生物氣溶膠科學(xué)、技術(shù)、工程的過去、現(xiàn)在以及將來生物氣溶膠科學(xué)、技術(shù)、工程的過去、現(xiàn)在以及將來生物氣溶膠科學(xué)、技術(shù)、工程的過去、現(xiàn)在以及將來V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物氣溶膠科學(xué)、技術(shù)、工程的過去、現(xiàn)在以及將來日期：20xx年X月生物氣溶膠科學(xué)、技術(shù)、工程的過去、現(xiàn)在及將來北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院北京100044摘要：差的空氣衛(wèi)生造成的生物氣溶膠污染已經(jīng)給人們帶來了各種不利的健康影響以及疾病的發(fā)生。此外，生物恐怖襲擊等也逐漸威脅人類的安全。目前，大體積生物采樣，實(shí)時(shí)生物監(jiān)測(cè)技術(shù)、生物氣溶膠定量及控制以及疾病爆發(fā)于生物氣溶膠暴露是當(dāng)前生物氣溶膠的研究方向。雖然自從19世紀(jì)晚期，生物氣溶膠領(lǐng)域已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，但是與其他學(xué)科相比，仍然有很多不足需要研究。該論文旨在綜述當(dāng)前生物氣溶膠領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)。關(guān)鍵詞：生物氣溶膠；樣品采集；PCR；宏基因組BioaerosolScience,Technology,andEngineering:Past,Present,andFutureRENJiaDepartmentofCivilEngineering,BeijingJiaotongUniversity,Beijing100044,ChinaAbstract:Poorairhygieneasaresultofbioaerosolcontaminationhascauseddiverseformsofadversehealtheffectsanddiseases.Inaddition,globalbiosecurityisthreatenedbypurposefuluseofbiowarfareagentsandthevulnerabilityofpeopletotheinfectiousagents.Accordingly,developmentsinhigh-volumebiosampling,includingaerosol-to-hydrosoltechniqueswithlowcut-offsize,real-timebioaerosoldetection,adequatebiologicalquantification,andexposurecontrol,aswellastheinvestigationofthelinkbetweendiseaseoutcomeandbioaerosolexposure,arecurrentareasofbioaerosolresearch.Althoughmilestoneprogresshasbeenachievedbothinbioaerosolsamplingandanalysistechniquessincelate1800s,comparedtoatmosphericchemistrythebioaerosolfieldisstillunderstudied.Thisworkisconductedtobroadlyreviewcurrentstate-of-the-artsciencesandtechnologiesinthebioaerosolfield.Keywords:bioaerosol;sampling;PCR;metagenomic大量的研究證明生物氣溶膠可以通過呼吸作用對(duì)人體健康產(chǎn)生負(fù)面的影響，涉及到病原微生物的時(shí)候，甚至?xí)斐伤劳觯―ouwesetal.2003）。生物氣溶膠通常是指懸浮在空氣中的空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于100μm的含有生物成分的顆粒，包括細(xì)菌、病毒、真菌、花粉、植物碎片以及它們的分泌物，比如內(nèi)毒素、葡聚糖、過敏原和霉菌毒素（Cox1995）。