慢病毒載體的構建－－Gatewaytolentiviralvector------獻給勇敢的斗士

January2007慢病毒載體的構建------獻給勇敢的斗士Introduction

慢病毒（Lentiviruses）屬于逆轉錄病毒科。慢病毒核蛋白質前整合復合物具有噬核特性，病毒基因組運輸至細胞核，從而使慢病毒可以感染和在非有絲分裂細胞中復制。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉移載體。HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）

、EIAV（Equineinfectiousanemiavirus）、

FIV（Felineimmunodeficiencyvirus）

、

SIV（Simianimmunodeficiencyvirus）。其中研究最多最為透徹的是HIV。

Introduction慢病毒（Lent

Lentiviruseslifecycle

慢病毒通過病毒衣殼糖蛋白與細胞膜上的特異受體結合而進入易感靶細胞。一旦與細胞膜上的特異受體結合，慢病毒膜和細胞膜融合后病毒核心釋放入細胞漿里。病毒RNA逆轉錄合成雙鏈線性DNA而轉運之細胞核。線性病毒DNA永久性的整合入染色體DNA（宿主基因組）中，形成前病毒，成為永久的遺傳成分，在細胞周期中與靶細胞基因一樣進行復制，轉給子代細胞。前病毒DNA轉錄成RNA后再轉運至胞漿，在胞漿里RNA翻譯成病毒蛋白。病毒前結構蛋白和復制酶與病毒RNA組裝成新的病毒核心，從包裝細胞獲得病毒包膜蛋白后以出芽的方式從細胞膜上釋放出。病毒前結構蛋白經進一步處理而最終形成成熟的具有感染性的子代病毒顆粒。這些特性是慢病毒成為基因治療轉運工具的重要原因。MitrophanousK,GeneTher5(11):1481–1487(1999)Lentiviruseslifecycle慢病LentiviralVectorSystems

UnderDevelopmentPrimateHumanimmunodeficiencyvirus(HIV)Simianimmunodeficiencyvirus(SIV)Non-primateFelineimmunodeficiencyvirus(FIV)Equineinfectiousanemiavirus(EIAV)LentiviralVectorSystems

UndeTheoutlineofthisppt

接下來將以HIV為例從以下方面說明慢病毒載體構建方面的基礎知識：一.HIV-1lifecycle

二.HIV-1基因結構和病毒顆粒結構三.載體系統構建的基本原理四.載體系統的設計五.包裝系統的設計-----HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction,concentration&titration

1.HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction&titration2.HIV-1VectorProduction----Supernatantrecoveries&concentrat六.ThedifferenceofPackagingCellsforLVVwithotherretroviruses七.TheDevelopmentofLVVectors八.AdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectors九.ThecomparisonofLentiviralvectorswithothervectorsTheoutlineofthisppt接下來將以一HIV-1lifecycle

一HIV-1lifecycle二HIV-1基因結構

gag,-----群抗原基因，編碼核心蛋白p24pol-----多聚酶基因，編碼多聚酶；

env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41；

tat-----基因反式激活因子對HIV-1基因其正調控作用

rev,-----病毒蛋白表達調節因子，能增加gag和env基因對結構蛋白的表達

vif,-----病毒感染因子,其作用是在一些細胞因子的協下促進HIV-1在細胞內復

Vpr,-----R蛋白能使HIV在巨噬細胞中增殖

vpu,-----U蛋白，能促進HIV從細胞膜上釋放

nef,----負因子，具有抑制HIV-1增殖作用二HIV-1基因結構gag,-----群抗原基因二HIV-1病毒顆粒結構二HIV-1病毒顆粒結構三載體系統構建的基本原理

HIV-1基因組中如包裝信號、長末端重復序列的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列進行分離。即從病毒基因組中將反式gag,pol,andenv基因(其他輔助基因省去)從病毒中分離出而用我們感興趣的外源性目的基因代替，剩下的順式作用元件在病毒復制周期中------逆轉錄、整合、轉錄和包被--------可以被其它病毒或細胞蛋白識別。Fig.1

慢病毒載體的順式作用元件三載體系統構建的基本原理HIV-1基因組中如包裝信號、長四載體系統的設計慢病毒載體系統由三種不同的組成部分：包裝結構、轉移載體成分和包膜蛋白成分（Env表達結構）。包裝部分由去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用元件的HIV-1基因組而構建,能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白;載體部分與包裝成分互補,僅含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV-1順式作用元件,同時具有異源啟動子控制下的MCS及在此位點插入的目的基因。三種表達結構均以細菌質粒的形式保存，能轉染到哺乳動物細胞內產生復制缺陷性病毒原種。為降低包裝成分和載體成分同源重組產生有復制能力的慢病毒(RCL)的可能性,將包裝成分的5ˊLTR換成巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子,3′LTR換成猿猴空泡病毒40（SV40）polyA位點等，而將包裝成分分別構建在兩個質粒上,即一個表達gag和pol、另一個表達env。以HIV-1為基礎的慢病毒載體而言，病毒顆粒的核心和酶成分來自于HIV-1,而包膜蛋白來自于異源性病毒,大多是水泡性口炎病毒(VSV-G)－－－

四載體系統的設計慢病毒載體系統由三種不同的組成部分：包裝結ComponentsofthelentiviralsystemExpressionvectorPackagingvectorEnvelop/HostRangevectorComponentsofthelentivirals五包裝系統的設計

-----HIV-1-Derivedlentiviralvector

production,concentration&titration

重組慢病毒的產生：瞬時轉染法，即將包裝結構和載體結構瞬時共轉染法如293T高表達細胞系而產生重組慢病毒。此法非常成功，大多實驗室采用此法。包膜質粒、包裝質粒與載體質粒共轉(多用磷酸鈣共沉淀法)染293T細胞直接產生生產細胞。最后重組慢病毒分泌到培養基中進行培養而得到大量載體慢病毒。

