對家蠶（鱗翅目：蠶蛾科）的兩種毒性敏感測試方法的比較（中文翻譯）摘要：家蠶不但是一種在經濟上十分重要的昆蟲，而且是研究殺蟲劑對周圍環境影響的理想非靶標生物。，用兩種毒性敏感測試方法浸葉法和定量噴霧法對五種殺蟲劑進行測試，將它們的農藥風險評估結果進行比較得出兩種方法的不同之處。基于用上述兩種方法對五種殺蟲劑測試得出的半數致死濃度，可以得出五種殺蟲劑對家蠶的毒性水平的次序結果如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽>高效氯氟氰菊酯>吡蟲啉>毒死蜱>樂果。用浸葉法和定量噴霧法測試的殺蟲劑個體的平均相對置信區間值是分別是：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（22.55%和19.03%），高效氟氯氰菊酯（18.03%和17.71%），吡蟲啉（19.21%和16.96%），毒死蜱（17.20%和15.97%）和樂果（17.78%和15.81%）。而它們的變異系數值分別是甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（17.74%和5.44%），高效氟氯氰菊酯（21.15%和5.16%），吡蟲啉（13.01%和5.65%），毒死蜱（16.72%和4.85%）和樂果（28.36%和7.93%）。本次研究的結果表明定量噴霧法在精確性和再現性上比浸葉法更加好。這次研究的結果為人們在農藥風險評估上選擇一種更加科學和理性的方法提供了十分有用的參考。簡介家蠶，屬于鱗翅目大蠶蛾科，是一種具有重要經濟價值的昆蟲。作為絲綢的主要生產者，家蠶在蠶業中充當著主要貢獻者的角色已經有5700年的歷史了，并且絲綢產業是中國一個重要的經濟收入來源。目前，中國不僅擁有著世界最大桑樹種植面積而且是世界上最大的絲綢生產國。據估計，在2013年中國生產了648300噸的蠶繭，總值大約40億美元。家蠶是一種對殺蟲劑等對環境有害的東西非常敏感的生物，尤其是當它們處在一個隔離的環境中很長一段時間的時候。因此，家蠶是研究殺蟲劑的環境評估的理想非靶標生物。殺蟲劑的風險評估對家蠶來說是非常重要的，因為桑樹的葉子隨時隨地都有可能暴露在殺蟲劑的污染中。如果家蠶的幼蟲吃到了受殺蟲劑污染的桑葉，那將會對家蠶種群的生存造成嚴重的影響，這會直接嚴重地影響到絲綢工業的產量。近幾年來，家蠶被毒死的現象頻繁地出現，這引發了人們對環境安全的不斷關注。也正因為如此，越來越多的研究集中在殺蟲劑對家蠶的影響，而與此相關的測試方法也在不斷地改進。很多測試方法在對殺蟲劑影響家蠶的毒性大小的判定上做了改進，如夾心葉法，殘膜法，浸葉法和熏蒸法等。其中，浸葉法是最經典的一種而且是中國國家環境保護總局推薦的測試方法。另一方面，一種最近發展起來的新方法，定量噴霧法，仍然需要更深入的研究和擴展。總所周知，目前還沒有人同時運用浸葉法和定量噴霧法在農藥風險評估上對殺蟲劑進行影響家蠶的毒性判定。因此，這次研究是為了將兩種毒性敏感測試方法做一個比較，從而找出一種為殺蟲劑風險評估生成數據的更好的方法。材料和方法測試昆蟲。春雷X珍珠，這兩種在中國用來大規模商業家蠶養殖的品種將會被用作試驗。從山東省廣通蠶種集團有限公司獲得的這兩種家蠶品種對大多數殺蟲劑都很敏感這些家蠶品種在我們實驗室中使用超過10年了，因此我們對它們的飼養管理和各種問題的處理有著豐富的經驗。這些家蠶最初獲得時還是一個個的蠶卵并被貯藏在冰柜中，只有在使用時才會把蠶卵取出來。蠶卵在合適的條件下會孵化出家蠶幼蟲來，家蠶幼蟲在實驗室控制的環境條件下飼養。實驗室控制的環境條件如下如下，溫度：25±2℃；相對濕度：70-80%；光照時間：16小時：8小時（光照：黑暗）。要注意確保每只家蠶幼蟲同時蛻皮并且個體差異要盡可能小。家蠶幼蟲每天要用從山東農業大學的桑園里采集的沒有被殺蟲劑處理過的成熟的桑葉喂四次，收集具有相似大小和體重的新蛻皮的二齡幼蟲用作試驗。化學品。被選擇用做測試的下列五種殺蟲劑，分別屬于四種不同的殺蟲劑類型。五種殺蟲劑分別是：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（純度：95%），高效氟氯氰菊酯（純度：94.8%），吡蟲啉（純度：95.4%），毒死蜱（純度：96%）和樂果（純度：98%）。所有殺蟲劑都是由農業部農藥檢定所提供。