人類打噴嚏時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的生物氣溶膠，有研究表明，室內(nèi)的生物氣溶膠可能包含有呼吸致病菌、塵螨、真菌孢子、菌絲體和其他生物質(zhì)，更容易引起過敏性或傳染性疾病。除此之外，一些人為活動(dòng)，比如廢物回收、生物堆肥土地利用、農(nóng)業(yè)、制藥業(yè)以及一些生物分析技術(shù)也可以產(chǎn)生各種形式的生物氣溶膠。雖然一些研究表明兒童在一定程度的內(nèi)毒素暴露條件下可能會(huì)對(duì)其抵抗?jié)裾詈拖a(chǎn)生積極的影響（Tischeretal.2011），但更多的研究表明生物氣溶膠污染可能會(huì)引起呼吸道感染，過敏性反應(yīng)等。在美國(guó)，生物氣溶膠會(huì)造成大約年均2.5億次呼吸道感染事件，7千5百萬就診人次，1.5億天病假，100億醫(yī)療費(fèi)用，外加大約100億的經(jīng)濟(jì)損失（Cox1995）。2003年嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥（SARS）的爆發(fā)以及2009年全球性的HIN1病毒感染事件極大的引起了世界范圍內(nèi)的關(guān)注。此外，由于地區(qū)動(dòng)蕩和政治沖突，生物恐怖主義的威脅日益嚴(yán)重，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。生物氣溶膠除了會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生影響外，也可能會(huì)通過全球性的擴(kuò)散影響公眾和生態(tài)環(huán)境。總之，人類正面臨著日益嚴(yán)重的生物氣溶膠感染威脅。1生物氣溶膠的發(fā)展經(jīng)歷了19世紀(jì)的黃金時(shí)代，生物氣溶膠已經(jīng)迎來了新的快速發(fā)展的新紀(jì)元。達(dá)爾文最早在1833年從空氣灰塵中發(fā)現(xiàn)了霉菌孢子，Pasteur在1861年提出空氣中存在有人類肉眼不可見的微生物，駁斥了之前的無生源說。Haldane和Anderson在1887年發(fā)表了一篇突破性的研究，他們調(diào)查了英國(guó)某學(xué)校以及居民房間內(nèi)的空氣中的霉菌和細(xì)菌，說明了通風(fēng)和晝夜差異對(duì)空氣中霉菌和細(xì)菌的影響，此后科學(xué)家們陸續(xù)在空氣中發(fā)現(xiàn)了青霉菌孢子、蘇云金芽孢桿菌以及在醫(yī)院空氣中發(fā)現(xiàn)天花病毒的傳播。1908年，一種新的采樣方法——類似于液體捕捉法的方法發(fā)表在科學(xué)雜志上，使得分離空氣中細(xì)菌成為可能。此后，人們對(duì)氣溶膠做了大量的研究。2生物氣溶膠的發(fā)生及采集2.1生物氣溶膠的發(fā)生當(dāng)評(píng)價(jià)一種新的生物氣溶膠采樣器或者控制技術(shù)的效果時(shí)，微生物通常需要首先被霧化，實(shí)驗(yàn)室一般使用一個(gè)噴霧器將相應(yīng)微生物的懸濁液霧化，然而這種方法在微生物反復(fù)被霧化的過程中可能會(huì)對(duì)其可培養(yǎng)性產(chǎn)生不利影響。因此，人們逐漸發(fā)明了一種新的相對(duì)溫和的霧化器——液體噴射霧化裝置（Liquidspargingaerosolizer,LSA），該裝置使用蠕動(dòng)泵輸送微生物懸濁液，微生物只經(jīng)過一次霧化過程，從而維持有限程度上的損傷。已有研究表明，該裝置可以提供穩(wěn)定的氣溶膠/微生物氣溶膠濃度（Mainelisetal.2005），但由于在使用過程中需要增加一臺(tái)機(jī)械設(shè)施，這也在一定程度上阻礙了它在實(shí)驗(yàn)室的廣泛推廣應(yīng)用。對(duì)于如何獲得真菌孢子氣溶膠，通常采用干式法，即從被真菌污染的污染物表面通過風(fēng)吹獲得。在某個(gè)實(shí)驗(yàn)室小試時(shí)發(fā)現(xiàn)從瓊脂培養(yǎng)基表面通過干式獲得了與基于液體發(fā)生裝置不同的非凝聚真菌孢子，同時(shí)真菌的種類、通過污染物表面的風(fēng)速、污染物表面結(jié)構(gòu)以及材質(zhì)均會(huì)影響真菌孢子的釋放（Gornyetal.2001），同時(shí)使用干式法也可以比避免更多的培養(yǎng)介質(zhì)的干擾，同時(shí)具有良好的可再現(xiàn)性，且操作簡(jiǎn)單，成本低（Kanaanietal.2008）。