第十三章流式細胞術第十三章流式細胞術1流式熒光免疫技術：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確地對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和純化（對特定群體加以分選）的現代細胞分析技術。流式細胞儀（flowcytometry，FCM）：集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。流式熒光免疫技術：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確2流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，單個細胞，測量快速、大量、多參數、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結3

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。第一節概述流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是4細菌學檢驗13流式細胞技術課件5細胞組成（結構）細胞功能大小、粒度細胞表面/胞漿/核--特異性抗原表面面積、核漿比例細胞活性DNA含量與細胞周期胞內細胞因子RNA、蛋白質含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性、細胞受體流式細胞儀常檢測的細胞特性細胞組成（結構）細胞功能大小、粒度細胞表面/胞漿/核--特異6（1）液流系統（2）光學系統（3）電子數據處理系統（4）分選系統一、流式細胞儀的基本結構（1）液流系統一、流式細胞儀的基本結構7由樣本和鞘液組成。待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流。鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統：流動室、液流驅動系統由樣本和鞘液組成。（1）液流系統：流動室、液流驅動系統8噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統（流動室、液流驅動系統）示意圖進樣孔熒光信號激光束流動室噴嘴FluorescencesignalsFocusedl9FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管10液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱11激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射較長波長的光，通過較短波長的光光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統：激光光源、光收集系統激光光源：氣冷式氬離子激光器（2）光學系統：激光光源、光收集12FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統示意圖FlowLaserSSandFLFSDetector光13激光光源單波長、高強度、高穩定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2~4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多檢測13個熒光參數激光光源單波長、高強度、高穩定性14細菌學檢驗13流式細胞技術課件15LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統：濾光片LongpassShort16

光收集系統：光電倍增管（PMT）光收集系統：光電倍增管（PMT）17FACSCalibur

光路圖FACSCalibur光路圖18主要由計算機及其軟件組成（3）電子數據處理系統主要由計算機及其軟件組成（3）電子數據處理系統19FACSCalibur特點：光路調節系統固定自動化程度高操作簡便使用壽命長配備1-2根激光細胞分選速度慢，主要用于細胞分析臨床型（臺式機）FACSCalibur特點：臨床型（臺式機）20BDLSRBDLSR21FACSVantageDiVa科研型（大型機）特點：多數字化適用用各類細胞分選4路分選FACSVantageDiVa科研型（大型機）特點：22FACSAria科研型特點：分辨率高選配多種波長和類型激光器可把感興趣細胞分選到特定培養孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析FACSAria科研型特點：23配有分選裝置，分選帶有某種特性的細胞（4）分選系統配有分選裝置，分選帶有某種特性的細胞（4）分選系統24采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。第二節工作原理采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；第二25（一）基本工作原理（一）基本工作原理26單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統和散射光感受系統收集光信號熒光染料被激發發光光電倍增管脈沖信號計算機系統分析結果放大垂直相交形成穩態水平激光與之基本過程單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系27區別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統計計算機，>5000人工，200結果多參數，綜合分析簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區別區別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細28細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。（二）散射光的測定細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角29細菌學檢驗13流式細胞技術課件30

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。 前向散射光（forwardscatter,FS）：激光31FALSSensorLaser前向散射光示意圖FALSSensorLaser前向散射光示意圖32

側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。 側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射33FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser側向散34 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-S35熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器（三）熒光測量熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的36熒光染料的特性激發波長(EXCITING)發射波長(EMISSION)熒光染料的特性激發波長(EXCITING)37細菌學檢驗13流式細胞技術課件38光譜交叉Emissionwavelength(nm)

