點日立氨基酸分析儀簡介一、氨基酸分析儀：47日立氨基酸分析儀的構成、流程圖及特點（一）氨基酸分析儀的構成

1、輸液單元（泵與管路）

作用：輸送緩沖液、反應液在流路系統中流動。

2、進樣單元（自動進樣器）

作用：將樣品在流動相的帶動下送入儀器體系中。

3、分離單元（離子交換柱、柱溫箱）日立氨基酸分析儀的構成、流程圖及特點48

作用：主要是樣品的分離、將混合的樣品分離成單一組分。

4、反應單元（反應柱、反應溫度加熱設備）

作用：被分離的單一組分物質與反應液在反應單元反應、生成可檢測物質。

5、檢測單元（分光光度計）

作用：準確檢測單一組分物質的電能信號（mv).

6、程序控制、數據處理（工作站）作用：主要是樣品的分離、將混合的樣品分離成單一組分。49作用：儀器的運行程序控制、檢測結果的處理。

從圖、表面看（1）自動進樣器（2）泵1、泵2單元（3）電磁閥（4）除氣（5）廢液槽（6）檢測器（7）氮氣單元（8）柱溫箱（9）過濾器（10）混合器（11）反應柱單元（12）試劑和清洗液（13）保護罩。左側：電源開關。后部通訊接口、電源連接器、氮氣源連接器。作用：儀器的運行程序控制、檢測結果的處理。50食品飼料中氨基酸的測定課件51(二）氨基酸分析儀流程圖

見圖（2）(二）氨基酸分析儀流程圖52食品飼料中氨基酸的測定課件53（三）日立氨基酸分析儀特點（三）日立氨基酸分析儀特點54氨基酸

二、氨基酸

（一）氨基酸的定義（二）氨基酸的分類（三）氨基酸的化學性質氨基酸二、氨基酸55自然界中的氨基酸種類很多，但組成蛋白質的氨基酸只有20多種，從結構式上來看組成蛋白質的氨基酸除甘氨酸以外，都有一個不對稱碳原子、即a-碳原子，a-碳原子有四個不同的取代基：COOH羧基、NH2氨基、H氫原子、和R基團，不同氨基酸的R基團不同。氨基酸的R基團又稱為側鏈，由于不同氨基酸的側鏈不同它們的分子量、解離程度和化學反應、性能均不同。除甘氨酸外每種氨基酸都有L-構型、D-構型。蛋白質中的氨基酸都是L-型的，從形狀自然界中的氨基酸種類很多，但組成蛋白質的氨基酸只有20多種，56上看氨基酸是無色的結晶物質，它們在水溶液中顯中性、微酸性或微堿性。蛋白質成分中任何氨基酸均可用圖中的通式來表示（脯氨酸除外）：見下圖上看氨基酸是無色的結晶物質，它們在水溶液中顯中性、微酸性或微57氨基酸 組成蛋白質的20種氨基酸除甘氨酸外，

R都有一個不對稱碳原子，即а-碳原子。

HCCOOHа-碳原子有四個不同取代基：羧基、

NH2氨基、氫原子和R基團，不同氨基酸的R 基團不同。

每種氨基酸有D-構型和L-構型，蛋白質中的氨基酸都是L-構型。氨基酸 58（一）氨基酸的定義

（略）（一）氨基酸的定義

（略）59（二）氨基酸的分類它的分類有兩種：

1.按氨基酸具有的酸性和堿性基團的多少分類：2、按人體營養的需求又可分為必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸（二）氨基酸的分類60（三）氨基酸的化學性質氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它們都能產生氨基與羧基的一般反應，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸堿的中和作用等。有些氨基酸由于存在其它基團而產生特殊反應，如半胱氨酸的巰基（－SH)（三）氨基酸的化學性質61

茚三酮與羥脯氨酸反應不釋放NH3

，直接生成黃色化合物，吸收波長在440nm氨基酸的化學反應

與茚三酮反應：茚三酮與氨基酸一起加熱，形成深蘭紫色復合物,最大吸收波長為570nm

茚三酮與羥脯氨酸反應不釋放NH3，直接生成黃色62與茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮共同加熱被氧化分解產生CO2、氨和比氨基酸少一個碳原子的醛，此時茚三酮被還原。在弱酸性溶液中，還原茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合成藍紫色化合物茚二酮胺（DYDA）DYDA在570nm處有最大吸收。脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色物質，在440nm處吸收峰最大。除氨基酸以外，如NH2肽類也可與茚三酮反應生成有色物質（這種反應機理現應用于我們使用的氨基酸分析儀之中）。與茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮共同加熱被氧化分解產63氨基酸分析儀分析原理三、氨基酸分析儀基本分析原理

（一）離子交換柱

（二）離子交換樹脂

（三）離子交換原理

（四）氨基酸分析儀洗脫過程氨基酸分析儀分析原理三、氨基酸分析儀基本分析原理64氨基酸分析儀與HPLC法的比較四、氨基酸分析儀與HPLC法的比較

（一）OPA法（鄰苯二甲醛）

（二）PITC法

（三）D—CL法

（四）2-4—二硝基氟苯法氨基酸分析儀與HPLC法的比較四、氨基酸分析儀與HPLC法的65氨基酸分析儀與HPLC常規比較氨基酸分析儀與HPLC常規比較66樣品的制備五、樣品的制備

（一）蛋白質的水解

（二）游離氨基酸樣品的制備

（三）生理體液樣品的前處理樣品的制備五、樣品的制備67（一）蛋白質的水解：用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質形式存在的都要進行水解處理，水解方法有三種：

1、酸水解法：標準水解法，是普遍采用的水解方法，此方法的特點是水解徹底，但色氨酸遭破壞。（6NHCL、110℃真空水解24小時）

優點：HCL本身加熱可以蒸發除掉。缺點：溶液顯黒褐色、與含醛基化合物作用的結果。

2、堿水解法：用NaOH(LiOH、Ba(OH)2)作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、胱氨酸遭不同程度的破壞。

優點：水解液清亮。缺點：放出氨氣和硫化氫.（一）蛋白質的水解：683、酶水解法：酶是有機催化劑，它不需要高溫高壓，而是在常溫常壓下即可催化有機物質的合成與分解。特點是水解條件溫和，無需特殊設備，氨基酸不受破壞；產物中除氨基酸外尚有較多肽類；此方法主要用于生產水解蛋白及蛋白肽。缺點：水解時間長、而且不易水解完全。

目前日本、歐洲和我國植物蛋白水解生產上采用的工藝均為酸水解法。3、酶水解法：酶是有機催化劑，它不需要高溫高壓，而是在常溫常69（二）游離氨基酸樣品的制備游離氨基酸的樣品在分析前必需進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進行分析前建議使用C18過濾柱處理一下為好。（三）生理體液樣品的處理：生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質，獲得游離氨基酸。除去蛋白質化學方法為：

1、苦味酸法用1%的苦味酸沉淀，然后過柱子除苦味酸，在把氨基酸從柱子上洗脫下來進行分析。（二）游離氨基酸樣品的制備702、三氯醋酸法

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