微生物的適應性進化微生物的適應性進化微生物的適應性進化V:1.0精細整理，僅供參考微生物的適應性進化日期：20xx年X月微生物的適應性進化適應進化又稱定向進化"實驗室進化或馴化，是目前備受矚目的菌種改良技術，能夠使菌株在較短的時間內有效地改變菌株的某些表型或生理特性（如菌體生長速度，底物消耗速度，耐受高溫高低pH值以及不同有機溶劑等），并且基本不會影響除目的表型外的其他優良性狀。目前實驗室最常用的適應進化方法是在特定條件（給予選擇壓力）下將微生物連續傳代培養，通過菌株自發突變的不斷富集，獲得適應特定條件的表型或生理性能。在微生物進化過程中，選擇壓力的存在可以保證微生物在與選擇壓力的相互作用下，菌種的隨機變異實現定向淘汰，與環境相適應的基因型得以保存，特別是在人工選育過程中，通過人工施加定向的選擇壓力，使微生物沿著所需的方向的進化，從而獲得目標性狀的菌種。乙酸作為細胞毒素經常在很多生物過程中作為副產物不斷積累，乙酸濃度逐漸升高的環境壓力存在于許多工業微生物領域。以生物乙醇的生產為例，副產物乙酸會嚴重抑制乙醇的生產，PeterSteiner等人將不耐受乙酸的野生型Acetobacteraceti進行適應性進化實驗，將逐漸提高濃度的乙酸作為選擇壓力，經過240代的適應性進化，獲得了能夠耐受50g/L濃度的乙酸的菌株。Hillesland和Stahl首次將脫硫弧菌和產甲烷菌混合培養300代來研究混菌體系的進化歷程，脫硫弧菌為產甲烷菌提供氫離子，產甲烷菌通過消耗氫離子為脫硫弧菌提供適宜生存的條件，兩者通過代謝產物的交流實現專性的互利關系。雖然兩種菌株都是從共生微生物體系中分離，但是它們是從不同的環境中分離出來，而且單獨培養。將這一嚴格互利共生的混菌體系進行適應性進化實驗，其實驗核心就是將體系中的一種微生物作為另一微生物的選擇壓力進行了實驗設計，這種生物選擇壓力的存在能夠使適應彼此物質代謝交流的菌種得以保存和擴大種群優勢，進化后的混菌體系生長速率提高了80%，生物量提高了30%。單菌多次級代謝產物策略在“沉默代謝途徑”的應用在非自然條件下，微生物中很多編碼次級代謝產物的基因簇是保持沉默的。在細菌和真菌中有關次級代謝產物合成的基因簇數目遠遠大于實驗室條件下實際合成的天然產物的數目[29]。毫無疑問，這些沉默的基因簇是發現活性藥物組分的巨大資源庫，如何激活這些未表達或者表達量比較低沉默基因將是我發現新化合物的一種重要途徑。早期的發酵科學就發現培養基的改變會影響微生物次級代謝產物的數量及質量培養基微小的變化不僅能影響到主代謝產物，甚至能影響微生物代謝產物的類型，在單菌多次級代謝產物(Onestrainmanycompounds，OSMAC)策略的指導下，通常采用改變培養基，添加微量元素、前體化合物或酶抑制劑等，以及改變培養條件等方法實現增加化合物種類和數量的目的。通過基因組學的研究同樣表明由于在實驗室單一或者相近的培養條件下，微生物中存在大量常規培養條件下未表達的代謝途徑，叫著“沉默代謝途徑”，進而造成微生物資源的浪費。改變微生物生長的微環境可以激活菌株的“沉默代謝途徑”提高微生物次級代謝產物的多樣性。德國Gottingen大學的Zeeck小組提出了單菌多次級代謝產物(Onestrainmanycompounds，OSMAC)策略，并對微生物株放線菌、的培養基，培養條件，添加前體或酶抑制劑等方法進行了研究，共獲得了25類100余個化合物[32]，許多化合物是傳統培養方法無法獲得的。Sarkar等研究了模式真菌A.nidulans在恒化器中連續發酵,通過維持微生物較慢的生長速度,改變培養基中硝酸鹽(N源),磷酸鹽(P源),葡萄糖(C源)等成分的濃度,發現兩個原本沉默的聚酮合酶基因表達出了9個多酚類化合物。其中一個新化合物是烯化的苯甲酮衍生物(preshamixanthone),可能是氧雜蒽酮代謝途徑的一個中間體,表明不同的培養條件可以誘導沉默的聚酮合基因表達[33]。