ZEBKHIF-1a>P53在子宮內膜癌組織的表達及臨床意義【摘要】目的探討ZEBl、HIF-la.P53在子宮內膜癌組織的表達及臨床意義。方法采用免疫組化方法對子宮內膜癌組織、不典型增生子宮內膜組織以及正常子宮內膜組織的ZEB1、HIF-1a>P53表達進行檢測，結合臨床資料進行分析，并運用Spearman分析三者之間的相關性。結果ZEBl、HIF-la以及p53在子宮內膜癌組的陽性表達分別為66.2%、58.8%、52.9%,遠高于不典型增生組(18.2%>22.7%、13.6%)及對照組(3.6%、10.7%、0),差異有統計學意義(P<0.05)oZEB1陽性表達隨著臨床分期、組織學分級、肌層浸潤深度的增加，其陽性表達率也增加,差異均有統計學意義(P<0.05)oHIF-1a和P53陽性表達率隨癌組織病理分級的增高而升高(P<0.05),和臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移無關(P〉0.05)o結論ZEB1、HIF-la>P53在子宮內膜癌組織均呈高表達，而且其相互之間均存在著正相關，說明其可能協同參與了子宮內膜癌的發生發展過程。【關鍵詞】子宮內膜癌；鋅指E盒結合蛋白；缺氧誘導因子-1；P53ExpressionandclinicalsignificanceofZEB1,HIF-1aandP53inendometrialcarcinoma[Abstract]ObjectiveToexploreexpressionandclinicalsignificanceofZEB1,HIF-1andP53inendometrialcarcinoma.MethodsTheexpressionsofZEB1,HIF-1aandP53inendometrialtissues,atypicalhyperplasiaendometrialtissuesandnormalendometrialtissuesweredetectedbyimmunohistochemical,combinedwithclinicaldataanalysis.SpearmananalysiswasusedtoanalyzethecorrelationbetweenZEB1,HIF-1aandP53.ResultsThepositiveexpressionofZEB1,HIF-1aandp53inendometrialcarcinomawere66.2%,58.8%and52.9%,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseinatypicalhyperplasiagroup(18.2%,22.7%,13.6%)andcontrolgroup(3.6%,10.7%,0),withstatisticallysignificantdifference(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofZEB1wasincreasedwiththeclinicalstage,histologicalgradeanddepthofmyometrialinvasion,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofHIF-1andP53increasedwiththeincreaseofpathologicalgrade(P<0.05),whilewasnotassociatedwithclinicalstage,myometrialinvasiondepthandlymphnodemetastasis(P>0.05).ConclusionTherewasapositivecorrelationbetweenZEB1,HIF-1a,P53,whichwerehighlyexpressedinendometrialcarcinoma.Thisindicatedthattheymightbeinvolvedinthedevelopmentofendometrialcarcinoma.[Keywords]Endometrialcancer;ZEB1;H1F-1a;P531前言子宮內膜癌(Endometrialcancer)是發生于內膜上皮組織的一種惡性腫瘤。