微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉水解糖的制備基因工程菌的不穩定性及對策5微生物發酵類型及培養基2微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉一．發酵類型：

發酵類型是為了描述菌體生長，碳源利用與代謝產物形成速率變化，以及它們相互間動力學關系而確定的。5.1微生物發酵的類型和方式3微生物發酵類型及培養基一．發酵類型：5.1微生物發酵的類型和方式3微生物發酵類型1．動力學描述參數菌體生長速率比生長速率菌體得率系數產物得率系數（Vx）：單位體積，單位時間里生長的菌體量g/(Lh)（μ）：

菌體濃度除菌體生長速率或繁殖速率h-1（Yx/s）:消耗1g或1mol營養物質生成的菌體的g數或mol數（Yp/s）：消耗1g或1mol營養物質生成的產物的g數或mol數4微生物發酵類型及培養基1．動力學描述參數菌體生長速率比生菌體得產物得率系數（Vx）231產物形成直接與碳源利用有關產物形成間接與碳源利用有關產物形成表面上與碳源利用有關

2．發酵類型根據產物的形成與基質消耗的關系分5微生物發酵類型及培養基231產物形成直接與碳源利用有關產物形成間接與碳源利用有關產

2．發酵類型IIIIII特點菌體生長，碳源利用和產物形成幾乎都在相同的時間出現高峰。微生物生長和產物合成是分開的。糖既滿足細胞生長所需能量又充作產物合成的碳源。產物形成一般在菌體生長接近或達到最高生長時期。產物形成與碳源利用無準量關系。6微生物發酵類型及培養基2．發酵類型IIIIII特點菌體生長，碳微生物生長和產物形7微生物發酵類型及培養基7微生物發酵類型及培養基1．分批發酵：是一種準封閉式系統。一次投料，一次接種，一次收獲的間歇式培養方式。培養過程中，接種物要經過5個時期。即延遲期、對數生長期、減速期、穩定期和衰亡期。二．發酵方式：分批培養的特點：操作簡單、周期短、染菌機會少和生產過程、產品質量易掌握。但是生產率相對較低。8微生物發酵類型及培養基1．分批發酵：是一種準封閉式系統。一次投料，一次接種，9微生物發酵類型及培養基9微生物發酵類型及培養基細胞濃度隨培養時間呈指數增長。細胞濃度的變化率與細胞濃度成正比。2對數生長期細胞的比生長速率開始下降3細胞濃度達到最大值，細胞的比生長速率為04活細胞濃度不斷下降5細胞濃度的增加不明顯。受菌齡和接種量的影響。1延遲期減速期靜止期衰亡期特點10微生物發酵類型及培養基2對數生長期細胞的比生3細胞濃度達4活細胞濃5細胞濃度的1延對數生長期：

dX/dt=μX其中：X---細胞干重

t---時間

μ---比生長速率微生物的比生長速率μ與微生物的種類、培養溫度、pH、培養基成分及限制性基質濃度等因素有關。11微生物發酵類型及培養基11微生物發酵類型及培養基12微生物發酵類型及培養基12微生物發酵類型及培養基分批培養過程的生產率P:

生產率=產物濃度/發酵時間生產率是評價發酵過程的成本和效率的綜合指標。在分批培養時，計算時間還應包括放罐、清洗、裝料和消毒的時間等非發酵過程所占用的時間。13微生物發酵類型及培養基分批培養過程的生產率P:13微生物發酵類型及培養基14微生物發酵類型及培養基14微生物發酵類型及培養基2.連續發酵：連續發酵是指在培養過程中，連續地向發酵罐中加入培養基，同時以相同的流速從發酵罐中排出含有產品的培養基的發酵方式。一般連續培養方式很多：攪拌發酵罐和管式反應器；恒化和恒濁；循環式和非循環式；單級和多級。

15微生物發酵類型及培養基15微生物發酵類型及培養基依據培養物的生長率是受到化學環境控制的。即培養基中某一限制性組分的作用。恒化12控制補充的培養基的流速，使培養液的細胞濃度保持恒定。恒濁16微生物發酵類型及培養基依據培養物的恒化12恒濁16微生物發酵類型及培養基連續發酵先作分批培養，讓微生物生長繁殖達到一定程度，并進入產物合成期，然后開始以恒定的流量向發酵罐流加培養基，同時以相同的流量排放培養液，使發酵罐內培養液的體積保持恒定，微生物能持續生長并合成產物。進行單級連續培養時，流出的培養液進行固液分離后，經濃縮的細胞懸液再被送回發酵罐中的方法。把多個發酵罐串連起來，第一個罐的情況與單罐培養相同，以后下一罐的進料便是前一發酵罐的出料，這樣就組成了多級串聯連續培養。循環式

單級連續培養多級串聯連續培養非循環式：17微生物發酵類型及培養基連續發酵先作分批培養，讓單級連續培養進入穩定狀態后，細胞的比生長速率與稀釋率相等。連續培養的最大特點：微生物細胞的生長速率、產物的代謝均處于恒定狀態，可達到穩定、高速培養微生物細胞或生產大量的代謝產物的目的。生產率得以提高。18微生物發酵類型及培養基單級連續培養進入穩定狀態后，細胞的比生長速率與稀釋率相等。13．補料分批發酵

