一、培養細胞的形態觀察體外培養的細胞主要有兩種狀態。一種是能貼附在培養支持物上的細胞，如HeLa細胞、NH3T3等，叫貼壁型細胞，體外培養的細胞絕大多數都屬于這種細胞。另一種細胞并不貼附在容器的壁上，而是懸浮在培養液中生長，如HL—60，叫做懸浮型細胞，這類細胞主要是血液原性或癌原性的細胞。1貼壁(粘附)型細胞

粘附:是大多數有機體細胞在體內

生存和生長發育的基本存在方式基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，

有機體的絕大多數細胞必須

粘附于一固相表面

才能生存和生長。

2培養時：這些細胞被放到體外環境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而

屬于粘附型細胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞3

類型

細胞在體內、外的粘附方式：存在差異

體內：粘附是全方位

外形具有復雜的立體特征

體外：多數情況，細胞只有一個附著平面

外形一般與體內時明顯不同按照培養細胞的主要形態，可分為幾大類型

4分類

根據形態大致的不同，主要2類：

上皮樣成纖維細胞樣

其它，不定型5上皮樣細胞型

名稱：僅形態上似體內，實際上不完全等于--來源：來源于外胚層，內胚層細胞如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態：類似體內的上皮細胞

扁平，不規則多角形，中有圓形核6生長特點

易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時呈膜狀移動很少脫離細胞群而單個活動

7成纖維細胞樣細胞

名稱：凡在培養中形態與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮形態：似體內成纖維細胞的形態

胞體梭形或不規則三角形胞質向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核8生長特點

排列成放射狀，漩渦狀

并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而

單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，

常有幾個伸長的細胞突起

9培養細胞形態不穩定

血清

Hela高血清低血清

成纖維細胞樣上皮樣細胞

pH

Hela太酸或太堿標準pH

成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細胞樣上皮樣細胞

生長狀態改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉化與否未轉化轉化后

成纖維樣可成上皮樣10懸浮生長型

概念培養時不貼附于底物而呈懸浮狀態生長或以機械方法使保持懸浮狀態下生長來源自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞也可能特點在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團11優點

生存空間大，提供數量大傳代方便(不需消化)

易于收獲可獲得穩定狀態缺點觀察不方便很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)

12貼壁細胞在生長狀態良好時，細胞內顆粒少，看不到有空泡，細胞邊緣清楚，培養基內看不到懸浮的細胞和碎片，培養液清澈透明，而當細胞內顆粒較多，透明差，空泡多時，表明生長較差。當瓶內培養基混濁時，應想到細菌真菌污染的可能。懸浮細胞當邊緣清楚，透明發亮時，生長較好；反之，則較差或已死亡。由于培養基內有pH指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細胞的生長狀態。呈橙黃色時，細胞一般生長狀態較好；呈淡黃色時，則可能是培養時問過長，營養不足，死亡細胞過多；如呈紫紅色，則可能是細胞生長狀態不好，或已死亡。13細胞污染細菌污染真菌污染細菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除14細菌污染

細胞培養常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養細胞受細菌污染后，會出現培養液變混濁，pH改變。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。15真菌污染真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

!16細菌和真菌的清除

使用抗生素抗生素對殺滅細菌較有效。（當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平）。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期有效。1795％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發生率達到11%能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達不能通過可視法對其進行檢測對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環境不良操作人員的疏失實驗器具不潔等已受污染的細胞已受污染的培養基、血清支原體污染18熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養聚合酶鏈反應(PCR)法支原體污染檢測19細胞營養液常常仍清亮但變黃,細胞生長變緩，部分細胞發生脫落等等，細胞間隙可見鋪滿細沙樣小點。支原體污染表現熒光染料Hoechst33258染色法檢測支原體20熒光染色法(33258)顯示染色體，細胞周圍亮點為支原體21Giemsa染色法，附于胞質上黑點為支原體22掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體23

支原體的清除

支原體清除劑MRA（Mycoplasma

Removal

Agent）處理法每4天換一次液，連續處理15天清洗純化法細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌原理：由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生，所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至極限.如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。支原體特異性血清法用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。

24二、培養細胞的計數及活細胞的鑒定在細胞生物學的實驗中，往往要進行活細胞的鑒定和細胞的計數、調整細胞的密度，是進行實驗必不可少的一種基本技能。251．細胞計數①將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。②將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。③靜置3分鐘。④鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：細胞數/ml＝（4大格細胞總數/4）×10000注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。262．細胞活力①將細胞懸液以0.5ml加入試管中。②加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。③吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。④鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。另外，活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。27

HemocytometerThemostcommonroutinemethodforcellcountingwhichisefficientandaccurateiswiththeuseofahemocytometer.HemocytometerCellCounts28

Volume:0.1mm3

1ml=1cm3=1000mm31mm1mm0.1mm29Deadcell30細胞計數及活力31細胞計數時的注意事項①消化單層細胞時，務求細胞分散良好，制成單個細胞懸液。否則會影響細胞計數結果。②取樣計數前，應充分混勻細胞懸液。在連續取樣計數時尤應注意這一點。否則，前后計數結果會有很大誤差。③鏡下計數時，遇見2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計數。如細胞團占10%以上，說明消化不充分。④細胞數少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。⑤在計數板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液時，加液量不要溢出蓋片，也不要過少或帶氣泡。⑥在計數過程中，對大方格的邊緣壓線細胞應按數上不數下，數左不數右的原則進行計數。⑦染色標本在計數細胞時必須在15分鐘內檢查計數完畢。因為臺盼藍染液可以將死細胞迅速地染上藍色，再延長時間則活細胞也將逐漸著色。32細胞增殖實驗（MTT法）(一)原理MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT（噻唑藍）為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結晶可以用DMSO來溶解，利用酶標儀測定570nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。33(二)操作（實用于貼壁細胞）1.接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2.培養細胞：同一般培養條件，培養2-3天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。

3.顯色：分別培養不同時間，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配)20ul.繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。

4.比色：選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。34(三)結果以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線或計算細胞生長抑制率、細胞相對增殖率等。35【注意事項】1.選擇適當得細胞接種濃度。邊緣孔用無菌PBS填充。

2.避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在顯色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

3.設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。每組設定3復孔。

4.MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。MTT一般最好現用現配，過濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，