每種殺蟲劑都準備了一份新鮮的貯備溶液，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、高效氟氯氰菊酯、吡蟲啉和毒死蜱的0.1%貯備溶液是用丙酮和吐溫80稀釋的，而樂果的1%貯備溶液則是用蒸餾水稀釋的。隨后溶液的稀釋都用蒸餾水來進行。試驗步驟。浸葉法的步驟如下：首先將從桑樹采摘下來的清潔健康的桑葉放在經過處理的一定劑量的殺蟲劑沉浸10秒鐘。然后，將經過風干處理的桑葉平放在溫室培養皿上。將家蠶幼蟲小心地放置在被處理過的桑葉頂部，并且在允許它們在96小時內吃這些被殺蟲劑處理過的桑葉。定量噴霧法的步驟如下：將重2-3g的新鮮有光澤的桑葉用殺蟲劑噴霧處理。殺蟲劑被均勻地噴在桑葉的背面，初始噴霧量為2ml，實驗室噴霧塔的標準參數設為7個噴霧壓力和20s的液滴沉積時間。每片桑葉都要單獨稱重，在噴藥前和噴藥后立即用精確的秤來確定重量，使在每片桑葉上殺蟲劑應用的劑量被精確確定，為了降低桑葉的干燥速度，每個經過風干處理的桑葉的葉脈都插入了一個1.5ml的填充著1%瓊脂的離心管。將被處理過的桑葉平放在每個培養皿中，用殺蟲劑處理過的葉面朝上。用軟刷將二十只家蠶幼蟲小心地放在每一片桑葉的頂部。劑量的管理。總的來說，每種殺蟲劑在試驗中都有五種濃度，在表一中已經詳細列出來了，每種濃度之間相差的幾何級數為2，每種濃度都要用20只家蠶幼蟲進行三次重復試驗。另外，水對照組還有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、高效氟氯氰菊酯、吡蟲啉、毒死蜱和樂果的溶劑對照組都在需要的實驗組中設置了。曝光條件。在實驗里，曝光籠子是一個直徑15厘米、高3厘米的溫室培養皿。培養皿在使用前要徹底清洗干凈，確保沒有任何殺蟲劑殘留的痕跡。用于定量噴霧法實驗的培養皿在試驗中要一直處在打開的狀態，以避免殺蟲劑蒸汽在里面蓄積的可能情況。培養皿放置在與飼養條件一樣的氣候控制箱內。觀察。在24小時、48小時和96小時的曝光中紀錄中毒和死亡的癥狀。這次實驗是用96小時的半數致死濃度作為結果的，因為在本次實驗條件下，這個時間段包含了絕大多數二齡幼蟲所持續的時間，但這個時間一般還沒到達三齡幼蟲開始蛻皮的時候。數據分析。將從實驗室獲得的測試數據通過對數或概率分析劑量反應曲線或使用SPSS概率程序計算死亡率回歸方程。應用Abbott方程式計算調整后的死亡率，其中死亡率是用百分比表示的。用以下方程調整只有溶劑的對照組的死亡率：調整后的死亡率=100X[實驗組死亡率—對照組死亡率]/（100—對照組死亡率）。調整后的死亡率是用來計算家蠶的半數致死濃度的。同一種殺蟲劑的毒性測試之間的差異是通過計算變異系數評估的。這是一個殺蟲劑的半數致死濃度的標準偏差和該殺蟲劑的平均半數致死濃度的比值。為了評估半數致死濃度的精確度，要算出死亡率的相對置信區間。相對置信區間是半數致死濃度值置信區間的寬度，可以使得半數致死濃度值的分數標準化。它還是每個毒性測試所要計算的一半的總95%置信區間值和半數致死濃度的比值。結果殺蟲劑毒性的比較。五種殺蟲劑在毒性大小方面存在著明顯差異。它們的平均半數致死濃度值范圍在三個數量級之間。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和高效氟氯氰菊酯屬于第一級。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的毒性始終是最大的，其中通過浸葉法測出的平均半數致死濃度值是0.00058mg/l，而通過定量噴霧法測出的平均半數致死濃度值是0.0020mg/kg。而樂果的毒性始終是最小的，通過浸葉法測出的平均半數致死濃度值是815.08mg/l，而通過定量噴霧法測出的平均半數致死濃度是1320.62mg/kg。吡蟲啉和毒死蜱的毒性大小為同一級別，都是中等毒性。用家蠶對五種殺蟲劑進行相對毒性測試，不論用哪一種方法，得出的結果都是一樣的，說明這兩種方法都可以正確地測試出這些殺蟲劑的相對毒性。測試系統的精度。在未經處理的對照籠里家蠶幼蟲的死亡率最高為5%（水對照組和溶劑對照組都是），這在設定的可接受上限10%之內。表2給出了所有測試的相對置信區間值，這是為了計算半數致死濃度估計的精度。從計算出的每種殺蟲劑通過浸葉法和定量噴霧法測出的平均相對置信區間值可以看出，每種殺蟲劑可獲得的置信區間差異比較小。例如：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（22.55%和19.03%）、高效氟氯氰菊酯（18.03%和17.71%）、吡蟲啉（19.21%和16.96%）、毒死蜱（17.20%和15.97%）和樂果（17.78%和15.81%）。