在分批培養過程中，間歇或連續地補加新鮮培養基，而不從發酵罐中間斷地放出培養液的培養方法。工業上利用分批補料培養以消除阻遏并保持通氣條件。分批補料培養還可以防止培養基中某一組分的毒性。19微生物發酵類型及培養基3．補料分批發酵19微生物發酵類型及培養基20微生物發酵類型及培養基20微生物發酵類型及培養基培養基：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的，按一定比例配制的多種營養物質的混合物。5.2培養基選擇和配制的原則21微生物發酵類型及培養基5.2培養基選擇和配制的原則21微生物發酵類型及培養基一、培養基的類型和用途基礎，繁殖和鑒別培養基天然合成和半合成孢子，種子和發酵培養基根據來源根據目的根據生產工藝22微生物發酵類型及培養基一、培養基的類型和用途基礎天然根據來源根據目的根據生22微生二.培養基的選擇231從微生物的特點來選擇從生產和科研的要求選擇從經濟效益方面考慮23微生物發酵類型及培養基二.培養基的選擇231從微生物的特點來選擇從生產和科研的要求對培養基的要求提供合成細胞和發酵產物的基本成分利于減少培養基原料的單耗利于提高培養及產物的濃度利于減少能耗減少副產物，利于產品的分離純化利于提高產物的合成速率三．培養基的配制原則24微生物發酵類型及培養基對培養基的要求利于減少培利于提高培養減少副產物，利于提高產三適當配比滲透壓pH氧化還原電位營養需要原則25微生物發酵類型及培養基滲透壓pH營養原則25微生物發酵類型及培養基典型培養基26微生物發酵類型及培養基典型培養基26微生物發酵類型及培養基

完善的培養基設計是實驗室的實驗，實驗工廠的放大和生產規模中的一個重要步驟。

培養基的組成必須滿足細胞的生長和代謝所需的元素，并能提供生物合成和細胞維持活力所需要的能量。5.3培養基的設計27微生物發酵類型及培養基5.3培養基的設計27微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源物質碳源物質氮源物質無機鹽和微量元素28微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源氮源無機鹽和微量28微生物發酵類一.培養基的成分5678生長因子前體促進劑和抑制劑水分29微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分5678生長促進劑和29微生物發酵類型光能：光能自養微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發酵等氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽等是

化能自養微生物的能源。碳水化合物等有機物、石油、天然氣及石油化工產品是異養微生物的能源。1能源物質30微生物發酵類型及培養基光能：光能自養微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發酵。碳源細胞碳骨架產物能源

2.碳源物質主要包括：糖類，脂類，有機酸，低碳糖等31微生物發酵類型及培養基。碳源細胞碳骨架產物能源2.碳源物質主要包括：糖類，蔗糖麥芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖類碳源脂類有機酸類32微生物發酵類型及培養基蔗糖麥芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖類脂類有機32微生物發酵類型及有機氮和無機氮作用菌體細胞結構含氮代謝產物細胞提供能源3氮源物質33微生物發酵類型及培養基有機氮和無機氮作用菌體細含氮代細胞提3氮源物質33微生物發花生餅粉，黃豆餅粉，棉籽餅粉，酵母粉，麥麩，魚粉，蠶蛹粉，玉米漿，蛋白胨，尿素，廢菌體和酒糟氨水，銨鹽和硝酸鹽有機氮

無機氮34微生物發酵類型及培養基花生餅粉，黃豆餅粉，氨水，有機氮無機氮344．無機鹽和微量元素磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，錳等。較低濃度對細胞的生長和產物合成有促進作用，而在高濃度時常表現出顯著的抑制作用35微生物發酵類型及培養基4．無機鹽和微量元素磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，作用酶的激活劑生理活性物質的調節劑生理活性物質的組成36微生物發酵類型及培養基作用酶的激活劑生理活性生理活性36微生物發酵類型及培養基輔酶的組成成分高能化合物緩沖劑細胞結構磷酸鹽的作用37微生物發酵類型及培養基輔酶的組高能緩沖劑細胞結構磷酸鹽37微生物發酵類型及培養基硫含硫氨基酸許多酶的輔酶的活性基

產物硫酸鈉硫代硫酸鈉38微生物發酵類型及培養基硫含硫氨基酸許多酶的輔酶的活性基產物硫酸鈉硫代38微己糖磷酸化酶，檸檬酸脫氫酶，羧化酶等的激活劑。2是鏈霉素發酵的必需元素3鋅是維生素B12的激活劑，可以促進產物合成4鈷維持細胞滲透壓5鉀和鈉影響細胞膜的透性；鈣還影響磷酸鹽的濃度6細胞色素，細胞色素氧化酶，過氧化物酶等的組成成分，是微生物有氧氧化的必不可少的元素1鐵鎂鉀和鈣39微生物發酵類型及培養基己糖磷酸化2是鏈霉素3鋅是維生素4鈷維持細5鉀和鈉影響細6細微生物生長不可缺少的微量有機物，稱為生長因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，維生素等。作用：構成細胞的組成成分，促進生命活動的進行。

5．生長因子40微生物發酵類型及培養基5．生長因子40微生物發酵類型及培養基1）生物素

作用：影響產生菌細胞膜的通透性，同時影響菌體的代謝途徑。一般5μg/L。41微生物發酵類型及培養基1）生物素41微生物發酵類型及培養基生物素過量

不足不產或少產谷氨酸產乳酸或琥珀酸長菌快，pH低，尿素消耗多菌體生長不好谷氨酸產量低弱發酵向乳酸發酵轉換42微生物發酵類型及培養基生過量不足不產或少產谷氨酸菌體生長不好42微生物發2）維生素B1：對某些菌種發酵有促進作用。3）天然原料：玉米漿，0.4-0.8%

