多肽氨基酸知識多肽氨基酸知識多肽氨基酸知識xxx公司多肽氨基酸知識文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度（一）基本氨基酸

組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸稱為基本氨基酸。它們中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一個氨基。基本氨基酸都符合通式，都有單字母和三字母縮寫符號。

按照氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，可分為三類：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和雜環(huán)氨基酸。

1.脂肪族氨基酸共15種。

側(cè)鏈只是烴鏈：Gly,Ala,Val,Leu,Ile后三種帶有支鏈，人體不能合成，是必需氨基酸。

側(cè)鏈含有羥基：Ser,Thr許多蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，它還在蛋白質(zhì)與糖類及磷酸的結(jié)合中起重要作用。

側(cè)鏈含硫原子：Cys,

Met兩個半胱氨酸可通過形成二硫鍵結(jié)合成一個胱氨酸。二硫鍵對維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)有重要意義。半胱氨酸也經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心里。甲硫氨酸的硫原子有時參與形成配位鍵。甲硫氨酸可作為通用甲基供體，參與多種分子的甲基化反應(yīng)。

側(cè)鏈含有羧基：Asp（D）,Glu（E）

側(cè)鏈含酰胺基：Asn（N）,Gln（Q）

側(cè)鏈顯堿性：Arg（R）,Lys（K）

2.芳香族氨基酸包括苯丙氨酸（Phe,F）和酪氨酸(Tyr,Y)兩種。酪氨酸是合成甲狀腺素的原料。

3.雜環(huán)氨基酸

包括色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His)和脯氨酸(Pro)三種。其中的色氨酸與芳香族氨基酸都含苯環(huán)，都有紫外吸收(280nm)。所以可通過測量蛋白質(zhì)的紫外吸收來測定蛋白質(zhì)的含量。組氨酸也是堿性氨基酸，但堿性較弱，在生理條件下是否帶電與周圍內(nèi)環(huán)境有關(guān)。它在活性中心常起傳遞電荷的作用。組氨酸能與鐵等金屬離子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是α-螺旋的破壞者。

B是指Asx，即Asp或Asn；Z是指Glx，即Glu或Gln。

基本氨基酸也可按側(cè)鏈極性分類：

非極性氨基酸：Ala,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp,Pro共八種

極性不帶電荷：Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr共七種

帶正電荷：Arg,Lys,His

帶負(fù)電荷：Asp,Glu

（二）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸

某些蛋白質(zhì)中含有一些不常見的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質(zhì)合成以后經(jīng)羥化、羧化、甲基化等修飾衍生而來的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、鎖鏈素等。其中羥脯氨酸和羥賴氨酸在膠原和彈性蛋白中含量較多。在甲狀腺素中還有3,5-二碘酪氨酸。

（三）非蛋白質(zhì)氨基酸

自然界中還有150多種不參與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸。它們大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或β、γ、δ-氨基酸。這些氨基酸中有些是重要的代謝物前體或中間產(chǎn)物，如瓜氨酸和鳥氨酸是合成精氨酸的中間產(chǎn)物，β-丙氨酸是遍多酸（泛酸，輔酶A前體）的前體，γ-氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動的化學(xué)介質(zhì)。

二、氨基酸的性質(zhì)

（一）物理性質(zhì)

α-氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸都有特殊的結(jié)晶形狀，可以用來鑒別各種氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇或乙MI中。

除甘氨酸外，α-氨基酸都有旋光性，α-碳原子具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸有兩個手性碳原子。從蛋白質(zhì)水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物體內(nèi)特別是細(xì)菌中，D-氨基酸也存在，如細(xì)菌的細(xì)胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。

三個帶苯環(huán)的氨基酸有紫外吸收，F(xiàn):257nm,ε=200;Y:275nm,ε=1400;

W:280nm,ε=5600。通常蛋白質(zhì)的紫外吸收主要是后兩個氨基酸決定的，一般在280nm。

氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶極離子的形式存在。所以氨基酸晶體是離子晶體，熔點在200℃以上。氨基酸是兩性電解質(zhì)，各個解離基的表觀解離常數(shù)按其酸性強度遞降的順序，分別以K1'、K2'來表示。當(dāng)氨基酸分子所帶的凈電荷為零時的pH稱為氨基酸的等電點(pI)。等電點的值是它在等電點前后的兩個pK'值的算術(shù)平均值。

氨基酸完全質(zhì)子化時可看作多元弱酸，各解離基團的表觀解離常數(shù)按酸性減弱的順序，以pK1'、pK2'