530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection兩色以上熒光分析存在光譜交叉光譜交叉Emissionwavelength(nm)539熒光補償熒光補償40熒光補償方法所有補償調為“0”調節電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調節熒光補償熒光補償方法所有補償調為“0”41通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。（四）細胞分選原理通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征42細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含特定細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電1、分選基本原理細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含特定細胞43細胞分選系統細胞分選系統44分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。2、分選的技術要求分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比45參數：FS,SS,FL數據顯示方式（單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖）設門分析技術第三節數據顯示方式參數：FS,SS,FL第三節數據顯示方式46FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少（一）參數FS：反映顆粒的大小（一）參數47單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置（二）數據顯示方式單參數直方圖直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置（48由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。1、單參數直方圖由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，49單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數”表示，可以與光強度之間線性關系或對數關系Y軸：代表該通道內所出現具有相同光信號特征性細胞的頻率單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)X軸：代表熒50雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。2、雙參數直方圖雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根512.1雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度便于數據統計不同的細胞群可以用不同的顏色標記主要表達方式2.1雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度便于數據統計52雙參數直方圖點圖雙參數直方圖點圖532.2二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數愈多。等高線越密集則表示細胞數變化率越大。2.2二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參54二維等高圖二維等高圖552.3假三維等高圖2.3假三維等高圖563、三參數直方圖3、三參數直方圖57多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。4、流式細胞儀的多參數分析多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒58Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。（三）設門分析技術Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞59A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門A淋巴細胞A、B、C均為任意門60線性門線性門61Region設置:

區閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關的概念，區閾可與門對應，但是也可以包含于門。Region設置:62D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區域構成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1CD4+/CD3-如十字門分析時，起就可以由四個區域構63樣本制備標記染色液相芯片技術質量控制第四節流式熒光免疫分析的技術要點

樣本制備第四節流式熒光免疫分析的技術要點64外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網過濾單細胞懸液（一）免疫檢測樣品制備外周血淋巴細胞樣品的制備單細胞懸液（一）免疫檢測樣品制備65新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）新鮮實體組織單細胞懸液的制備66適用條件:有較高的量子產額和消光系數對488nm的激發光波長有較強的吸收發射光波長與激發光波長間有較大的波長差易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性（二）常用的熒光染料與標記染色適用條件:（二）常用的熒光染料與標記染色67FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類1、幾種常見的熒光染料FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL168名稱染料激發波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料名稱染料激發波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素69 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm激發光照射下，通過一個熒光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在4870PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制PECY5CY5CY5488nm575nm670nm花青苷571熒光染料與細胞成分的四種結合方式

結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法

直標:干擾少,但需購買多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記2、免疫熒光標記熒光染料與細胞成分的四種結合方式2、免疫熒光標記72免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經激光照射后不同待測特產生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。（三）免疫膠乳顆粒技術的應用免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上73微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在74細菌學檢驗13流式細胞技術課件75通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量分析通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量76適當的制備方式處理紅細胞實體組織來源標本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2（四）流式細胞免疫學技術的質量控制1、單細胞懸液制備的質控適當的制備方式（四）流式細胞免疫學技術的質量控制1、單細胞懸77溫度pH染料濃度固定劑2、免疫熒光染色的質控溫度2、免疫熒光染色的質控78光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準:保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態。絕對計數校準:保證計數的準確性。Flow-checkFlow-setFlow-count3、儀器操作的質控光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態，減少變異79同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調整和設置電壓，以保證特異性。全程質量控制：與待測標本一起標記和檢測，結果達靶值，提示本次實驗結果可靠。4、免疫檢測的質控同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單80流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。第五節在免疫學檢驗中的應用與評價流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐81T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產生IgM型自身抗體,參與免疫調節、與自身免疫病的發生有關

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)（一）淋巴細胞及其亞群的分析T淋巴細胞及其亞群分析（一）淋巴細胞及其亞群的分析82細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內細胞因子測定（二）淋巴細胞功能分析（三）淋巴造血系統及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)（二）淋巴細胞功能83CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對化療藥物耐藥（四）腫瘤耐藥基因分析（五）AIDS病檢測中的應用CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示對84HLA-B27可出現在58%～97%的強直性脊椎炎(As)患者 （六）自身免疫病相關HLA抗原分析HLA-B27可出現在58%～97%的強直性脊椎炎(As)85