麩皮水解液，1%

糖蜜，0.1-0.4%

酵母43微生物發酵類型及培養基43微生物發酵類型及培養基

某些化合物被加到培養基后，能夠直接在生物合成過程中結合到產物分子中去，而自身的結構并未發生太大的變化，卻能提高產品的產量。這類小分子物質稱為前體。6．前體44微生物發酵類型及培養基某些化合物被加到培養基后，能夠直接在生物合成過程中結45微生物發酵類型及培養基45微生物發酵類型及培養基7．促進劑和抑制劑促進劑是一類刺激因子，他們并不是前體或營養，其加入可以影響微生物的正常代謝，或促進中間代謝產物的積累，或提高次級代謝產物的產量。常用的促進劑誘導物，表面活性劑，乙二胺四乙酸，大豆油抽提物等。46微生物發酵類型及培養基7．促進劑和抑制劑促進劑是一類刺激因子，他們并常用的促進劑誘在發酵過程中，加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時刺激另一代謝途徑，以至于可以改變微生物的代謝途徑。47微生物發酵類型及培養基47微生物發酵類型及培養基48微生物發酵類型及培養基48微生物發酵類型及培養基8．水分參與細胞內一系列化學反應2有效控制細胞內的溫度變化3維持大分子的天然構象4脫水作用和水合作用控制有多亞基組成的結構5溶劑和運輸介質的作用149微生物發酵類型及培養基8．水分參與細2有效控3維持大4脫水作用5溶劑和149微生物微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉水解糖的制備基因工程菌的不穩定性及對策5微生物發酵類型及培養基51微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉一.培養基的成分1234能源物質碳源物質氮源物質無機鹽和微量元素52微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源氮源無機鹽和微量52微生物發酵類一.培養基的成分5678生長因子前體促進劑和抑制劑水分53微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分5678生長促進劑和53微生物發酵類型

嚴格控制營養物質的濃度和比例，不僅僅是為了維持正常的滲透壓，節約原料，而且直接影響到菌體的繁殖和產物積累。二．營養物質的調節54微生物發酵類型及培養基嚴格控制營養物質的濃度和比例，不僅僅是為了維持正1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的關系3

碳氮比例的調節4前體的控制5補料55微生物發酵類型及培養基1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的關系31).不同碳源的利用速度

能夠被微生物快速利用的碳源稱為速效碳源，反之為遲效碳源。利用速度依次為：葡萄糖---乳酸----乳糖56微生物發酵類型及培養基1).不同碳源的利用速度56微生物發酵類型及培養基

微生物對氮源的利用速度為：氨態氮----硝態氮----有機氮。

氨的過高過低都會對產物形成造成不良的影響。

氮源的利用速度與碳源的利用速度是很有關系的。

糖代謝的許多中間產物是氨基酸合成的前體。2).氮源利用和碳源利用的關系57微生物發酵類型及培養基2).氮源利用和碳源利用的關系57微生物發酵類型及

生產上多采用控制碳氮比例以滿足菌體的大量繁殖，又能大量形成產物。

酵母細胞的碳氮比為：100：20；霉菌細胞的碳氮比為：100：10。

發酵培養基的碳氮比約為：100：0.2-2.0。

谷氨酸生產中的碳氮比約為：100：15-21。3).碳氮比例的調節58微生物發酵類型及培養基生產上多采用控制碳氮比例以滿足菌體3).碳氮比例的4).前體的控制

加入量加入方式菌種前體59微生物發酵類型及培養基4).前體的控制加入量加入方式菌種前體59微生物發酵類型及培補料豐富培養基產物合成的旺盛期延長控制pH和代謝方向改善了通氣效果解除終產物反饋5)補料60微生物發酵類型及培養基補料豐富培養基控制pH和代謝方向改善了通氣效果解除終產物反饋補料的物質碳，氮和水及其他物質。碳源有葡萄糖，飴糖，蔗糖，糊精，淀粉，油脂等。補料氮源有氨水，硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨，花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿和尿素等。補料的方法關鍵是控制補料時間，速率和配比。其目的是不使菌體生長過快，僅僅維持呼吸，但是仍能合成產物。61微生物發酵類型及培養基補料的物質碳，氮和水及其他物質。碳源補料的方法關鍵是控制補料碳源和能源+氮源+其他需要

細胞+產物+CO2+H2O＋熱量

組成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，這些元素都要在方程中予以平衡。培養基中還需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。三．培養基的設計62微生物發酵類型及培養基碳源和能源+氮源+其他需要三．培養基的設計62微生物發酵類63微生物發酵類型及培養基63微生物發酵類型及培養基

對于無力合成的生長因子，要通過在培養基中加入適量的純凈物或含有該物質的混合物。

碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用。在需氧的條件下對碳源的需要量可以通過菌體得率系數推算而得64微生物發酵類型及培養基對于無力合成的生長因子，要通過在培養基中加入適量的純