近些年來，電離子發(fā)射技術(shù)也被越來越多的應(yīng)用于生物氣溶膠的發(fā)生方面。電粒子發(fā)射是一種利用噴嘴和接地平板間的高電壓來產(chǎn)生高度帶電荷的細(xì)小氣溶膠顆粒的方法，與傳統(tǒng)的碰撞霧化法相比，電粒子發(fā)射技術(shù)由于產(chǎn)生的粒子具有相同的電荷極性可以顯著減少細(xì)菌團(tuán)塊現(xiàn)象的發(fā)生（Jungetal.2010）。也有研究表明，電粒子發(fā)射技術(shù)和一個(gè)帶電的噴霧器連用可以得到更穩(wěn)定的噬菌體氣溶膠顆粒（Eningeretal.2009）。然而，電粒子發(fā)射氣溶膠顆粒會(huì)攜帶有大量的基本電荷，甚至達(dá)106個(gè)基本電荷，如此高的電荷可能會(huì)對(duì)氣溶膠采集產(chǎn)生不利的影響，同時(shí)有研究表明，帶有100個(gè)基本電荷的1μm的顆粒在人體肺中的沉積速度比同樣大小電中性的顆粒的沉積速度快10倍（Bailey1997），如果沒有充分的保護(hù)措施，這些高的帶電顆粒加劇了實(shí)驗(yàn)室人員的吸入風(fēng)險(xiǎn)，這在一定程度上阻礙了電粒子發(fā)射技術(shù)產(chǎn)生氣溶膠在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)的應(yīng)用。雖然如此，由于電粒子發(fā)射技術(shù)可以產(chǎn)生單分散粒徑的氣溶膠，該方法也越來越多的應(yīng)用于氣溶膠發(fā)生。2.2生物氣溶膠的采集常見的生物氣溶膠采樣方法有撞擊法、液體捕捉法和膜過濾法，為了使用現(xiàn)在可行的分子學(xué)技術(shù)或者生物化學(xué)手段對(duì)生物氣溶膠樣品進(jìn)行全面充分的分析，采樣過程中重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一就是氣溶膠轉(zhuǎn)移到水溶膠的效率。已經(jīng)證明液體捕捉法可以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，但是粒徑較大的真菌可能會(huì)在入口損失，而且采樣速率低。BioSampler是一款典型的普遍使用的模擬人體鼻子的液體捕捉采樣器，采樣速率為12.5L/min，它通過最小化顆粒撞擊距離和減少顆粒重復(fù)氣溶膠化優(yōu)化了AGI-30采樣器，BioSampler采集的樣品可以用微生物分析技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或定量PCR方法來進(jìn)行生物暴露評(píng)估分析。為了進(jìn)一步提高對(duì)微生物氣溶膠污染的反應(yīng)速度，還需要進(jìn)一步開發(fā)氣溶膠到水溶膠的大體積采樣器。相比于其他考慮因素，高流量和攜帶方便成為生物氣溶膠采樣的兩個(gè)關(guān)鍵考慮因素，通常采樣體積越大意味著能量消耗越大，設(shè)備安裝越不方便；另一方面攜帶方便則對(duì)電池效率要求較高。也已出現(xiàn)一些大體積氣溶膠到水溶膠的采樣器，BioGuardian空氣采樣器采樣速率在100~1000L/min，對(duì)應(yīng)將氣溶膠收集到10~15mL液體中；SpinCon的采樣速率為450L/min，對(duì)應(yīng)液體體積為10mL；BioCapture采樣速率為200L/min，對(duì)應(yīng)液體體積為5mL。最近，勞倫斯利物莫國(guó)家實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種體積緊湊的氣溶膠采樣器，在采樣速率為225L/min的條件下可以將大體積空氣中的氣溶膠轉(zhuǎn)移到1mL液體中，就低的采樣速率和最終收集的液體體積而言，該采樣器實(shí)現(xiàn)了高的氣溶膠轉(zhuǎn)移比率。除了液體捕捉采樣法外，還有單級(jí)或多級(jí)的碰撞采樣器，常見的撞擊采樣器有BioStage及Andersen六級(jí)采樣器。這種撞擊法采樣器可以通過一個(gè)微流體通道和先進(jìn)的生物氣溶膠自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)連用。