它是全世界婦女中第七大常見的婦科癌癥，每年新增290,000例病例，約75,000例患者死亡⑴。與其他惡性腫瘤一樣，惡性轉化、侵襲和轉移是正常子宮內膜組織變為子宮內膜癌的三大表型改變。鋅指E盒結合蛋白(ZincfingerE-box-bindingprotein,ZEB1)是近年來發現與腫瘤侵襲、轉移關系密切的蛋白⑵。缺氧誘導因子-1(Hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1)在腫瘤缺氧微環境下能夠調控微血管的生成，進而促進腫瘤的浸潤轉移⑶。有研究表明腫瘤的缺氧環境還能使一些抑癌基因，如P53缺失或突變，進而導致HIF-la活性增強及表達上調，活化的HIF-1。通過激活VEGF,促進腫瘤血管生成及腫瘤的轉移圖。雖然ZEB1、HIF-1a、P53均與惡性腫瘤的生長和轉移密切相關，但其在子宮內膜癌中的研究少見報道。本研究采用免疫組化方法檢測子宮內膜癌組織中ZEB1、HIF-la、P53的表達，旨在探討它們在子宮內膜癌發生發展中的意義及相互之間的關系，為進一步開展子宮內膜癌的靶向治療提供實驗依據。2資料與方法2.1一般資料收集我院病理科2009年6月至2013年10月存檔的石蠟包塊子宮內膜癌標本68例(其中腺癌62例；特殊類型癌6例，由于病例過少，故不計入統計)，年齡34-67歲之間，平均年齡(49.7±5.8)歲。選取同期手術切除或門診刮宮獲得的不典型增生子宮內膜標本22例，年齡24.56歲之間，平均年齡(42.3±6.2)歲。另選取同期因子宮肌瘤行子宮切除術的正常子宮內膜28例作為對照組，年齡28-64歲之間，平均年齡(44.2±4.7)歲。所有病例術前均經病理確診，均未行放療、化療及激素治療。子宮內膜癌細胞分化程度根據國際婦產科聯盟(FIGO)分級標準,分為G1：24例，G2：26例，G3：18例。根據FIGO(2009)分級標準，其手術-病理分期為，［?II期52例，m-W期16例。子宮肌層浸潤深度N1/2肌層的有21例，肌層浸潤深度V1/2肌層的有47例；有淋巴結轉移者6例，無淋巴轉移病例62例。2.2試劑和方法鼠抗人ZEB1、P53以及HIF-la單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物公司，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物科技公司。實驗采用免疫組化SP法，石蠟切片常規脫蠟，梯度乙醇脫水，高溫高壓抗原修復，室溫靜置并沖洗后，然后按SP試劑盒操作說明書進行操作，最后進行DAB顯色、蘇木素復染，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片為陽性對照組，以PBS代替一抗作陰性對照。3結果判定由經驗豐富的病理科醫師進行雙盲閱片。ZEB1、HIF-la以及P53表達水平得分評定采用目前國際上常用的半定量工IHC評分法⑸，以淡黃色或棕黃色顆粒出現在細胞核中為陽性表達。所有標本均在光學顯微鏡下觀察，計算陽性細胞百分率的方法為先在低倍鏡下尋找最強著色區，然后取5個高倍鏡視野（X400）,計數100個細胞，計算陽性細胞百分比。根據陽性細胞百分比將染色結果分為4個等級：陽性細胞W10%為陰性?50%為弱陽性（+）;50%~75%為陽性（++）,75%為強陽性（+++）。根據著色強度記分：弱,1分；中，2分;強，3分。最后根據著色強度與陽性細胞百分比的乘積判定結果：1分（-）；2-3分（+）；4?5分（++）；6?7分（+++）o4統計學分析采用SPSS21.0軟件包對上述所得實驗數據進行統計分析。計量資料采用均數土標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或非參數檢驗秩次分析；多組間比較采用單因素方差分析或非參數Kruskal-wallis檢驗。計數資料采用x2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，P<0.05為差異具有統計學意義。3結果ZEB1、HIF.la以及P53在正常子宮內膜、子宮內膜不典型增生和子宮內膜癌的表達ZEB1主要表達于間質組織細胞核中，呈棕色或棕褐色，極少數表達于細胞質。