二糖低聚糖葡萄糖淀粉水解糖

工業上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化。5.4淀粉水解糖的制備65微生物發酵類型及培養基二糖低聚糖葡萄糖淀粉工業上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為發酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外觀要潔凈，透明，呈淡黃色；不可變質。制備淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麥，大米和薯類等。66微生物發酵類型及培養基發酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外水解適度控制蛋白量新鮮潔凈質量67微生物發酵類型及培養基水解控制新鮮質量67微生物發酵類型及培養基方法酸解法酶解法酸酶結合法68微生物發酵類型及培養基方法酸解法酶解法酸酶68微生物發酵類型及培養基1.淀粉水解糖對發酵的影響水解不完全：浪費，逃液，染菌。水解過度：產生羥甲基糠醛，進而形成類黑素，不僅浪費，而且抑制菌體生長。

淀粉原料中蛋白含量過多，當糖液中和，過濾時除去不徹底，會引起發酵逃液和染菌。69微生物發酵類型及培養基1.淀粉水解糖對發酵的影響69微生物發酵類型及培養基葡萄糖的理論收率：111%指標實際收率葡萄糖值淀粉轉化率2.淀粉制糖過程中考察的指標70微生物發酵類型及培養基葡萄糖的理論收率：111%指實際葡萄糖值淀粉2.淀粉制糖過程

實際收率=[糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）]X100%

轉化率=[糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X1.11]X100%

DE值=還原糖（%）/干物質含量（%）71微生物發酵類型及培養基71微生物發酵類型及培養基以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉化為葡萄糖的方法。優點：生產簡單，方便，水解時間短，設備生產能力大。缺點：要求特殊設備；易產生副反應；對原料要求高原理：淀粉各種糊精麥芽糖

葡萄糖

二淀粉酸水解法72微生物發酵類型及培養基以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉化為葡萄糖的方法。二淀粉

影響水解反應速率的關鍵因素：

溫度酸的濃度多糖的水解常數酸的種類因素73微生物發酵類型及培養基

影響水解反應速率的關鍵因素：

多糖的酸的種類因素淀粉５’－羥甲基糠醛乙酰丙酸+蟻酸+有色物質等。

其它副反應縮短反應時間，控制反應ｐＨ，降低葡萄糖的濃度減少74微生物發酵類型及培養基其它副反應縮短反應時間，減少74微生物發酵類型及培養基

葡萄糖二糖，三糖和其他低聚糖酸和熱

復合反應異麥芽糖和龍膽二糖降低葡萄糖的收率，發酵的殘糖增加，抑制菌體生長和產物形成，增加提取和精制的難度75微生物發酵類型及培養基葡萄糖二糖，酸和熱復合反應異麥芽糖和龍２．工藝原料中和脫色過濾除雜糖液調漿糖化冷卻10.5-12Bé0.6-0.7%，

pH1.5左右糖化時間=達到最大葡萄糖值時的時間-放料時間。燒堿或純堿中和溫度為60-70℃，中和pH4.6-5.0.活性炭，淀粉量的0.6-0.8%。65C。，pH4.6-5.0。d=144.3/144.3±Bé76微生物發酵類型及培養基２．工藝原料中和過濾糖液調漿糖化冷卻10.5-12Bé糖化時三．雙酶水解法

淀粉酶和糖化酶優點缺點條件溫和，無需特殊設備無副反應，產品純度高，淀粉轉化率高。可在高淀粉濃度下水解時間長，設備多，過濾難。77微生物發酵類型及培養基三．雙酶水解法淀優點缺點條件溫和，無需特殊設備時間長，77微淀粉a-淀粉酶葡萄糖，麥芽糖和麥芽三糖。異麥芽糖和低聚糖。（一）液化78微生物發酵類型及培養基淀粉a-淀粉酶葡萄糖，（一）液化78微生物發酵類型及培養基1.淀粉液化的條件及液化程度的控制淀粉糊化老化受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體結構消失，互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪拌，淀粉也不會再沉淀的現象。60-75℃。

分子間氫鍵已經斷裂的糊化淀粉又重新排列成新的氫鍵的過程。淀粉酶很難進入老化淀粉的結晶區起作用，使淀粉很難液化淀粉的種類，酸堿度，溫度及加熱方式，淀粉糊的濃度有關系。79微生物發酵類型及培養基1.淀粉液化的條件及液化淀糊化老化受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體液化的方法80微生物發酵類型及培養基液化的方法80微生物發酵類型及培養基1）、工藝流程------------------------調漿高溫維持二次液化冷卻糖化配料一次噴射液化液化保溫二次噴射2、蒸氣噴射液化工藝及條件81微生物發酵類型及培養基調漿高溫二次冷卻糖化配料一次噴液化二次2、蒸氣噴射液化工藝及

2）、液化的控制液化低高液化液的黏度太大，難于操作；淀粉易老化，不利于糖化。糖液的葡萄糖值低，淀粉會老化，影響糖化酶的作用效果。葡萄糖值為10-20液化結束要滅酶。82微生物發酵類型及培養基2）、液化的糖化酶的水解作用

糖化是利用糖化酶將淀粉液化產物糊精和低聚糖進一步水解成葡萄糖的過程。

糖化過程葡萄糖含量不斷增加。糖化酶對底物的作用是從非還原性末端開始的。產生a-葡萄糖。糖化酶對a-1,4和a-1,6糖苷鍵都能水解。（二）糖化83微生物發酵類型及培養基糖化酶的水解作用（二）糖化83微生物發酵類型及培養基液化---糖化---滅酶---過濾---貯糖計量---發酵