FCM作為一個強大的技術平臺，已應用于多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越廣泛。目前移植免疫中的FCM應用主要包括流式細胞術的交叉配型（Flowcytometrycross-matching,FCXM）和群體反應性抗體（Panelreactiveantibody,PRA）檢測。（七）移植免疫中的應用（七）移植免疫中的應用86小結流式細胞術（FCM）是在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態下，從分子水平上獲取多種信號實現對單個細胞進行定量分析或純化分選。FCM分析中前向散射光反映顆粒的大小；側向散射光反映顆粒內部結構復雜程度、表面的光滑程度；熒光反映顆粒被染上熒光部分數量的多少，根據其標記的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表達情況。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照，可使熒光標記單抗的信號保持其特異性。對各項工作環節和儀器性能進行嚴格的質量控制和規范化操作，是保證FCM分析中各項檢測數據和指標可靠性的關鍵。小結流式細胞術（FCM）是在保持細胞及細胞器或微粒的結構87思考題流式細胞儀的分析檢測原理是什么？流式細胞儀分析中前向散射光、側向散射光和熒光的檢測意義。何謂熒光補償？何謂“液相芯片”技術？細胞分選的基本原理。FCM分析中有哪些數據顯示方式，如何解讀結果及其設門分析的意義？如何進行FCM分析檢測樣品的制備？流式細胞分析前如何驗證儀器工作狀態，采用何種校正物？流式細胞免疫分析的質量控制包括哪些方面？流式細胞術有哪些臨床應用價值？流式細胞儀分析中常見的熒光素有那些？他們的特性如何？思考題流式細胞儀的分析檢測原理是什么？88第十三章流式細胞術第十三章流式細胞術89流式熒光免疫技術：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確地對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和純化（對特定群體加以分選）的現代細胞分析技術。流式細胞儀（flowcytometry，FCM）：集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。流式熒光免疫技術：是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確90流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，單個細胞，測量快速、大量、多參數、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結91

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。第一節概述流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是92細菌學檢驗13流式細胞技術課件93細胞組成（結構）細胞功能大小、粒度細胞表面/胞漿/核--特異性抗原表面面積、核漿比例細胞活性DNA含量與細胞周期胞內細胞因子RNA、蛋白質含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性、細胞受體流式細胞儀常檢測的細胞特性細胞組成（結構）細胞功能大小、粒度細胞表面/胞漿/核--特異94（1）液流系統（2）光學系統（3）電子數據處理系統（4）分選系統一、流式細胞儀的基本結構（1）液流系統一、流式細胞儀的基本結構95由樣本和鞘液組成。待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流。鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統：流動室、液流驅動系統由樣本和鞘液組成。（1）液流系統：流動室、液流驅動系統96噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統（流動室、液流驅動系統）示意圖進樣孔熒光信號激光束流動室噴嘴FluorescencesignalsFocusedl97FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管98液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱99激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射較長波長的光，通過較短波長的光光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統：激光光源、光收集系統激光光源：氣冷式氬離子激光器（2）光學系統：激光光源、光收集100FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統示意圖FlowLaserSSandFLFSDetector光101激光光源單波長、高強度、高穩定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2~4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多檢測13個熒光參數激光光源單波長、高強度、高穩定性102細菌學檢驗13流式細胞技術課件103LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統：濾光片LongpassShort104

光收集系統：光電倍增管（PMT）光收集系統：光電倍增管（PMT）105FACSCalibur

光路圖FACSCalibur光路圖106主要由計算機及其軟件組成（3）電子數據處理系統主要由計算機及其軟件組成（3）電子數據處理系統107FACSCalibur特點：光路調節系統固定自動化程度高操作簡便使用壽命長配備1-2根激光細胞分選速度慢，主要用于細胞分析臨床型（臺式機）FACSCalibur特點：臨床型（臺式機）108BDLSRBDLSR109FACSVantageDiVa科研型（大型機）特點：多數字化適用用各類細胞分選4路分選FACSVantageDiVa科研型（大型機）特點：110FACSAria科研型特點：分辨率高選配多種波長和類型激光器可把感興趣細胞分選到特定培養孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析FACSAria科研型特點：111配有分選裝置，分選帶有某種特性的細胞（4）分選系統配有分選裝置，分選帶有某種特性的細胞（4）分選系統112采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。第二節工作原理采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；第二113（一）基本工作原理（一）基本工作原理114單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統和散射光感受系統收集光信號熒光染料被激發發光光電倍增管脈沖信號計算機系統分析結果放大垂直相交形成穩態水平激光與之基本過程單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系115區別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統計計算機，>5000人工，200結果多參數，綜合分析簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區別區別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細116細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。（二）散射光的測定細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角117細菌學檢驗13流式細胞技術課件118