ZEB1在子宮內膜癌組的陽性表達（66.2%）遠高于對照組（3.6%）和不典型增生組（18.2%）,差異有明顯統計學意義（P值均小于0.01）,三組比較也有顯著性差異（P值小于0.01）。HIF-1a陽性染色主要位于子宮內膜腺上皮細胞胞核,呈棕黃色或棕褐色，在三種內膜組織的陽性表達分別為10.7%、22.7%、58.8%,三組比較有顯著性差異（P值小于0?01）,HIF-1a在在子宮內膜癌中的表達高于子宮內膜不典型增生及正常子宮內膜組織（P值均小于0.01）oP53陽性表達細胞呈棕黃色顆粒主要分布于細胞核，正常內膜組織中未見p53陽性染色，在三組內膜組織陽性表達率分別為0、13.6%、52.9%,三組比較有顯著性差異（P值小于0.01）,p53在在子宮內膜癌中的表達高于子宮內膜不典型增生及正常子宮內膜組織（P值均小于0.01）。具體結果見表1。表1ZEB1、HIF-la以及P53在不同注重的陽性表達

分組nZEB1HIF-1ap53陽性(+)陽性率(％)陽性(+)陽性率(%)陽性(+)陽性率(%)對照組2813.60%**310.70%**00**不典型增生組22418.20蜻522.70%耶313.60%##子宮內膜癌組684566.20%4058.80%3652.90%注：**表示對照組和子宮內膜癌組比較，P<0.01;##表示不典型增生組和子宮內膜癌組比較，P<0.01o2子宮內膜癌中ZEB1、HIF-la>P53表達與臨床參數間的關系ZEB1陽性表達和臨床分期、組織學分級、肌層浸潤深度有關，隨著臨床分期、組織學分級、肌層浸潤深度的增加，其陽性表達率也增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，和淋巴結轉是否轉移無關是〉0.05)°HIF；a和P53陽性表達率與癌組織病理分化程度有關(P<0.01),且隨癌組織病理分級的增高而升高(P<0.05),和臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移無關(P>0.05)o表2ZEB1、HIF-la、P53表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系組別nZEB1P值HIF-1aP值P53P值+—+—+—臨床分期I-II542034P<0.052628P>0.052430P>0.05III-IV141049568分化程度高分化22616614517中分化251114P<0.051510P<0.051312P<0.05低分化21174138147肌層浸潤深度<1/24523222025P>0.051926P>0.0521/223203P<0.011491310淋巴結轉移有660P>0.0551P>0.0560P>0.05無624121323034283.3子宮內膜癌中ZEB1表達與HIF-1Q表達及P53表達之間的關系Spearman等級相關分析顯示，在子宮內膜癌中ZEB1表達與HIF-1a及P53表達均呈正相關，r值分別為0.573、0.614,P<0.05oHIF-la和P53表達也呈正相關，r值為0.671,P<0.05o4討論ZEB1是ZEB家族的重要成員之一，作為轉錄抑制因子貫穿于胚胎發育全過程，在轉錄和翻譯程序上對基因表達過程進行調控。和ZEB家族其他成員一樣，ZEB1能夠誘導上皮間質轉化(EMT)過程，使上皮細胞功能短暫或可逆地喪失變為具有轉移和侵襲能力的間質細胞,而且腫瘤細胞游走轉移能力和ZEBlmRNA的含量成正比⑹。HIF-1a是一種以異源二聚體形式存在的核轉錄因子，對氧的依賴性較強，僅存在于缺氧細胞核中。HIF-la參與調節缺氧反應基因產物的合成，調控細胞能量代謝以及腫瘤血管生成，與腫瘤生長浸潤轉移密切相關。P53是目前研究最多的抑癌基因，其控制著細胞周期的啟動，與細胞凋亡、DNA修復、基因轉錄調控等多種細胞內過程有關。P53一旦缺失或突變，就會失去對細胞生長、凋亡和DNA修復的調控作用，轉變為癌基因，促進腫瘤形成。有資料顯示⑺，人類60%腫瘤存在p53基因突變，而且其作用過程與腫瘤的分化程度及浸潤深度和轉移有關，可作為判斷腫瘤預后的獨立指標。因此，ZEB1、HIF-la.P53均參與了多數惡性腫瘤浸潤轉移的過程，但是其在子宮內膜癌中的研究報道較少，而且三者之間在腫瘤發生發展過程中的關系尚不明確。