80-100U/g淀粉pH4.2-4.5,60℃數小時pH4.8-5.090℃30min60-70℃過濾糖化工藝條件及控制84微生物發酵類型及培養基80-100U/g淀粉pH4.8-5.060-70℃糖85微生物發酵類型及培養基85微生物發酵類型及培養基基因工程菌的穩定性是高水平發酵生產的基本條件。5.5基因工程菌的不穩定性及對策86微生物發酵類型及培養基基因工程菌的穩定性是高水平發酵生產的基本條件。5.5基因工程一、質粒不穩定性分裂不穩定性工程菌分裂時出現一定比例的不含質粒的子代菌的現象

結構不穩定性由于DNA從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變87微生物發酵類型及培養基一、質粒不穩定性分裂不穩定性工程菌分裂時出現一定比結構不穩定含低拷貝質粒者產不含質粒菌概率大；比生長速率關鍵2抗生素3選擇壓力生長階段使外源基因處于阻遏狀態4分階段控制培養溫度、pH、溶氧、限制性營養5控制培養條件影響細胞膜的透性；鈣影響磷酸鹽的濃度6比生長速率；基因重組系統的特性；染色體上是否有與質粒和外源基因同源的序列1合適的宿主合適的載體固定化提高質粒穩定性的方法88微生物發酵類型及培養基含低拷貝質2抗生素3選擇生長階段4分階段控5控制培影響細6比基因工程菌的培養補料分批連續培養透析培養固定化培養延長對數期獲得高密度菌體難；分段，進行兩階段連續連續培養；優化誘導水平，稀釋率；細胞比生長速率利用膜的半透性使培養物和培養基分離質粒的穩定性提高89微生物發酵類型及培養基基因工程菌的培養補料分批連續透析固定化培養延長對數期難；分高密度培養高密度培養是一個相對概念，一般是指培養液中工程菌的菌體濃度在50g/L干重以上，理論上最高值可達200g/L。高密度培養是大規模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝過程高密度培養可以提高菌體密度，提高單位體積的生產能力，降低生物量的分離費用，縮短生產周期，從而降低生產成本，提高生產效率。90微生物發酵類型及培養基高密度培養高密度培養是一個相對概念，一般是指培養液中工程菌的影響高密度培養的因素對氧氣的需求更高對營養源的種類和含量要求高精確調控培養基溶氧濃度pH91微生物發酵類型及培養基影響高密度培養的因素對氧氣的需求更高對營養源的種類和含量要求影響高密度培養的因素保持高溶氧，流加補料，適當的比生長速率分段控制溫度生長抑制物的生成92微生物發酵類型及培養基影響高密度培養的因素保持高溶氧，流加補料，適當的比生長速率分如何達到高密度培養231培養條件的改進構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌93微生物發酵類型及培養基如何達到高密度培養231培養條件的改進構建出產乙酸能力低的工微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉水解糖的制備基因工程菌的不穩定性及對策5微生物發酵類型及培養基95微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉一．發酵類型：

發酵類型是為了描述菌體生長，碳源利用與代謝產物形成速率變化，以及它們相互間動力學關系而確定的。5.1微生物發酵的類型和方式96微生物發酵類型及培養基一．發酵類型：5.1微生物發酵的類型和方式3微生物發酵類型1．動力學描述參數菌體生長速率比生長速率菌體得率系數產物得率系數（Vx）：單位體積，單位時間里生長的菌體量g/(Lh)（μ）：

菌體濃度除菌體生長速率或繁殖速率h-1（Yx/s）:消耗1g或1mol營養物質生成的菌體的g數或mol數（Yp/s）：消耗1g或1mol營養物質生成的產物的g數或mol數97微生物發酵類型及培養基1．動力學描述參數菌體生長速率比生菌體得產物得率系數（Vx）231產物形成直接與碳源利用有關產物形成間接與碳源利用有關產物形成表面上與碳源利用有關

2．發酵類型根據產物的形成與基質消耗的關系分98微生物發酵類型及培養基231產物形成直接與碳源利用有關產物形成間接與碳源利用有關產

2．發酵類型IIIIII特點菌體生長，碳源利用和產物形成幾乎都在相同的時間出現高峰。微生物生長和產物合成是分開的。糖既滿足細胞生長所需能量又充作產物合成的碳源。產物形成一般在菌體生長接近或達到最高生長時期。產物形成與碳源利用無準量關系。99微生物發酵類型及培養基2．發酵類型IIIIII特點菌體生長，碳微生物生長和產物形100微生物發酵類型及培養基7微生物發酵類型及培養基1．分批發酵：是一種準封閉式系統。一次投料，一次接種，一次收獲的間歇式培養方式。培養過程中，接種物要經過5個時期。即延遲期、對數生長期、減速期、穩定期和衰亡期。二．發酵方式：分批培養的特點：操作簡單、周期短、染菌機會少和生產過程、產品質量易掌握。但是生產率相對較低。101微生物發酵類型及培養基1．分批發酵：是一種準封閉式系統。一次投料，一次接種，102微生物發酵類型及培養基9微生物發酵類型及培養基細胞濃度隨培養時間呈指數增長。細胞濃度的變化率與細胞濃度成正比。2對數生長期細胞的比生長速率開始下降3細胞濃度達到最大值，細胞的比生長速率為04活細胞濃度不斷下降5細胞濃度的增加不明顯。受菌齡和接種量的影響。1延遲期減速期靜止期衰亡期特點103微生物發酵類型及培養基2對數生長期細胞的比生3細胞濃度達4活細胞濃5細胞濃度的1延對數生長期：

dX/dt=μX其中：X---細胞干重

t---時間

μ---比生長速率微生物的比生長速率μ與微生物的種類、培養溫度、pH、培養基成分及限制性基質濃度等因素有關。104微生物發酵類型及培養基11微生物發酵類型及培養基105微生物發酵類型及培養基12微生物發酵類型及培養基分批培養過程的生產率P:

生產率=產物濃度/發酵時間生產率是評價發酵過程的成本和效率的綜合指標。在分批培養時，計算時間還應包括放罐、清洗、裝料和消毒的時間等非發酵過程所占用的時間。106微生物發酵類型及培養基分批培養過程的生產率P:13微生物發酵類型及培養基107微生物發酵類型及培養基14微生物發酵類型及培養基2.連續發酵：連續發酵是指在培養過程中，連續地向發酵罐中加入培養基，同時以相同的流速從發酵罐中排出含有產品的培養基的發酵方式。一般連續培養方式很多：攪拌發酵罐和管式反應器；恒化和恒濁；循環式和非循環式；單級和多級。

108微生物發酵類型及培養基15微生物發酵類型及培養基依據培養物的生長率是受到化學環境控制的。即培養基中某一限制性組分的作用。恒化12控制補充的培養基的流速，使培養液的細胞濃度保持恒定。恒濁109微生物發酵類型及培養基依據培養物的恒化12恒濁16微生物發酵類型及培養基連續發酵先作分批培養，讓微生物生長繁殖達到一定程度，并進入產物合成期，然后開始以恒定的流量向發酵罐流加培養基，同時以相同的流量排放培養液，使發酵罐內培養液的體積保持恒定，微生物能持續生長并合成產物。進行單級連續培養時，流出的培養液進行固液分離后，經濃縮的細胞懸液再被送回發酵罐中的方法。把多個發酵罐串連起來，第一個罐的情況與單罐培養相同，以后下一罐的進料便是前一發酵罐的出料，這樣就組成了多級串聯連續培養。循環式

單級連續培養多級串聯連續培養非循環式：110微生物發酵類型及培養基連續發酵先作分批培養，讓單級連續培養進入穩定狀態后，細胞的比生長速率與稀釋率相等。連續培養的最大特點：微生物細胞的生長速率、產物的代謝均處于恒定狀態，可達到穩定、高速培養微生物細胞或生產大量的代謝產物的目的。生產率得以提高。111微生物發酵類型及培養基單級連續培養進入穩定狀態后，細胞的比生長速率與稀釋率相等。13．補料分批發酵

在分批培養過程中，間歇或連續地補加新鮮培養基，而不從發酵罐中間斷地放出培養液的培養方法。工業上利用分批補料培養以消除阻遏并保持通氣條件。分批補料培養還可以防止培養基中某一組分的毒性。112微生物發酵類型及培養基3．補料分批發酵19微生物發酵類型及培養基113微生物發酵類型及培養基20微生物發酵類型及培養基培養基：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的，按一定比例配制的多種營養物質的混合物。5.2培養基選擇和配制的原則114微生物發酵類型及培養基5.2培養基選擇和配制的原則21微生物發酵類型及培養基一、培養基的類型和用途基礎，繁殖和鑒別培養基天然合成和半合成孢子，種子和發酵培養基根據來源根據目的根據生產工藝115微生物發酵類型及培養基一、培養基的類型和用途基礎天然根據來源根據目的根據生22微生二.培養基的選擇231從微生物的特點來選擇從生產和科研的要求選擇從經濟效益方面考慮116微生物發酵類型及培養基二.培養基的選擇231從微生物的特點來選擇從生產和科研的要求對培養基的要求提供合成細胞和發酵產物的基本成分利于減少培養基原料的單耗利于提高培養及產物的濃度利于減少能耗減少副產物，利于產品的分離純化利于提高產物的合成速率三．培養基的配制原則117微生物發酵類型及培養基對培養基的要求利于減少培利于提高培養減少副產物，利于提高產三適當配比滲透壓pH氧化還原電位營養需要原則118微生物發酵類型及培養基滲透壓pH營養原則25微生物發酵類型及培養基典型培養基119微生物發酵類型及培養基典型培養基26微生物發酵類型及培養基

完善的培養基設計是實驗室的實驗，實驗工廠的放大和生產規模中的一個重要步驟。

培養基的組成必須滿足細胞的生長和代謝所需的元素，并能提供生物合成和細胞維持活力所需要的能量。5.3培養基的設計120微生物發酵類型及培養基5.3培養基的設計27微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源物質碳源物質氮源物質無機鹽和微量元素121微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源氮源無機鹽和微量28微生物發酵類一.培養基的成分5678生長因子前體促進劑和抑制劑水分122微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分5678生長促進劑和29微生物發酵類型光能：光能自養微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發酵等氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽等是

化能自養微生物的能源。碳水化合物等有機物、石油、天然氣及石油化工產品是異養微生物的能源。1能源物質123微生物發酵類型及培養基光能：光能自養微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發酵。碳源細胞碳骨架產物能源

2.碳源物質主要包括：糖類，脂類，有機酸，低碳糖等124微生物發酵類型及培養基。碳源細胞碳骨架產物能源2.碳源物質主要包括：糖類，蔗糖麥芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖類碳源脂類有機酸類125微生物發酵類型及培養基蔗糖麥芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖類脂類有機32微生物發酵類型及有機氮和無機氮作用菌體細胞結構含氮代謝產物細胞提供能源3氮源物質126微生物發酵類型及培養基有機氮和無機氮作用菌體細含氮代細胞提3氮源物質33微生物發花生餅粉，黃豆餅粉，棉籽餅粉，酵母粉，麥麩，魚粉，蠶蛹粉，玉米漿，蛋白胨，尿素，廢菌體和酒糟氨水，銨鹽和硝酸鹽有機氮

