第二講正常和腫瘤組織細胞的培養詳解演示文稿第一頁，共七十四頁。優選第二講正常和腫瘤組織細胞的培養第二頁，共七十四頁。不同組織細胞和器官的結構和功能、生長特性不同，在體外培養中所需的分離方法和生長條件也不同。第三頁，共七十四頁。上皮細胞的體外培養許多器官上的上皮細胞具有特定的功能，如腎和腸道上皮細胞具有吸收功能，肝和胰上皮細胞的分泌功能，肺上皮細胞的氣體交換功能；上皮組織還常發生腫瘤。第四頁，共七十四頁。上皮細胞的基本特征：

1.上皮組織的形態結構

群體依賴性（populationdependence)接觸抑制（contactinhibition)2.上皮細胞的極性

貼壁依賴性細胞-貼壁生長生長基質3.上皮細胞間的連接第五頁，共七十四頁。體外培養的上皮組織細胞的生長生物學1.形態學結構：

均質性、透明性很強，結構不明顯第六頁，共七十四頁。2.體外培養上皮組織的生長與增殖特征(1)

體外培養的特殊條件：

防范微生物污染生長基質的支持特殊的培養基

M199RPMI1640DMEMFamF12無血清培養基

去成纖維細胞第七頁，共七十四頁。根據上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內等處的上皮組織，直接暴露或同外環境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。要求在組織取材時就嚴格滅菌；分離、種植、培養等諸多操作步驟上都要設法消除可能會出現的微生物污染。培養中所使用的各種液體，包括細胞保存液、分離液以及培養基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養高。

防范微生物污染第八頁，共七十四頁。皮細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。在培養器皿表面包被生長基質，如膠原或其它細胞外基質成分等，模擬體內的基膜結構，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養細胞的分化．使細胞極性表現更為明顯。生長基質的支持第九頁，共七十四頁。M199和RPMI1640培養基僅適用于上皮組織的短期培養和維持其生存，對上皮組織的長期培養和促增殖作用并不明顯。DMEM和HamFl2培養基用于上皮組織培養時有其特殊作用。可促進上皮細胞的貼附；維持上皮細胞在體外培養狀態的分化。HamFl2培養基的特殊性特別適用原代上皮細胞的培養，培養基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。在實際培養時，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養。特殊的培養基第十頁，共七十四頁。去除成纖維細胞上皮組織借薄層基膜和結締組織相連。取材分離細胞時會帶入少量結締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長。由于成纖維細胞具有增殖能力和粘附能力強的特點，很容易“瘋長”為培養物中的優勢細胞群，從而干擾或抑制上皮細胞的生長，成為上皮細胞的“細胞污染源”。因此在上皮細胞的取材、分離、種植和傳代的培養過程中，要特別注意上皮細胞的純化，去除和抑制成纖維細胞的生長。第十一頁，共七十四頁。(2)體外培養上皮細胞的形態學變化第十二頁，共七十四頁。體外培養上皮組織細胞的觀察與檢測1.一般形態學觀察

光鏡：形態、輪廓、生長情況等。細胞規則、明亮而飽滿、細胞輪廓不清

電鏡：橋粒、形態結構特征、細胞間關系培養液pH變化：顏色變化？培養物的污染情況：

透明度變化？

第十三頁，共七十四頁。2.組織化學與免疫組織化學觀察與檢測酶類：

堿性磷酸酶琥珀酸脫氫酶特異性抗原標記物：

角蛋白、上皮細胞膜抗原VIII因子、晶體蛋白、唾液酸糖蛋白第十四頁，共七十四頁。血管內皮細胞的體外培養第十五頁，共七十四頁。人臍靜脈內皮細胞的培養組織來源：

嬰兒臍帶培養用液：

M199+20%FCSD-Hanks0.1%膠原酶溶液1.主要材料：第十六頁，共七十四頁。2.培養方法：

分離細胞培養法第十七頁，共七十四頁。1).

將15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。（注：4℃下最多貯存24小時，室溫下不超過6小時，否則廢棄）2).

用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的PBS溶液沖洗3-5次，將污血沖洗干凈為止。3).

用手術鉗夾緊臍帶下端，加入15ml的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時上下搖動臍帶。4).

消化完后，將下端手術鉗松開，消化液流入一個50ml無菌離心管中，用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。5).將收集液離心（2000轉/分）3分鐘，去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置CO2培養箱中培養，兩至三天可見細胞長成單層。

第十八頁，共七十四頁。

(1)關于接種材料的制備

取材與消化消化酶、濃度、時間

(2)排除成纖維細胞

傳代去除法加肝素培養法(90u/ml)刮除法

(3)關于培養液

(4)關于傳代培養5.討論：第十九頁，共七十四頁。

(1)光鏡檢查(2)透射電鏡檢查：

W-P小體

(3)VIII因子相關抗原的免疫組化檢測6.內皮細胞的鑒定：第二十頁，共七十四頁。腎小管上皮細胞的培養第二十一頁，共七十四頁。1.主要材料：a.細胞來源：b.無血清培養液：