近年來，靜電采樣法由于其自身的帶電性越來越受到人們的關(guān)注，一項(xiàng)研究表明在某種條件下靜電場(chǎng)采樣器比BioStage撞擊采樣器獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌或真菌濃度高5~8倍（YaoandMainelis2006），而且靜電法可以直接將氣溶膠轉(zhuǎn)移到水溶膠當(dāng)中；此外，也有研究表明，在低采樣速率和高的靜電場(chǎng)條件下，靜電采樣法對(duì)空氣中的過敏原和毒素的采集效果比BioStage更突出。與液體捕捉采樣法相比，靜電采樣法需要消耗更低的能耗，采樣效果受靜電場(chǎng)強(qiáng)、采樣速率及目標(biāo)微生物所帶電荷影響，在一定的條件下對(duì)0.3~0.5μm的顆粒的采樣效率可以達(dá)到90%。考慮到靜電采樣法的諸多優(yōu)勢(shì)，應(yīng)該將該采樣方法與現(xiàn)代分子學(xué)技術(shù)連用，從而實(shí)現(xiàn)更好的生物暴露評(píng)估和氣溶膠污染監(jiān)測(cè)。然而靜電采樣法面臨的最大的挑戰(zhàn)是采樣速率高的條件下采樣效率低，提高采樣速率可以一定程度上改善采樣效率，但如果電壓太高，可能會(huì)擊穿空氣。3基于PCR技術(shù)的微生物分析技術(shù)雖然傳統(tǒng)的生物培養(yǎng)法也可以用來定量生物量，但該方法存在很大程度的偏差，可能無法檢出一些重要的微生物種類或者不可培養(yǎng)的微生物。這在很大程度上歸功于兩個(gè)原因，一是基于培養(yǎng)基撞擊法的采樣技術(shù)通常降低了樣品采集效率或者降低了更細(xì)小顆粒的采集效果，二是只有很少的微生物，大約不到1%的微生物可以生物培養(yǎng)。分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR，qPCR，RT-PCR等可以檢測(cè)不可培養(yǎng)的細(xì)胞，這樣一來就加深了人們對(duì)生物氣溶膠微生物種群的理解以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。近年來，基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐漸的被應(yīng)用于分析空氣樣品中的微生物（Evgrafovetal.2010）。PCR可以使從環(huán)境樣品中提取的一小段目標(biāo)DNA或RNA片段在聚合酶的作用下成千上萬倍的擴(kuò)增，而樣品中DNA的初始濃度可以由定量時(shí)的標(biāo)線及Ct值決定。PCR技術(shù)的使用不僅極大的降低了環(huán)境樣品的檢測(cè)限，同時(shí)也縮減了進(jìn)行有效分析時(shí)樣品的采集時(shí)間，已有研究證明，qPCR的檢出限在50~100copies/mL（Ideetal.2003）不等。最近的研究表明，空氣樣品中細(xì)菌濃度差異至少在1.3~3.2倍（Hospodskyetal.2010）時(shí)，qPCR才可以檢測(cè)出其中的區(qū)別。在另外一項(xiàng)最近的研究中，高密度DNA微陣列系統(tǒng)發(fā)育分析成功的被應(yīng)用到描述城市氣溶膠的多樣性（Brodieetal.2007）。除此之外，PCR技術(shù)還被廣泛的用來定量空氣樣品中的真菌孢子等（Hauglandetal.2002）。當(dāng)然，這些分子生物學(xué)技術(shù)也存在一些劣勢(shì)，比如DNA提取和PCR過程產(chǎn)生偏差，腐殖質(zhì)抑制等環(huán)境因素的干擾，較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間以及大量的操作實(shí)驗(yàn)。此外，微生物碎片和動(dòng)物過敏原等不可以用PCR技術(shù)進(jìn)行分析，PCR技術(shù)并不能判斷微生物的存活情況等，然而，存活情況對(duì)于病原菌感染非常重要。除了上述一些限制因素外，在PCR之前的樣品準(zhǔn)備可能帶來的DNA樣品污染等也是PCR技術(shù)的另一個(gè)問題。雖然如此，基于PCR技術(shù)在氣溶膠領(lǐng)域的應(yīng)用與傳統(tǒng)生物培養(yǎng)法相比已經(jīng)極大的降低了樣品的檢出限，是生物氣溶膠研究領(lǐng)域一個(gè)里程碑式的進(jìn)步。綜述，PCR技術(shù)仍將是環(huán)境科學(xué)和工程領(lǐng)域最具潛力的生物分析技術(shù)。