無機氮127微生物發酵類型及培養基花生餅粉，黃豆餅粉，氨水，有機氮無機氮344．無機鹽和微量元素磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，錳等。較低濃度對細胞的生長和產物合成有促進作用，而在高濃度時常表現出顯著的抑制作用128微生物發酵類型及培養基4．無機鹽和微量元素磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，作用酶的激活劑生理活性物質的調節劑生理活性物質的組成129微生物發酵類型及培養基作用酶的激活劑生理活性生理活性36微生物發酵類型及培養基輔酶的組成成分高能化合物緩沖劑細胞結構磷酸鹽的作用130微生物發酵類型及培養基輔酶的組高能緩沖劑細胞結構磷酸鹽37微生物發酵類型及培養基硫含硫氨基酸許多酶的輔酶的活性基

產物硫酸鈉硫代硫酸鈉131微生物發酵類型及培養基硫含硫氨基酸許多酶的輔酶的活性基產物硫酸鈉硫代38微己糖磷酸化酶，檸檬酸脫氫酶，羧化酶等的激活劑。2是鏈霉素發酵的必需元素3鋅是維生素B12的激活劑，可以促進產物合成4鈷維持細胞滲透壓5鉀和鈉影響細胞膜的透性；鈣還影響磷酸鹽的濃度6細胞色素，細胞色素氧化酶，過氧化物酶等的組成成分，是微生物有氧氧化的必不可少的元素1鐵鎂鉀和鈣132微生物發酵類型及培養基己糖磷酸化2是鏈霉素3鋅是維生素4鈷維持細5鉀和鈉影響細6細微生物生長不可缺少的微量有機物，稱為生長因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，維生素等。作用：構成細胞的組成成分，促進生命活動的進行。

5．生長因子133微生物發酵類型及培養基5．生長因子40微生物發酵類型及培養基1）生物素

作用：影響產生菌細胞膜的通透性，同時影響菌體的代謝途徑。一般5μg/L。134微生物發酵類型及培養基1）生物素41微生物發酵類型及培養基生物素過量

不足不產或少產谷氨酸產乳酸或琥珀酸長菌快，pH低，尿素消耗多菌體生長不好谷氨酸產量低弱發酵向乳酸發酵轉換135微生物發酵類型及培養基生過量不足不產或少產谷氨酸菌體生長不好42微生物發2）維生素B1：對某些菌種發酵有促進作用。3）天然原料：玉米漿，0.4-0.8%

麩皮水解液，1%

糖蜜，0.1-0.4%

酵母136微生物發酵類型及培養基43微生物發酵類型及培養基

某些化合物被加到培養基后，能夠直接在生物合成過程中結合到產物分子中去，而自身的結構并未發生太大的變化，卻能提高產品的產量。這類小分子物質稱為前體。6．前體137微生物發酵類型及培養基某些化合物被加到培養基后，能夠直接在生物合成過程中結138微生物發酵類型及培養基45微生物發酵類型及培養基7．促進劑和抑制劑促進劑是一類刺激因子，他們并不是前體或營養，其加入可以影響微生物的正常代謝，或促進中間代謝產物的積累，或提高次級代謝產物的產量。常用的促進劑誘導物，表面活性劑，乙二胺四乙酸，大豆油抽提物等。139微生物發酵類型及培養基7．促進劑和抑制劑促進劑是一類刺激因子，他們并常用的促進劑誘在發酵過程中，加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時刺激另一代謝途徑，以至于可以改變微生物的代謝途徑。140微生物發酵類型及培養基47微生物發酵類型及培養基141微生物發酵類型及培養基48微生物發酵類型及培養基8．水分參與細胞內一系列化學反應2有效控制細胞內的溫度變化3維持大分子的天然構象4脫水作用和水合作用控制有多亞基組成的結構5溶劑和運輸介質的作用1142微生物發酵類型及培養基8．水分參與細2有效控3維持大4脫水作用5溶劑和149微生物微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵工程5微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉水解糖的制備基因工程菌的不穩定性及對策5微生物發酵類型及培養基144微生物發酵類型及培養基微生物發酵的類型和方式培養基選擇和配制的原則培養基的設計淀粉一.培養基的成分1234能源物質碳源物質氮源物質無機鹽和微量元素145微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分1234能源氮源無機鹽和微量52微生物發酵類一.培養基的成分5678生長因子前體促進劑和抑制劑水分146微生物發酵類型及培養基一.培養基的成分5678生長促進劑和53微生物發酵類型

嚴格控制營養物質的濃度和比例，不僅僅是為了維持正常的滲透壓，節約原料，而且直接影響到菌體的繁殖和產物積累。二．營養物質的調節147微生物發酵類型及培養基嚴格控制營養物質的濃度和比例，不僅僅是為了維持正1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的關系3

碳氮比例的調節4前體的控制5補料148微生物發酵類型及培養基1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的關系31).不同碳源的利用速度

能夠被微生物快速利用的碳源稱為速效碳源，反之為遲效碳源。利用速度依次為：葡萄糖---乳酸----乳糖149微生物發酵類型及培養基1).不同碳源的利用速度56微生物發酵類型及培養基