基礎培養液：

DMEM/HamF12(1:1)

添加物：

胰島素5g/ml轉鐵蛋白5g/ml硒5g/ml氫化可的松36ng/mlT34ng/mlEGF10g/ml第二十二頁，共七十四頁。

c.消化液：

0.2%胰蛋白酶d.細胞篩網：

80和100目第二十三頁，共七十四頁。2.原代培養：切取1cm3外層腎皮質、剪碎成1mm380目研磨沖洗、于100目上收集腎小管節段0.2%胰蛋白酶消化、調整細胞數接種于纖維連接蛋白包被的培養瓶進行培養每隔3~4天，更換培養液第二十四頁，共七十四頁。3.傳代培養：4.培養結果：

3d長出細胞5~7d進入對數生長期7~9d融合成單細胞層5.鑒定：抗角蛋白抗體染色（+）第二十五頁，共七十四頁。6.注意事項：a.分離方法：b.鑒定方法：第二十六頁，共七十四頁。巨噬細胞的培養

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用。

第二十七頁，共七十四頁。1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。2、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10mlDMEM培養基。9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用DMEM液沖洗1一2次，再加新DMEM培養液置CO2溫箱中。

第二十八頁，共七十四頁。巨噬細胞的培養動物：

小鼠、大鼠、兔、人培養基：

EagleMEMRPMI1640HamF12常用的巨噬細胞：

肺泡和腹腔巨噬細胞第二十九頁，共七十四頁。獲取巨噬細胞的方法（一）肺泡巨噬細胞

支氣管肺泡灌洗法支氣管鏡肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬細胞

1.小鼠腹腔巨噬細胞的獲取：

(1)主要材料：實驗動物:6周齡小鼠培養液：

10%FCSRPMI1640

第三十頁，共七十四頁。巨噬細胞的純化1、原理：

巨噬細胞黏附能力強、貼壁快特點2.方法：用帖壁法純化巨噬細胞用不連續密度梯度離心純化巨噬細胞第三十一頁，共七十四頁。1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培養液將巨噬細胞配成2×106～4×106/ml的濃度。以每平方厘米2×105～4×105個巨噬細胞的密度將細胞懸液接種到玻璃培養皿（瓶）或塑料培養皿（瓶）中。37℃5％CO2培養箱中培養1小時或24小時。1小時培養節省時間但會丟失一些粘附力弱的巨噬細胞，而24小時可以得到較多的巨噬細胞。20％～40％的小牛血清可以減少B淋巴細胞的粘附。2．搖晃培養皿（瓶），懸浮未粘附細胞，吸出細胞懸液。用預溫的Hanks液洗滌細胞3～4次。懸浮細胞可重復粘附，得到更多巨噬細胞。用適量含2.5mMEDTA的無鈣鎂Hanks液消化細胞37℃15～30分鐘。用吸管吹打分離細胞，離心250×g10分鐘，去上清液。3．用預冷Hanks液洗滌細胞3～4次，每次離心250×g10min，去上清。最后用含10％FBS的RPMI-1640培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數細胞并測細胞活力，將細胞配成所需濃度。

用帖壁法純化巨噬細胞第三十二頁，共七十四頁。1．取15ml離心管，將制備好的各濃度密度梯度材料按下濃上淡的順序依次分層加在離心管中，每個濃度2ml。最后加上上述巨噬細胞懸液3～5ml（約含2×107～5×107細胞）。2．4℃中，水平離心1000×g30分鐘，垂直取出離心管，小心吸出各交界面的細胞。分別用預冷的含1％小牛血清RPMI-1640培養液洗滌各交界面細胞2次，每次200×g10分鐘。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞配成所需的濃度。用不連續密度梯度離心純化巨噬細胞第三十三頁，共七十四頁。巨噬細胞的接種和培養（一）主要材料：培養液：

RPMI1640等+10~40%FCS+抗生素

（二）實驗步驟：

a.冷分離b.調整細胞濃度：2~4×106/mlc.接種培養第三十四頁，共七十四頁。（三）培養結果：大小：20~50m形態：菱形、星形、圓形功能：吞噬功能增殖情況：不增殖、存活1~3周第三十五頁，共七十四頁。（四）巨噬細胞的鑒定1.吞噬實驗：

加入0.001M(finalcon.)SiO2吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力試驗：

0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反復吹打細胞變園但不脫落3.細胞化學試驗：

ACP酶染色：棕黑色NSE酶染色：紫藍色第三十六頁，共七十四頁。淋巴細胞的培養第三十七頁，共七十四頁。各類淋巴細胞的主要特征表面標志：

1.表面受體：TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseRT淋巴細胞：第三十八頁，共七十四頁。

MHCCD2.表面抗原第三十九頁，共七十四頁。B淋巴細胞1.表面受體

BCRFcRCR絲裂原受體EBVR2.表面抗原

MHC抗原CD抗原（CD19、20、21、23、45）第四十頁，共七十四頁。血淋巴細胞的分離（一）單個核細胞的分離密度梯度離心法外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。第四十一頁，共七十四頁。外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