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。 前向散射光（forwardscatter,FS）：激光119FALSSensorLaser前向散射光示意圖FALSSensorLaser前向散射光示意圖120

側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。 側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射121FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser側向散122 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-S123熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器（三）熒光測量熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的124熒光染料的特性激發波長(EXCITING)發射波長(EMISSION)熒光染料的特性激發波長(EXCITING)125細菌學檢驗13流式細胞技術課件126光譜交叉Emissionwavelength(nm)

530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection兩色以上熒光分析存在光譜交叉光譜交叉Emissionwavelength(nm)5127熒光補償熒光補償128熒光補償方法所有補償調為“0”調節電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調節熒光補償熒光補償方法所有補償調為“0”129通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。（四）細胞分選原理通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征130細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含特定細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電1、分選基本原理細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含特定細胞131細胞分選系統細胞分選系統132分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。2、分選的技術要求分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比133參數：FS,SS,FL數據顯示方式（單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖）設門分析技術第三節數據顯示方式參數：FS,SS,FL第三節數據顯示方式134FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少（一）參數FS：反映顆粒的大小（一）參數135單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置（二）數據顯示方式單參數直方圖直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置（136由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。1、單參數直方圖由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，137單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數”表示，可以與光強度之間線性關系或對數關系Y軸：代表該通道內所出現具有相同光信號特征性細胞的頻率單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)X軸：代表熒138雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。2、雙參數直方圖雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根1392.1雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度便于數據統計不同的細胞群可以用不同的顏色標記主要表達方式2.1雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度便于數據統計140雙參數直方圖點圖雙參數直方圖點圖1412.2二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數愈多。等高線越密集則表示細胞數變化率越大。2.2二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參142二維等高圖二維等高圖1432.3假三維等高圖2.3假三維等高圖1443、三參數直方圖3、三參數直方圖145多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。4、流式細胞儀的多參數分析多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒146Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。（三）設門分析技術Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞147A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門A淋巴細胞A、B、C均為任意門148線性門線性門149Region設置:

區閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關的概念，區閾可與門對應，但是也可以包含于門。Region設置:150D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區域構成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1CD4+/CD3-如十字門分析時，起就可以由四個區域構151樣本制備標記染色液相芯片技術質量控制第四節流式熒光免疫分析的技術要點

樣本制備第四節流式熒光免疫分析的技術要點152外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網過濾單細胞懸液（一）免疫檢測樣品制備外周血淋巴細胞樣品的制備單細胞懸液（一）免疫檢測樣品制備153新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）新鮮實體組織單細胞懸液的制備154適用條件:有較高的量子產額和消光系數對488nm的激發光波長有較強的吸收發射光波長與激發光波長間有較大的波長差易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性（二）常用的熒光染料與標記染色適用條件:（二）常用的熒光染料與標記染色155FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類1、幾種常見的熒光染料FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1156名稱染料激發波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料名稱染料激發波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素157 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm激發光照射下，通過一個熒光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在48158PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制PECY5CY5CY5488nm575nm670nm花青苷5159熒光染料與細胞成分的四種結合方式

結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法

直標:干擾少,但需購買多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記2、免疫熒光標記熒光染料與細胞成分的四種結合方式2、免疫熒光標記160免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經激光照射后不同待測特產生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。（三）免疫膠乳顆粒技術的應用免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上161微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在162細菌學檢驗13流式細胞技術課件163通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量分析通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定