微生物對氮源的利用速度為：氨態氮----硝態氮----有機氮。

氨的過高過低都會對產物形成造成不良的影響。

氮源的利用速度與碳源的利用速度是很有關系的。

糖代謝的許多中間產物是氨基酸合成的前體。2).氮源利用和碳源利用的關系150微生物發酵類型及培養基2).氮源利用和碳源利用的關系57微生物發酵類型及

生產上多采用控制碳氮比例以滿足菌體的大量繁殖，又能大量形成產物。

酵母細胞的碳氮比為：100：20；霉菌細胞的碳氮比為：100：10。

發酵培養基的碳氮比約為：100：0.2-2.0。

谷氨酸生產中的碳氮比約為：100：15-21。3).碳氮比例的調節151微生物發酵類型及培養基生產上多采用控制碳氮比例以滿足菌體3).碳氮比例的4).前體的控制

加入量加入方式菌種前體152微生物發酵類型及培養基4).前體的控制加入量加入方式菌種前體59微生物發酵類型及培補料豐富培養基產物合成的旺盛期延長控制pH和代謝方向改善了通氣效果解除終產物反饋5)補料153微生物發酵類型及培養基補料豐富培養基控制pH和代謝方向改善了通氣效果解除終產物反饋補料的物質碳，氮和水及其他物質。碳源有葡萄糖，飴糖，蔗糖，糊精，淀粉，油脂等。補料氮源有氨水，硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨，花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿和尿素等。補料的方法關鍵是控制補料時間，速率和配比。其目的是不使菌體生長過快，僅僅維持呼吸，但是仍能合成產物。154微生物發酵類型及培養基補料的物質碳，氮和水及其他物質。碳源補料的方法關鍵是控制補料碳源和能源+氮源+其他需要

細胞+產物+CO2+H2O＋熱量

組成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，這些元素都要在方程中予以平衡。培養基中還需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。三．培養基的設計155微生物發酵類型及培養基碳源和能源+氮源+其他需要三．培養基的設計62微生物發酵類156微生物發酵類型及培養基63微生物發酵類型及培養基

對于無力合成的生長因子，要通過在培養基中加入適量的純凈物或含有該物質的混合物。

碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用。在需氧的條件下對碳源的需要量可以通過菌體得率系數推算而得157微生物發酵類型及培養基對于無力合成的生長因子，要通過在培養基中加入適量的純

二糖低聚糖葡萄糖淀粉水解糖

工業上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化。5.4淀粉水解糖的制備158微生物發酵類型及培養基二糖低聚糖葡萄糖淀粉工業上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為發酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外觀要潔凈，透明，呈淡黃色；不可變質。制備淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麥，大米和薯類等。159微生物發酵類型及培養基發酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外水解適度控制蛋白量新鮮潔凈質量160微生物發酵類型及培養基水解控制新鮮質量67微生物發酵類型及培養基方法酸解法酶解法酸酶結合法161微生物發酵類型及培養基方法酸解法酶解法酸酶68微生物發酵類型及培養基1.淀粉水解糖對發酵的影響水解不完全：浪費，逃液，染菌。水解過度：產生羥甲基糠醛，進而形成類黑素，不僅浪費，而且抑制菌體生長。

淀粉原料中蛋白含量過多，當糖液中和，過濾時除去不徹底，會引起發酵逃液和染菌。162微生物發酵類型及培養基1.淀粉水解糖對發酵的影響69微生物發酵類型及培養基葡萄糖的理論收率：111%指標實際收率葡萄糖值淀粉轉化率2.淀粉制糖過程中考察的指標163微生物發酵類型及培養基葡萄糖的理論收率：111%指實際葡萄糖值淀粉2.淀粉制糖過程

實際收率=[糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）]X100%

轉化率=[糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X1.11]X100%

DE值=還原糖（%）/干物質含量（%）164微生物發酵類型及培養基71微生物發酵類型及培養基以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉化為葡萄糖的方法。優點：生產簡單，方便，水解時間短，設備生產能力大。缺點：要求特殊設備；易產生副反應；對原料要求高原理：淀粉各種糊精麥芽糖

葡萄糖

二淀粉酸水解法165微生物發酵類型及培養基以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉化為葡萄糖的方法。二淀粉

影響水解反應速率的關鍵因素：

溫度酸的濃度多糖的水解常數酸的種類因素166微生物發酵類型及培養基

影響水解反應速率的關鍵因素：

多糖的酸的種類因素淀粉５’－羥甲基糠醛乙酰丙酸+蟻酸+有色物質等。

其它副反應縮短反應時間，控制反應ｐＨ，降低葡萄糖的濃度減少167微生物發酵類型及培養基其它副反應縮短反應時間，減少74微生物發酵類型及培養基

葡萄糖二糖，三糖和其他低聚糖酸和熱

復合反應異麥芽糖和龍膽二糖降低葡萄糖的收率，發酵的殘糖增加，抑制菌體生長和產物形成，增加提取和精制的難度168微生物發酵類型及培養基葡萄糖二糖，酸和熱復合反應異麥芽糖和龍２．工藝原料中和脫色過濾除雜糖液調漿糖化冷卻10.5-12Bé0.6-0.7%，

pH1.5左右糖化時間=達到最大葡萄糖值時的時間-放料時間。燒堿或純堿中和溫度為60-70℃，中和pH4.6-5.0.活性炭，淀粉