本研究通過疫組織化學的方法，對68例子宮內膜癌組織、22例不典型增生子宮內膜以及28例正常子宮內膜組織進行ZEB1、HIF-la、P53蛋白表達的檢測，發現ZEB1、HIF-1a、P53均陽性表達于腫瘤組織的細胞核，說明其作用的發揮主要發生在轉錄或或轉錄前水平。三種因子在正常內膜組織的陽性表達均比較低，遠低于不典型增生組織和子宮內膜癌組織(P<0.01),而且三種因子在不典型增生組織和子宮內膜癌組織中的陽性表達也有顯著統計學差異(P<0.01),提示我們ZEB1、HIF-1Q、P53參與了子宮內膜癌的發生發展過程，參與了腫瘤由良性向惡性的轉化，這與其他學者研究結果一致⑻力ZEB1在子宮內膜癌組織中高表達，這與ZEB1的生物學特征及其通過調控上皮間質轉化(EMT)過程密切相關。眾多研究表明，核轉錄因子ZEB1的上調過程與E-cad的轉錄阻遏過程有關，其主要是通過與E-cadherin基因的啟動子序列E2盒結合，抑制E-cad的轉錄來誘導細胞上皮間質轉化的過程，進而使細胞獲得轉移侵襲能力口叫而且這種過程在胃癌31、乳腺癌"I、大腸癌”3］等惡性腫瘤研究中也得到了證實。在常氧條件下，HIF-1a表達量很少，細胞中幾乎檢測不到HIF-1a蛋白，但是在腫瘤缺氧微環境下，其表達增高，與缺氧反應元件結合，促進缺氧反應基因轉錄，參與腫瘤細胞代謝、新血管生成及腫瘤轉移等過程〔⑷。有學者利用免疫組化技術對19種腫瘤進行研究，結果發現在13種腫瘤組織中HIF-la均有不同程度的陽性表達，其中在結腸癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中HIF-lci過表達達到90%以上，而在相應正常組織及一些良性病變中均無表達或極少量表達，提示HIF-la參與了多數惡性腫瘤的發展過程〔⑸。p53突變可發生于人類60%惡性腫瘤中，其突變后細胞周期停滯，細胞進入異常增殖狀態，導致惡性腫瘤的發生。總之，ZEB1、HIF-la.P53在正常組織細胞中不表達或很少表達，而在惡性腫瘤中呈高表達，說明他們參與了惡性腫瘤的發生發展過程。本研究還中我們還發現，ZEB1、HIF-1Q、P53在子宮內膜癌組織的表達和腫瘤組織的分化程度有關，隨著分化程度的降低而表達增高，提示我們ZEB1、HIF-la.P53蛋白和子宮內膜腺癌的發生和進展具有相關性，其表達越高，腫瘤分化程度越低，其惡性程度越高,預后愈差，這和石琦⑺等人研究結果一致。不過也有人的研究與我們的結果不一致。黃玉秀等［⑻研究結果顯示，雖然HIF-la蛋白隨著肌層浸潤深度、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期增加而陽性表達率增加，但是差異均無統計學意義，AcsG的研究也顯示了類似的結果“叫這可能和樣本量不同及個體表達差異有關。止匕外，我們的研究還顯示ZEB1表達變化還和臨床分期及肌層浸潤程度有關，隨著臨床分期和肌層浸潤深度的增加而表達升高，提示ZEB1用來作為判斷患者病情發展和預后的重要參考指標也具有重要應用價值。最后，本研究還通過spearman等級分析對ZEB1、HIF-l。、P53在子宮內膜癌組織表達的關系進行了初步探討，結果顯示在ZEB1表達與HIF-1Q及P53表達均呈正相關，r值分別為0.573、0.614oHIF-la和P53表達也呈正相關，r值為0.671。其中HIF?1Q和P53表達的正相關關系已經得到了其他研究的證實。有研究表明在P53缺失或突變的腫瘤細胞內，存在著HIF-1Q明顯蓄積〔2叫p53功能失活導致HIF-a表達增加，進而促進腫瘤組織新生血管的生成。缺氧情況下，去磷酸化的HIF-1Q能對野生型p53蛋白的降解起抑制作用，提高野生型P53蛋白的穩定性，介導P53蛋白依賴的凋亡，而對突變型HIF-la無作用⑵】。近年來，關于ZEB1和P53之間作用關系的研究也有了初步進展。WuCW等也研究報道P53的失活可能影響miR-200a,導致ZEB1/ZEB2上調，啟動EMT過程。然而PeixinDong的研究則發現功能獲得性P53基因變異蛋白作為轉錄因子能夠直接結合微小RNA-130b的啟動子序列，進而抑制微小RNA-130b的表達，從而上調微小RNA-130b的靶向基因ZEB1的表達，因此認為功能獲得性p53基因變異■微小RNA-130b-ZEBl分子信號傳導路徑的激活能夠促進子宮內膜癌轉移和進展(/publication/272792475)。