Russell等在枝孢芽枝菌(Cladosporiumcladosporioides)培養基中加入微生物表觀遺傳調控劑DNA甲基化酶抑制劑-5-azacytidine(氮雜胞苷)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑-suberoylanilidehydroxamicacid(SAHA)，并分析和分離了發酵液的次級代謝產物，結果顯示兩種表觀遺傳調控劑可以產生不同的次級代謝產物，加入5-azacytidine能夠產生羥脂類化合物，而加入SAHA后能夠產生7個二萘嵌苯醌類化合物，其中2個是新化合物[34]。研究表明擬莖點菌屬Phomopsissp.的一些菌株能夠產生具有生物活性的二苯并吡喃酮[35]，Phomopsidin類化合物[36]。ChristianOE[37]等所采集的同屬天門冬擬莖點菌Phomopsisasparagi在實驗室海水培養基的條件下并沒有產生上述標志性的化合物，因此采取了(Onestrainmanycompounds，OSMAC)策略，通過加入促微絲聚合劑，得到了一系列Chaetoglobosins類化合物。SchieweHJ[38]等通過改變培養瓶及通氣條件，從鏈霉菌屬G?40/10菌株的代謝產物中分離得到一系列化合物，并證明由于培養基的改變，之前沉默的生物合成基因簇被打開，出現了新的生合成路徑。Jens等[39-40]研究發現赭曲霉屬DSM7428菌株在常規培養條件下，只得到了一種化合物，且產量較低，通過采用(Onestrainmanycompounds，OSMAC)策略，改變培養條件，如使用不同的培養瓶，改用靜態培養等方法，使化合物產量由原來的8mg/L提高至94mg/L，并且產生了豐富的產物（14種）。海洋真菌Libertellasp與細菌a-proteobacterium聯合培養后，得到了分別培養所沒有得到的化合物，這些化合物對白色念珠菌僅有微弱的抗菌活性，但是對人結腸癌HCT-116具有較強的細胞毒活性[41]。這些研究均表明通過改變微生物的培養條件，能夠誘導微生物次級代謝產物新的合成途徑，是發現新的天然產物的有效手段，并且由此提出了(Onestrainmanycompounds，OSMAC)理論，為深入開發放線菌天然產物提供了切實可行的新思路。N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)是鏈霉菌初級代謝中C源和N源主要來源之一,天藍色鏈霉菌相對于葡萄糖也更偏好于利用N-乙醜葡萄糖胺作為碳源,N-乙酰葡萄糖胺也是細胞壁肽聚糖的主要組分之一。在富營養培養基(如R2YE)中,N-乙酷葡萄糖胺完全阻斷天藍色鏈霉菌菌絲體生長以及抗生素產生,在寡營養培養基(如MM)中卻又能刺激天藍色鏈霉菌產生抗生素和形成孢子。研究發現導致這種現象的原因是由全局性調控因子GntR家族DasR蛋白介導調控N-乙酰葡萄糖胺的代謝以及抗生素的合成。N-乙酰葡萄糖胺主要有兩個來源,一個是富營養培養基中幾丁質的分解,另一個是營養菌絲中細胞壁的降解。細胞壁的降解造成了N-乙酰葡萄糖胺的大量積累,經過一系列的酶促反應之后生成了6-酸葡萄糖胺,6-酸葡萄糖胺作為配體致使抑制蛋白DasR從actII-0RF4和redZ的啟動子上脫離,由其阻遏的actinorhodin(Act)和undecylprodigbsin(Red)基因簇得以激活表達[42]。因此,6-磷酸葡萄糖胺信號通路的發現,不僅在分子水平上揭示了鏈霉菌生長分化和次級代謝之間的聯系,也為激活鏈霉菌次級代謝基因簇開辟了一條新的途徑。莽草酸是芳香族氨基酸生物合成途徑(又稱莽草酸途徑)的中間代謝產物,其生物合成與磷酸戊糖途徑生成的四碳糖有關。