細胞工程綜合實驗報告小鼠腹腔巨噬細胞和腎臟細胞的原代培養TOC\o"1-5"\h\z班級 XXXX姓名 XXXX學號 XXXXXXXXXX指導教師 XXXX實驗時間 XXXX成績 小鼠腹腔巨噬細胞和腎臟細胞的原代培養姓名學號班級一、實驗目的了解細胞原代培養培養的基本方法和操作過程。初步掌握培養過程中的無菌技術。了解在相差顯微鏡下觀察培養細胞的形態和生長狀況。二、實驗原理原代細胞培養是指直接從動物體內獲取的細胞、組織和器官，經體外培養后，直到第一次傳代為止。這種培養，首先用無菌操作的方法，從動物體內取出所需的組織（或器官），經消化，分解成單個游離細胞，在人工培養下，使其不斷的生長及繁殖。細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度與滲透壓的調節。二是嚴格控制無菌條件。巨噬細胞屬天然免疫細胞，具有趨化運動、吞噬、分泌和參與免疫調節等功能，是科學工作者研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周多用做原代培養，不易長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。目前，單核巨噬細胞株也有，比如RAW264.7，但價格比較貴，且保存也不方便。培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，目前以小鼠腹腔取材法最為實用，而目前獲取小鼠巨噬細胞的方法有兩種，一種是直接用培養液灌洗實驗動物腹腔，從腹腔灌洗液中分離巨噬細胞，還有一種方法向動物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，礦物油，PRMI1640培養液等），這樣使機體產生大量巨噬細胞后再腹腔灌洗，但由于許多刺激物能激活巨噬細胞，而被激活的巨噬細胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬細胞培養用于培養時，細胞中的刺激物不能很快被消化而殘留在細胞中，影響細胞代謝，同時也不能很好的模擬體內環境，所以我們直接用培養液灌洗實驗動物腹腔，從腹腔灌洗液中分離巨噬細胞。腎臟細胞:所有組織中都有一定量的細胞間質（纖維和基質等），對細胞生長有妨礙作用，用胰酶消化能出去間質，使組織松散成單個細胞或小的細胞團，細胞易于生長。三、主要試劑小鼠1只、PRMI1640培養基、胰蛋白酶和EDTA、PBS緩沖液、青霉素、鏈霉素、75%酒精、蒸餾水四、儀器設備解剖盤、鑷子、剪子、手術刀、蓋玻片、吸管、顯微鏡、無菌操作臺、5ml注射器、注射針、試管、培養瓶等。二氧化碳培養箱、生物顯微鏡、高速冷凍離心機、低溫冰箱五、實驗步驟溶液的配置小鼠腹腔巨噬細胞原代培養1、 以頸椎脫臼法處死小鼠。2、 手提鼠尾將其全浸入75%乙醇中10s,倒立小鼠并向腹腔內注射預冷至培養液5ml（注意針尖勿傷及內臟），仰臥平放并輕揉小鼠腹部2?3min，靜置5?7min。3、 置小鼠于解剖臺,用針頭固定四肢,在腹股溝區作一橫切口,撕裂皮膚以完全暴露出腹膜壁，但勿傷及腹膜壁。4、 用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動，并促使巨噬細胞從腹腔的漿膜表面釋放，形成細胞懸液。5、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。6、 小心拔出針頭，把腹腔液注入離心管中。7、 將細胞懸液于4°C、1000r/min離心5min,棄上清，取3ml的加雙抗的培養基進行吹打，放入培養瓶中，再在培養瓶中加入2ml的培養基。8、 將擰緊口的細胞培養瓶放進CO培養箱中，然后，將瓶口松1.5圈（保證細胞呼吸），2平放著混勻細胞，過夜培養。9、 第二天進行細胞換液；第三天觀察細胞生長情況并拍照。腎臟細胞的原代培養1、用品消毒后，安放在超凈工作臺內，紫外線消毒，做好洗手等準備工作。2、點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等3、取材取新生乳鼠一只，采用頸椎脫臼法處死，然后把這個小鼠入盛有75%酒精的燒杯中10秒，隨即攜入超凈工作臺內。在超凈工作臺內取出小鼠，置于消毒培養皿中打開消毒器械包用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚，用解剖剪剪開腹腔，充分暴露腹腔，用另一鑷子輕輕夾起腸管，翻置一側，充分暴露位于腹腔背壁脊柱兩側的腎臟取下雙側腎臟，放入消毒培養皿中（去除腎盂、腎門和腎外表皮）用吸管吸取PBS加入培養皿中，清洗腎臟3次，盡量去掉血污再將腎組織用解剖剪剪成幾塊再用PBS漂洗，去凈血液為止。4、消化將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶內反復剪切組織直至lmm3大小的組織塊加入5-8倍量（體積）的0.25%胰蛋白酶，蓋好放入37C細胞培養箱中消化30分鐘，注意應每隔10分鐘振搖一次。當組織塊變得疏松，顏色略白時，取出置于超凈工作臺內靜置后用吸管吸去上清，加入一定量的培養液終止消化，反復吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細胞團或單個細胞狀態，讓未消化完的組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入消毒離心管中離心。5、離心離心管平衡后，以1000轉/分離心10分鐘，超凈工作臺內開蓋，吸取上清液加入5ml培養液，蓋蓋，注意應有空隙，標明細胞名稱，代數，日期，將培養瓶置于37C細胞培養箱中過夜培養。6、第二天進行細胞換液；第三天觀察細胞生長情況并拍照。六、實驗結果小鼠巨噬細胞（六）小鼠腎臟細胞（六）七、分析和討論由以上實驗結果可知，我組的實驗很成功（基本上掌握了本次實驗涉及的所有技術）。培養生長出來了較多較大的巨噬細胞，可以清晰地看到一粒粒的梭形巨噬細胞呈現在眼前，非常的清楚明了，甚至可以作為標本。說明此次巨噬細胞的培養特別成功當然也得到了一定量的腎臟細胞，只是相對來說比較明顯的腎臟細胞的量較少，且只看到了一個。分析原因：液體培養基在分裝過夜處理時可能是染菌了，不能用來進行小鼠細胞的培養，只能借助于其他組的，其次在操作過程中也損失了部分腎臟細胞。八、心得體會1、細胞實驗操作的實驗要求要無菌操作盡量避免感染雜菌。2、本次實驗的過程設計由我們各組自己查閱文獻制定具體方案，所以，我們在操作過程中更能知道實驗中每一個步驟的原理和目的，收獲更大。3、為了防止器皿表面的雜菌污染里面的細胞或培養液，在開蓋前，先用75%的酒精擦拭瓶蓋