、pK3'表示。氨基酸可作為緩沖溶液，在pK'處的緩沖能力最強，pI處的緩沖能力最弱。

氨基酸的滴定曲線如圖。

（二）化學(xué)性質(zhì)

1.氨基的反應(yīng)

（1）酰化

氨基可與酰化試劑，如酰氯或酸酐在堿性溶液中反應(yīng)，生成酰胺。該反應(yīng)在多肽合成中可用于保護氨基。

（2）與亞硝酸作用

氨基酸在室溫下與亞硝酸反應(yīng)，脫氨，生成羥基羧酸和氮氣。因為伯胺都有這個反應(yīng)，所以賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)，但速度較慢。常用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾、水解程度測定及氨基酸的定量。

（3）與醛反應(yīng)

氨基酸的α-氨基能與醛類物質(zhì)反應(yīng)，生成西佛堿-C=N-。西佛堿是氨基酸作為底物的某些酶促反應(yīng)的中間物。賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)。氨基還可以與甲醛反應(yīng)，生成羥甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測定含量。與甲醛反應(yīng)后，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測定氨基酸。

（4）與異硫氰酸苯酯(PITC)反應(yīng)

α-氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-AA）。這些衍生物是無色的，可用層析法加以分離鑒定。這個反應(yīng)首先為Edman用來鑒定蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸，在蛋白質(zhì)的氨基酸順序分析方面占有重要地位。

（5）磺酰化

氨基酸與5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應(yīng)，生成DNS-氨基酸。產(chǎn)物在酸性條件下(6NHCl)100℃也不破壞，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有強熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比較靈敏，可用于微量分析。

（6）與DNFB反應(yīng)

氨基酸與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。這一反應(yīng)是定量轉(zhuǎn)變的，產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100℃高溫。該反應(yīng)曾被英國的Sanger用來測定胰島素的氨基酸順序，也叫桑格爾試劑，現(xiàn)在應(yīng)用于蛋白質(zhì)N-末端測定。

（7）轉(zhuǎn)氨反應(yīng)

在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨基，變成相應(yīng)的酮酸。

2.羧基的反應(yīng)

羧基可與堿作用生成鹽，其中重金屬鹽不溶于水。羧基可與醇生成酯，此反應(yīng)常用于多肽合成中的羧基保護。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如對硝基苯酯。將氨基保護以后，可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在脫羧酶的催化下，可脫去羧基，形成伯胺。

3茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮在微酸性溶液中加熱，最后生成藍(lán)色物質(zhì)。而脯氨酸生成黃色化合物。根據(jù)這個反應(yīng)可通過二氧化碳測定氨基酸含量。

4.側(cè)鏈的反應(yīng)

絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或苷。

半胱氨酸側(cè)鏈巰基反應(yīng)性高：

（1）二硫鍵(disulfidebond)

半胱氨酸在堿性溶液中容易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質(zhì)的構(gòu)象上起很大的作用。氧化劑和還原劑都可以打開二硫鍵。在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時，氧化劑過甲酸可以定量地拆開二硫鍵，生成相應(yīng)的磺酸。還原劑如巰基乙醇、巰基乙酸也能拆開二硫鍵，生成相應(yīng)的巰基化合物。由于半胱氨酸中的巰基很不穩(wěn)定，極易氧化，因此利用還原劑拆開二硫鍵時，往往進一步用碘乙酰胺、氯化芐、N-乙基丁烯二亞酰胺和對氯汞苯甲酸等試劑與巰基作用，把它保護起來，防止它重新氧化。

（2）烷化

半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘乙酰胺等發(fā)生烷化反應(yīng)。

半胱氨酸與丫丙啶反應(yīng)，生成帶正電的側(cè)鏈，稱為S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。

（3）與重金屬反應(yīng)

極微量的某些重金屬離子，如Ag+、Hg2+，就能與巰基反應(yīng)，生成硫醇鹽，導(dǎo)致含巰基的酶失活。

5.以下反應(yīng)常用于氨基酸的檢驗：

l酪氨酸、組氨酸能與重氮化合物反應(yīng)(Pauly反應(yīng))，可用于定性、定量測定。組氨酸生成棕紅色的化合物，酪氨酸為桔黃色。

l精氨酸在氫氧化鈉中與1-萘酚和次溴酸鈉反應(yīng)，生成深紅色，稱為坂口反應(yīng)。用于胍基的鑒定。

l酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞反應(yīng)，生成白色沉淀，加熱后變紅，稱為米倫反應(yīng)，是鑒定酚基的特性反應(yīng)。

l色氨酸中加入乙醛酸后再緩慢加入濃硫酸，在界面會出現(xiàn)紫色環(huán)，用于鑒定吲哚基。

在蛋白質(zhì)中，有些側(cè)鏈基團被包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而反應(yīng)很慢甚至不反應(yīng)。