這表明這些殺蟲劑的半數致死濃度值的估計可以認為是精確的。此外，對于每一種殺蟲劑，通過定量噴霧法所獲得的平均相對置信區間值都要優于通過浸葉法所獲得的值，這表明前者是更有效的方法。測試系統的變異性。同一種殺蟲劑的毒性測試之間的變異系數值是為了衡量實驗的變異性而計算的。這兩種方法的變異系數值如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（17.74%和5.44%）、高效氟氯氰菊酯（21.15%和5.16%）、吡蟲啉（13.01%和5.65%）、毒死蜱（16.72%和4.85%）和樂果（28.36%和7.93%）。顯然，對于每一種殺蟲劑個體來說，從定量噴霧法所獲得的數據的變異系數值要遠遠優于從浸葉法所獲得的。在、通過這一點可以看出，定量噴霧法比浸葉法更有優勢。模型擬合。在所有毒性測試中，通過對數或概率回歸模型可以獲得一個很適合的劑量響應曲線（Pmin>0.876,表2）。因此，這些半數致死濃度的估計包括整體的分析都是有效的。討論用于監管農藥風險評估的毒性試驗應該是可重復的。在今次研究中，我們通過這兩種毒性敏感試驗方法的比較來評估這兩種方法的優劣。就像世間萬物一樣，兩種方法都有其優點和不足。由于浸葉法的簡單性，它被經常地用在昆蟲毒性的確定上。然而相對于其他殺蟲劑風險評估方法，這種方法有許多局限性。首先，浸葉法的結果只能用農藥單位有效成分的量來表達，而不是用桑葉的每單位重量來表達，然而家蠶幼蟲是與有殺蟲劑的桑葉接觸而不是直接與殺蟲劑噴霧接觸的。其次，很難甚至可以說是不可能對桑葉上殺蟲劑的含量進行量化，這將會導致實驗中同樣的處理是一個不確定的重復。最后，在桑葉風干過程中會有大量的殺蟲劑飛濺到測試環境中，造成環境的的污染。浸葉法的不足恰恰是定量噴霧法的優點。定量噴霧法可以通過噴霧塔和測試前后的稱重將殺蟲劑的使用進行量化。這種方法還可以保證測試結果的精度和避免殺蟲劑的浪費。此外，定量噴霧法是用桑葉的每單位重量而不是用殺蟲劑的劑量來作為表達結果的。然而，定量噴霧法的缺點在于操作過于麻煩和費時。這次研究是第一次將浸葉法和定量噴霧法兩者進行比較，但是對于定量噴霧法還需要更多更深入的細節研究。今次毒性試驗，兩種方法都可以在不受時間和地點限制的條件下獲得相似的結果，證明這兩種方法都是很實用的。基于通過這兩種方法所獲得的這些殺蟲劑的半數致死濃度值，可以得出這五種殺蟲劑對家蠶的毒性水平如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽>高效氟氯氰菊酯>吡蟲啉>毒死蜱>樂果。即便如此，這兩種方法的重現性、評估精度和半數致死濃度估計的變異程度還是很不一樣的。值得注意的是，本次研究的毒性結果與其他研究不同。其中一個很大的不同是本次研究利用劑量—響應曲線的差異來計算半數致死濃度并將其作為可能結果的解釋。這兩種方法得到的結果的精度可以量化為半數致死濃度估計的相對置信區間值。眾所周知，相對置信區間越狹窄，半數致死濃度的估計可以認為是越精確。就如上述定義所說的，半數致死濃度的精度受不同的測試方法所影響，而浸葉法的相對置信區間比定量噴霧法要大。另一方面，殺蟲劑的種類也會影響實驗的精度。這在甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和高效氟氯氰菊酯的試驗中尤其明顯。第三，通過選擇不同的劑量—響應曲線可以提高實驗的精度。在另一項研究中，用對數邏輯斯蒂回歸分析來計算半數致死濃度可以得到不同的結果。一些研究使用在95%上下的置信區間值作為殺蟲劑對某些非靶標節肢動物的半數致死量估計的精度標準，并且認為比值小于等于5是可以接受的。如表2所示，今次實驗的置信區間比值在1.29到1.89的范圍內，因此可以認為本次實驗的半數致死濃度的估計是非常精確的。每次試驗之間的半數致死濃度值的變異性可以通過計算每種殺蟲劑的半數致死濃度值的變異系數值來評估。在定量噴霧法中，所有殺蟲劑的變異系數從不超過7.93%；而在浸葉法中，所有殺蟲劑的變異系數從不超過28.36%。此外，與浸葉法相比，定量噴霧法在某些方面表現得更為優秀。基于這項研究的結果，我們認為這兩種用于殺蟲劑風險評估的家蠶毒性敏感試驗方法是應該要具備可重復性。為了進一步評估定量噴霧法的可重復性，需要進行實驗室環比測試。通過對比這兩種毒性敏感試驗方法，我們可以看到