(PBMC)1.092PBMC:Peripheralbloodmononuclearcell第四十二頁，共七十四頁。1.每毫升外周血液大約可獲1×106單個核細胞2.Ficoll應適量，外周血應充分稀釋2.溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果3.在Ficoll上加入稀釋外周血時，應緩慢加，以免沖散界面4.吸取單個核細胞層時，應避免吸出過多的上清液或分層液而導致血小板污染第四十三頁，共七十四頁。1500rpm,20℃

,30minPBMC紅細胞粒細胞Ficoll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、血小板第四十四頁，共七十四頁。（二）純淋巴細胞的制備1.玻璃黏附法2.羰基鐵粉法第四十五頁，共七十四頁。（三）T、B淋巴細胞的分離1.T細胞花環沉降法2.尼龍毛柱分離法第四十六頁，共七十四頁。（四）大顆粒淋巴細胞的分離（五）FACS儀分離（六）免疫磁珠法第四十七頁，共七十四頁。

三、血淋巴細胞的體外培養應用第四十八頁，共七十四頁。（一）淋巴細胞轉化試驗（二）B細胞產生Ig的檢查（三）T細胞介導的細胞毒試驗（四）NK細胞毒性試驗（五）K細胞毒性試驗（六）LAK細胞的制備（七）TIL細胞的制備第四十九頁，共七十四頁。（八）淋巴細胞的體外長期培養1.用IL-2建立T淋巴細胞克隆2.用EB病毒轉化B淋巴細胞3.用B細胞生長因子建立B淋巴細胞株第五十頁，共七十四頁。腫瘤細胞體外培養第五十一頁，共七十四頁。腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點：

腫瘤細胞在體外的生長生物學特性㈠形態和性狀

培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態，大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。

第五十二頁，共七十四頁。㈡生長增殖腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化后，出現能在低血清培養基中生長的現象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化后的單個細胞培養時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發展，形成堆積物。

第五十三頁，共七十四頁。永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。

體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。多數腫瘤細胞初代培養時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。㈢腫瘤細胞永生性第五十四頁，共七十四頁。（四）浸潤性

浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。

（五）異質性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態，那些呈活躍增殖狀態的細胞稱干細胞（StemCells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養方法稱干細胞培養。

第五十五頁，共七十四頁。（六）細胞遺傳

大多數腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數個亞系，并不斷進行著適應性演變。

第五十六頁，共七十四頁。（七）其它

腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的LifeSpan，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數量很少；④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。第五十七頁，共七十四頁。腫瘤細胞的培養方法

腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。

第五十八頁，共七十四頁。RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺：

上皮性癌細胞或懸浮性腫瘤細胞DMEM、199、MEM：

肉瘤細胞的培養F12、L-15:

上皮性癌細胞的培養（如肝癌細胞）加:2g/LNaHCO320mmol/LHEPES腫瘤細胞的培養方法：腫瘤細胞體外培養常用的培養基（一）培養液的種類和選擇第五十九頁，共七十四頁。（二）培養液特殊添加劑

常用的促細胞生長因子及使用的終濃度

添加劑終濃度BSA10-5mol/mlTRF5~10ug/mlInsulin5ug/ml氫化可的松10-6mol/mlEGF5ng/mlFGF5ng/mlNGF5ng/ml第六十頁，共七十四頁。腫瘤組織細胞的原代培養取材：人腫瘤細胞來自外科手術、活檢瘤組織、胸腹水穿刺、細針頭穿刺、內窺鏡活檢等。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。

關鍵：新鮮、無菌、及時、準確第六十一頁，共七十四頁。技術-分離純化分離：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分離純化：反復貼壁去除成纖維細胞自然淘汰去除正常細胞利用特異抗原標志篩選法(panning)分亞型流式細胞儀分選克隆建株高轉移株的建立：反復接種第六十二頁，共七十四頁。技術-培養原代培養：去除纖維細胞及淋巴細胞，防止細菌、真菌污染。傳代培養：增殖力低的細胞需要飼養細胞適當密度,基本長滿后傳代,前10代不穩定，注意培養條件，適當調整培養基。第六十三頁，共七十四頁。技術-鑒定與建株鑒定：組織來源、形態特征、核型染色體分析、生長特性、對細胞因子的反應（TNF)、集落形成、致瘤實驗（裸小鼠）建株：生長半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長特征、染色體分析、腫瘤標志、致瘤及轉移情況注意：不是每一腫瘤組織都能建株第六十四頁，共七十四頁。腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。第六十五頁，共七十四頁。成纖維細胞的排除：成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。第六十六頁，共七十四頁。去除成纖維細胞的方法第六十七頁，共七十四頁。是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；（2）刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。1、機械刮除法：第六十八頁，共七十四頁。2、反復貼壁法：根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；（2）取編號為此A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