三、色譜與氨基酸的分析分離

1.色譜（chromatography）的發(fā)展史

最早的層析實驗是俄國植物學(xué)家Цвет在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬于吸附層析。40年代出現(xiàn)了分配層析，50年代出現(xiàn)了氣相色譜，60年代出現(xiàn)HPLC，80年代出現(xiàn)了超臨界層析，90年代出現(xiàn)的超微量HPLC可分離ng級的樣品。

2.色譜的分類：

按流動相可分為氣相、液相、超臨界色譜等；

按介質(zhì)可分為紙層析、薄層層析、柱層析等；

按分離機制可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析等

3.色譜的應(yīng)用

可用于分離、制備、純度鑒定等。

定性可通過保留值、內(nèi)標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法，定量一般用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

氨基酸的分析分離是測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。在分配層析和離子交換層析法開始應(yīng)用于氨基酸成分分析之后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究才取得了顯著的成就。現(xiàn)在這些方法已自動化。

氨基酸從強酸型離子交換柱的洗脫順序如下：

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg

第三節(jié)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)是生物大分子，具有明顯的結(jié)構(gòu)層次性，由低層到高層可分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。

一、肽鍵和肽

一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基縮水形成的共價鍵，稱為肽鍵。在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸借肽鍵連接起來，形成肽鏈。

最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。含有三、四、五個氨基酸的肽分別稱為三肽、四肽、五肽等。肽鏈中的氨基酸由于形成肽鍵時脫水，已不是完整的氨基酸，所以稱為殘基。肽的命名是根據(jù)組成肽的氨基酸殘基來確定的。一般從肽的氨基端開始，稱為某氨基酰某氨基酰...某氨基酸。肽的書寫也是從氨基端開始。

肽鍵象酰胺鍵一樣，由于鍵內(nèi)原子處于共振狀態(tài)而表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在肽鍵中C－N單鍵具有約40％雙鍵性質(zhì)，而C=O雙鍵具有40％單鍵性質(zhì)。這樣就產(chǎn)生兩個重要結(jié)果：（1）肽鍵的亞氨基在pH

0-14的范圍內(nèi)沒有明顯的解離和質(zhì)子化的傾向；（2）肽鍵中的C－N單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，使蛋白質(zhì)能折疊成各種三維構(gòu)象。

除了蛋白質(zhì)部分水解可以產(chǎn)生各種簡單的多肽以外，自然界中還有長短不等的小肽，它們具有特殊的生理功能。

動植物細(xì)胞中含有一種三肽，稱為谷胱甘肽，即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巰基，故常以GSH來表示。它在體內(nèi)的氧化還原過程中起重要作用。腦啡肽是天然止痛劑。肌肉中的鵝肌肽是一個二肽，即β-丙氨酰組氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩沖劑，緩沖肌肉產(chǎn)生的乳酸對pH的影響。一種抗菌素叫做短桿菌酪肽，由12種氨基酸組成，其中有幾種是D-氨基酸。這些天然肽中的非蛋白質(zhì)氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許多激素也是多肽，如催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽等。

二、肽的理化性質(zhì)

小肽的理化性質(zhì)與氨基酸類似。許多小肽已經(jīng)結(jié)晶。晶體的熔點很高，說明是離子晶體，在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的亞氨基不解離，所以肽的酸堿性取決于肽的末端氨基、羧基和側(cè)鏈上的基團。在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團主要是側(cè)鏈上的。肽中末端羧基的pK'比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK'則稍小。側(cè)鏈基團變化不大。

肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。肽的等電點也可以根據(jù)它的pK'值確定。

一般小肽的旋光度等于各個氨基酸旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質(zhì)的旋光度不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。

肽的化學(xué)性質(zhì)和氨基酸一樣，但有一些特殊的反應(yīng)，如雙縮脲反應(yīng)。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與CuSO4堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。利用這個反應(yīng)可以測定蛋白質(zhì)的含量。

三、一級結(jié)構(gòu)的測定

（一）一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-末端向C-末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符（－）隔開。

（二）測定步驟

測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的（純度大于97％）而且是已知分子量的蛋白質(zhì)。一般的測定步驟是：

1.通過末端分析確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成。

2.將每條肽鏈分開，并分離提純。

3肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。

4.肽鏈的另一部分樣品進行N末端和C末端的鑒定。

5.拆開肽鏈內(nèi)部的二硫鍵。

6.肽鏈用酶促或化學(xué)的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并將各個肽段分離出來。

7.測定每個肽段的氨基酸順序。

8.從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第五步不同。分離肽段并測序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)其重疊部分拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。