在另一方面，生物氣溶膠里不可培養(yǎng)的生物有機(jī)質(zhì)，比如內(nèi)毒素、葡聚糖等，同樣也不可以用生物培養(yǎng)法進(jìn)行鑒定分析，這就極大的低估了生物氣溶膠的暴露評(píng)價(jià)，從而影響控制策略的制定，使用生物化學(xué)方法，比如ELISA和LAL，可以幫助人們對(duì)不可培養(yǎng)的生物質(zhì)進(jìn)行分析定量。4基于宏基因組技術(shù)的微生物氣溶膠分析北京大學(xué)Chen教授克服了氣溶膠大體積采樣及膜DNA提取效率低的難題，利用宏基因組技術(shù)對(duì)北京嚴(yán)重霧霾期間（2013年1月8日到14日）空氣中PM2.5和PM10顆粒物的微生物，尤其是過敏原和致病菌進(jìn)行了分析研究。Chen采用大體積膜過濾采樣方式，分別采集PM2.5和PM10顆粒物，膜大小為采樣速率為1.13m3/min連續(xù)采樣23h，總體積為1559m3。濾膜在使用前在馬弗爐中500℃烘烤5h，用高壓滅菌的鋁箔紙包好，在采集過程中，所有接觸膜的儀器（鑷子，剪刀等）均需每天高壓滅菌。PM10和PM2.5顆粒分別用1/4和（1+3/4）張膜剪成小片，在裝有小球的小管中200g離心2h后，懸濁液用0.2μm的膜過濾，然后將膜剪碎用Mo-BioPowersoilDNA提取試劑盒提取DNA，為了提高提取效率改進(jìn)了柱純化方法，提取后的DNA保存在-80℃。通過宏基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析以及對(duì)樣品中微生物棲息地溯源，數(shù)據(jù)庫中所得的所有16s序列可以分為4種棲息環(huán)境（陸地、排泄物、淡水、海水），得到以下結(jié)論：（1）通過與Gg16S數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)255株細(xì)菌，比之前3篇研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌總和都多，其中細(xì)菌>原核>古菌>病毒數(shù)。（2）由于許多真菌孢子的粒徑更多的介于2.5~10μm，因此PM10中真核細(xì)胞的相對(duì)豐度和多樣性均高于PM2.5中真核細(xì)胞多樣性。（3）氣溶膠中微生物宏基因序列結(jié)果與其他各種環(huán)境（瀉湖、污泥、土壤等）中明顯不同，相對(duì)與土壤中分布更接近。（4）原核生物中細(xì)菌豐度最高，且大多數(shù)與陸地、排泄物中細(xì)菌具有相關(guān)性。使用MetagenomicPhylogeneticAnalysis方法建立細(xì)菌和古菌的系統(tǒng)多樣性樹。PM2.5中與排泄物相關(guān)的細(xì)菌比例隨著PM2.5濃度升高有所提升。（5）豐度最高的細(xì)菌、真菌、病毒研究：發(fā)現(xiàn)48種細(xì)菌、2種真菌、3種病毒豐度最高，其中大多數(shù)在研究的7天中變化范圍不大，PM2.5中Thermobifidafusca的豐度在PM2.5濃度升高時(shí)有所增加（6）PM2.5和PM10中的過敏原及致病菌：3種已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的過敏原及致病菌豐度均發(fā)現(xiàn)隨著PM濃度的升高有所增加5結(jié)論差的空氣衛(wèi)生造成的生物氣溶膠污染已經(jīng)給人們帶來了各種不利的健康影響以及疾病的發(fā)生。此外，生物恐怖襲擊等也逐漸威脅人類安全。目前，大體積生物采樣，實(shí)時(shí)生物監(jiān)測(cè)技術(shù)、生物氣溶膠定量及控制以及疾病爆發(fā)于生物氣溶膠暴露是當(dāng)前生物氣溶膠的研究方向。參考文獻(xiàn)AgranovskiI.E.(2010).FiltrationofLiquidandSolidAerosolsonLiquid-CoatedFilters.Aerosols:ScienceandTechnology.I.Agranovskied.Wiley-VCH,NewYork.pp.315–318.BeckJ.D.ShangL.LiB.MarcusM.S.andHamersR.J.(2008).DiscriminationBetweenBacillusSpeciesbyImpedanceAnalysisofIndividualDielectrophoreticallyPositionedSpores.Anal.Chem.80:3757–3761.FoardeK.K.HanleyJ.T.andVeeckA.C.(2000).EfficacyofAntimicrobialFilterTreatments