磷酸戊糖途徑的中間產物赤醉糖-4-磷酸和糖酵解過程的中間產物磷酸烯醇式丙酮酸,在醛縮酶的作用下縮合形成3-脫氧-n-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸,經過脫氨奎尼酸合酶脫磷酸環化形成5-脫氫奎尼酸,在5-脫氫奎尼酸脫水酶的作用下脫水生成5-脫氫莽草酸,最后加氫后形成莽草酸。KimberleeK等[43]、DJwilson等[44]研究發現莽草酸經脫水、加氫、電子重排等反應生成3,4-二輕基環己烷羧酸,后者是子囊霉素生物合成的起始單位。3,4-二輕基環己烷羧酸C-4位甲基化發生在子囊霉素組裝基本完成后[43]。雷帕霉素中環己烷羧酸部分的生物合成過程與子囊霉素中環己烷羧酸部分合成過程相同,都來源于莽草酸。ChengYR等研究了雷帕霉素合成中L-外源苯丙氨酸的添加反饋抑制了雷帕霉素起始單元環己烷的來源-莽草酸的合成[45]。營養學研究也表明57mmol/L外源莽草酸能刺激雷帕霉素的生物合成,比對照產量增加125%[46]。微生物只有在適宜的環境條件下才能正常生長繁殖。在發酵生產中，除培養基成分及其濃度外，只有環境條件能夠被直接調控，發酵過程中的溫度，pH值，溶氧，金屬離子，表面活性劑等變量都能夠對微生物的繁殖，代謝活動造成影響，因此可以通過發酵條件的調控來使次級代謝產物產物的量增加或者得到新的次級代謝產物。溫度對微生物的影響是多方面的，不僅影響微生物的生長繁殖，而且也影響到微生物的代謝，溫度對產物合成的影響在過程優化中溫度對生長和生產的影響是不同的，一般發酵溫度升高，酶反應速率增大，生長代謝加快，生產期提前。但酶本身很易因過熱而失去活性，表現在菌體容易衰老，發酵周期縮短，影響最終產量。溫度除了直接影響過程的各種反應速率外，還通過改變發酵液的物理性質，例如，氧的溶解度和基質的傳質速率以及菌對養分的分解和吸收速率，間接影響產物的合成。溫度還會影響生物合成的方向，例如，四環素發酵中金色鏈霉菌同時能生產金霉素，在低于30℃,合成金霉素的能力較強。合成四環素的比例隨溫度的升高而增大，在35℃時只產生四環素[47]。本研究為了考察不同溫度對TRM40136次級代謝產物的影響設計了以下：23℃、28℃、30℃、27℃、41℃五個不同溫度來研究。不同菌種及同一菌種的不同發酵階段，菌體的需氧量是不同的，發酵液中的溶氧濃度會直接影響微生物酶的活性及代謝途徑，進而影響菌體的生長和代謝產物的積累，并最終決定產量的高低[48]。徐慶陽[49]等以L-蘇氨酸生產菌TRFC為菌種發酵生產蘇氨酸，考察了不同溶氧水平對L-蘇氨酸合成的影響。其結果表明，供氧充足、菌體呼吸旺盛可保持較快的生長速率，此外，L-蘇氨酸的前體物草酰乙酸主要由對氧濃度要求較高的TCA循環和磷酸烯醇丙酮酸羧化反應提供，充分供氧可使菌體呼吸充足，有利于產酸和糖酸轉化。本研究為了考察不同裝液量對TRM40136次級代謝產物的影響設計了以下：50ml/500ml，100ml/500ml，150ml/500ml，200ml/500ml，250ml/500ml五種裝液量來研究。pH對微生物的生命活動有很大的影響,主要通過幾個方面實現:一是使蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷發生變化,從而影響其生物活性;二是引起細胞膜電荷變化,導致微生物細胞吸收營養物質能力改變;其三是改變環境中營養物質的可給性及有害物質的毒性.不同微生物對pH條件的要求各不相同,它們只能在一定的pH范圍內生長,這個pH范圍有寬、有窄,而其生長最適pH常限于一個較窄的范圍,對pH條件的不同要求在一定程度上反映出微生物對環境的適應能力[50]。本研究為了考察不同pH值對TRM40136次級代謝產物的影響設計了以下：pH=5、pH=6、pH=7、pH=8、pH=9五種pH進行發酵研究。。微生物在生長和繁殖過程中需要