9.測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。

（三）常用方法

1.末端分析

（1）N末端

蛋白質(zhì)的末端氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質(zhì)（DNP-蛋白質(zhì)）。產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100℃高溫。水解時，肽鏈斷開，但DNP基并不脫落。DNP-氨基酸能溶于有機溶劑（如乙MI）中，這樣可與其他氨基酸和ε-DNP賴氨酸分開。再經(jīng)雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的DNP氨基酸。

丹磺酰氯法是更靈敏的方法。蛋白質(zhì)的末端氨基與5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應(yīng)，生成DNS-蛋白質(zhì)。DNS-氨基酸有強熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。

目前應(yīng)用最廣泛的是異硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產(chǎn)物可用氣-液色譜法進行鑒定。這個方法最大的優(yōu)點是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測定新生的N末端氨基酸。現(xiàn)在已經(jīng)有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含20個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結(jié)合使用。

N末端氨基酸也可用酶學(xué)方法即氨肽酶法測定。

（2）C末端

a)C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的α氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。

b)

另一個方法是肼解法。多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。

c)也可用羧肽酶法鑒定。將蛋白質(zhì)在pH,

30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。

2.二硫鍵的拆開和肽鏈的分離

一般情況下，蛋白質(zhì)分子中肽鏈的數(shù)目應(yīng)等于N末端氨基酸殘基的數(shù)目，可根據(jù)末端分析來確定一種蛋白質(zhì)由幾條肽鏈構(gòu)成。必須設(shè)法把這些肽鏈分離開來，然后測定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質(zhì)，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。

3.肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定。

在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2－4小時即可完成。

蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。

4.肽鏈的部分水解和肽段的分離

當(dāng)肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。這是測序工作的關(guān)鍵步驟。這一步通常用專一性很強的蛋白酶來完成。

最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護賴氨酸的側(cè)鏈氨基，或用1,2-環(huán)己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。

經(jīng)常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應(yīng)較慢。

用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镃末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經(jīng)常使用。

胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。

金葡菌蛋白酶，又稱谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵，但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸。

梭狀芽孢桿菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經(jīng)受6M尿素2小時。可用于水解不易溶解的蛋白。

凝血酶，水解Arg-Gly肽鍵。

羥胺可水解Asn-Gly，但Asn-Leu和Asn-Ala也能部分裂解。

以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。

多肽部分水解后，降解成長短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經(jīng)常用雙向?qū)游龌螂娪痉蛛x，再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。

5.多肽鏈中氨基酸順序的測定

從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化學(xué)法或酶法測序，然后比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此重疊的部分，確定每個肽段的適當(dāng)位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。

6.二硫鍵位置的確定

一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（pH2），此時二硫鍵穩(wěn)定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央，在進行第一次電泳，然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉(zhuǎn)90度后在相同條件下進行第二次電泳，多數(shù)肽段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負(fù)電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。

四、多肽合成

多肽的人工合成有兩種類型，一種是由不同氨基酸按照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合。控制合成的一個困難是進行接肽反應(yīng)所需的試劑，能同時和其他官能團反應(yīng)。因此在接肽以前必須首先將這些基團加以封閉或保護，肽鍵形成后再除去保護基。這樣每連接一個氨基酸殘基都要經(jīng)過幾個步驟，要得到較長的肽鏈就必須每步都有較高的產(chǎn)率。如果每一步反應(yīng)產(chǎn)率都是90%，那么30次反應(yīng)后總產(chǎn)率只有%。

保護基必須在接肽時起保護作用，在接肽后容易除去，又不引起肽鍵斷裂。最常用的氨基保護基Y是芐氧甲酰基，可用催化加氫或用金屬鈉在液氨中處理除去。其他還有三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀鹽酸或乙酸在室溫下除去。

羧基保護基Z通常用烷基，如乙基，可在室溫下皂化除去。如用芐基，可用催化加氫除去。

肽鍵不能自發(fā)形成，常用縮合劑促進肽鍵形成。接肽用的縮合劑最有效的是N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DC

CI)。DCCI從兩個氨基酸分子中奪取一分子水，自身變?yōu)椴蝗艿腘,N'-二環(huán)己基脲，從反應(yīng)液中沉淀出來，可過濾除去。接肽反應(yīng)除用縮合劑以外，還可用分別活化參加形成肽鍵的羧基和氨基的方法。羧基活化可用疊氮化物法和活化酯法（對硝基苯酯）等；氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽時加入有機堿，如三乙胺，保證氨基在自由狀態(tài)即可。