本研究中我們還發現ZEB1和HIF-1a表達存在著正相關，但是目前還沒有關于ZEB1和HIF-1a之間作用的報道，我們的研究也只是對其相關關系做了初步研究，其具體關系還需要后續實驗進行進一步驗證。參考文獻JohnsonN,BryantA,MilesT,etal.Adjuvantchemotherapyforendometrialcancerafterhysterectomy[J].CochraneDatabaseSystRev,201l,(10):CD003175.DOI:10.1002/14651858.CD003175.pub2.ZhangP,SunY,MaL.ZEB1:atthecrossroadsofepithelial-mesenchymaltransition,metastasisandtherapyresistance^].CellCycle,2015,14(4):481-487.DOI:10.1080/15384101.2015.1006048.PiresIM,BloklandNJ,BroosAW,etal.HIF-1a-independenthypoxia-inducedrapidPTK6stabilizationisassociatedwithincreasedmotilityandinvasion[J].CancerBiolTher,2014,15(10):1350-1357.DOI:10.4161/cbt.29822.FangJ,XiaC,CaoZ,etal.ApigenininhibitsVEGFandHIF-1expressionviaPI3K/AKT/p70S6K1andHDM2/p53pathways[J].FASEBJ,2005,19(3):342-353.DOI:10.1096/fj.04-2175com.ZagzagD,ZhongH,ScalzittiJM,etal.Expressionofhypoxia-induciblefactor1alphainbraintumors:associationwithangiogenesis,invasion,andprogression[J].Cancer,2000,88(11):2606-2618.[6]宋永站，張尤歷，烏慧玲，等.zebl基因與腫瘤細胞遷移能力的關系[J].世界華人消化雜志,2010,(11):1099-1103.[7]申鈞.HIF/a和p53在腎透明細胞癌中的表達及其與預后的相關性研究.(05),2010.SinghM,SpoelstraNS,JeanA,etaLZEB1expressionintypeIvstypeIIendometrialcancers:amarkerofaggressivedisease[J].ModPathol,2008,21(7):912-923.DOI:10.1038/modpathol.2008.82.BirnerP,SchindlM,ObermairA,etal.Overexpressionofhypoxia-induciblefactor1alphaisamarkerforanunfavorableprognosisinearly-stageinvasivecervicalcancerfJ].CancerRes,2000,60(17):4693-4696.VandewalleC,VanRoyF,BerxG.TheroleoftheZEBfamilyoftranscriptionfactorsindevelopmentanddiseasefJ].CellMolLifeSci,2009,66(5):773-787.DOI:10.1007/s00018-008-8465-8.QinY,TangB,HuCJ,etal.AnhTERT/ZEB1complexdirectlyregulatesE-cadherintopromoteepithelial-to-mesenchymaltransition(EMT)incolorectalcancerfJ].Oncotarget,2016,7(1):351-361.DOI:10.18632/oncotarget.5968.HashiguchiM,UenoS,SakodaM,etal.ClinicalimplicationofZEB-1andE-cadherin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