近年來固相多肽合成迅速發(fā)展。在固相合成中，肽鏈的逐步延長是在不溶的聚苯乙烯樹脂小圓珠上進行的。合成多肽的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應(yīng)，形成芐酯。第二個氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基保護后，以DCCI為縮合劑，接在第一個氨基酸的氨基上。重復(fù)這個方法，可使肽鏈按一定順序延長。最后把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽與樹脂分離，同時除去保護基。整個合成過程現(xiàn)在已經(jīng)可以在自動化固相多肽合成儀上進行。平均合成每個肽鍵只需三小時。此法可用于醫(yī)藥工業(yè)。人工合成的催產(chǎn)素沒有混雜的加壓素，比提取的天然藥品好。已經(jīng)成功合成含124個殘基的蛋白。

第四節(jié)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的多肽鏈并不是線形伸展的，而是按一定方式折疊盤繞成特有的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活性所必須的，包括二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。Primary

structure,secondary,tertiary,quaternarystructure

一、有關(guān)概念

1.構(gòu)型configration與構(gòu)象conformation

構(gòu)型指立體異構(gòu)體中取代原子或基團在空間的取向，構(gòu)型的改變必須通過共價鍵的斷裂。構(gòu)象是指這些取代基團當(dāng)單鍵旋轉(zhuǎn)時可能形成的不同的立體結(jié)構(gòu)，構(gòu)象的改變不涉及共價鍵的改變。

2.二面角

因為肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，所以肽鍵的四個原子和與之相連的兩個α碳原子共處一個平面，稱肽平面。肽平面內(nèi)的C=O與N－H呈反式排列，各原子間的鍵長和鍵角都是固定的。肽鏈可看作由一系列剛性的肽平面通過α碳原子連接起來的長鏈，主鏈的構(gòu)象就是由肽平面之間的角度決定的。主鏈上只有α碳原子連接的兩個鍵是單鍵，可自由旋轉(zhuǎn)。繞Cα－N1旋轉(zhuǎn)的角稱Φ，而繞Cα－C2旋轉(zhuǎn)的角稱Ψ。這兩個角稱為二面角。規(guī)定當(dāng)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的肽鏈成順式時為0度。取值范圍是正負(fù)180度，當(dāng)二面角都是180度時肽鏈完全伸展。由于空間位阻，實際的取值范圍是很有限的。

二、二級結(jié)構(gòu)

（一）二級結(jié)構(gòu)是肽鏈的空間走向

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指肽鏈主鏈的空間走向（折疊和盤繞方式），是有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。肽鏈主鏈具有重復(fù)結(jié)構(gòu)，其中氨基是氫鍵供體，羰基是氫鍵受體。通過形成鏈內(nèi)或鏈間氫鍵可以使肽鏈卷曲折疊形成各種二級結(jié)構(gòu)單元。復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，就由這些比較簡單的二級結(jié)構(gòu)單元進一步組合而成。

（二）肽鏈卷曲折疊形成四種二級結(jié)構(gòu)單元

1.α螺旋(α-helix)

α螺旋模型是Pauling和Corey等研究α-角蛋白時于1951年提出的。角蛋白是動物的不溶性纖維狀蛋白，是由動物的表皮衍生而來的。它包括皮膚的表皮以及毛發(fā)、鱗、羽、甲、蹄、角、絲等。角蛋白可分為兩類，一類是α角蛋白，胱氨酸含量豐富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高達(dá)22％；另一類是β角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量很高，蠶絲絲心蛋白就屬于這一類。α角蛋白，如頭發(fā)，暴露于濕熱環(huán)境中幾乎可以伸長一倍，冷卻干燥后又收縮到原來長度。β角蛋白則無此變化。

α角蛋白的X射線衍射圖案極其相似，沿長軸方向都有一個大周期結(jié)構(gòu)或重復(fù)單位，其長度為5－埃。Pauling等考慮到肽平面對多肽鏈構(gòu)象的限制作用，設(shè)計了多肽鏈折疊的各種可能模型，發(fā)現(xiàn)其中一種α螺旋模型能很好地說明α角蛋白的X射線衍射圖案中的5－埃重復(fù)單位。在這個模型中，每隔個氨基酸殘基螺旋上升一圈，相當(dāng)于向上平移埃。螺旋的直徑是11埃。螺旋上升時，每個氨基酸殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°，向上平移埃，比完全伸展的構(gòu)象壓縮倍。這與衍射圖案