例如用以下三質粒來包裝產生重組慢病毒：VECTORCONSTRUCTPACKAGINGCONSTRUCTENVELOPECONSTRUCT五包裝系統的設計

-----HIV-1-D1.HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction&titrationPackagingConstructTransferVectorConstructEnvelopeConstructTri-Transfection(CaPO4)293TcellsPseudoparticlesRecovery(filtration0.45μm)Supernatantsat48hand72hp.t.ConcentrationbyUltracentrifugationVectorTiterDeterminationTransducedCellsVirionsFACS(TU/ml)qPCRSybRGreen(proviralDNA/cell)p24ELISA(ngp24/ml)AllplasmidscontainaSV40replicationorigin-->EpisomalstatusIPPP1.HIV-1-Derivedlentiviralve2.HIV-1VectorProductionSupernatantrecoveries&concentration

293TproducercellsD0Tri-transfectionD1MediumexchangeD2&D3SupernatantharvestsFiltration0.45μmConcentrationbyultracentrifugationD3supernatantsSW28Pool212AliquotsD2supernatantsSW28Pool112Storeat4°CAliquots3SW55Pool1&Pool2Pool3AliquotsIntheevening

2.HIV-1VectorProduction293T六ThedifferenceofPackagingCellsforLVVwithotherretroviruses

六ThedifferenceofPackaging七TheDevelopmentofLVVectors

The1stGeneration

CMV(cytomegalovirus)immediate-earlyenhancer/promoterVSV-G(Vesicularstomatitisvirusglycoproteinenvelope)AcellularpolyAwasusedtoreplacethe3’LTRvpufromHIVwasdeleted七TheDevelopmentofLVVectoTheDevelopmentofLVVectors

The2ndGenerationBiosafetyissue:Additionalaccessorygenesweredeleted(vif,vpu,vprandnef)ThegenerationofRCL(replicationcompetentlentiviruses)was reducedTheDevelopmentofLVVectors

TheDevelopmentofLVVectors

The3rdGeneration

Self-inactivating(SIN)vectorsFurtherimprovementinbiosafetyTatwasdeletedRevwasputintoaseparateplasmidU3ofthe5’LTRwasreplacedbytheCMVIEpromoter/enhancerThepossibilityofgeneratingRCLisfurtherreducedTheDevelopmentofLVVectors

八AdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectors1.Potentialforlongtermtherapeuticexpression:incorporatesintothegenomeoftargetcells

2.Highefficiencygenetransduction3.Transduceseveralnondividingcells

4.Broadapplicationinvivo/exvivo1.Potentialforinsertionalmutagenesis

2.Unabletotransduceallnondividingcells(e.g.Hepatocytes)

3.Safetyissues

1).HIV-basedvectorsmustovercomeagreatsocialbarrier

2).Limitedknowledgeofotherlentivirusposesariskforrecombination八AdvantagesandDisadvantagesAdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectorsLVsareconsideredattractiveCNSgenetransfertoolsduetheircapacitytotransduceslowlyornondividingcellsinthebrain[2–3],

theextremelylowprobabilityofoccurrenceofreplication-competentretroviruses[4–6],thelackofexpressionofviralgenes[1],therelativelylargecloningcapacity[1],theabilitytoexpandthehostrangebypseudotypingLVswithavarietyofenvelopes[7,8],andthepossibilityofincorporatingcomplexexpressioncassettes[9].LVshavebeendemonstratedtotransducemostcell-typeswithintheCNSinvivo,includingneurons,astrocytes,adultneuronalstemcells,oligodendrocytes,andgliomacells[2,10–12].AdvantagesandDisadvantageso九ThecomparisonofLentiviralvectors

withothervectors九ThecomparisonofLentiviralReferences1.Naldini,L.,etal.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272:263–267.2.Blomer,U.,Naldini,L.,Kafri,T.,Trono,D.,Verma,I.M.,andGage,F.H.(1997).Highlyefficientandsustainedgenetransferinadultneuronswithalentivirusvector.J.Virol.71:6641–6649.3.Naldini,L.,Blomer,U.,Gage,F.H.,Trono,D.,andVerma,I.M.(1996).Efficienttransfer,integration,andsustainedlong-termexpressionofthetransgeneinadultratbrainsinjectedwithalentiviralvector.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382–11388.4.Zufferey,R.,Nagy,D.,Mandel,R.J.,Naldini,L.,andTrono,D.(1997).Multiplyattenuatedlentiviralvectorachievesefficientgenedeliveryinvivo.Nat.Biotechnol.15:871–875.5.Zufferey,R.,etal.(1998).Self-inactivatinglentivirusvectorforsafeandefficientinvivogenedelivery.J.Virol.72:9873–9880.6.Dull,T.,etal.(1998).Athird-generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem.J.Virol.72:8463–8471.7.Watson,D.J.,Kobinger,G.P.,Passini,M.A.,Wilson,J.M.,andWolfe,J.H.(2002).TargetedtransductionpatternsinthemousebrainbylentivirusvectorspseudotypedwithVSV,Ebola,Mokola,LCMV,orMuLVenvelopeproteins.Mol.Ther.5:528–537.References1.Naldini,L.,eta8.Wong,L.F.,etal.(2004).Transductionpatternsofpseudotypedlentiviralvectorsinthenervoussystem.Mol.Ther.9:101–111.9.Wiznerowicz,M.,andTrono,D.(2005).HarnessingHIVfortherapy,basicresearchandbiotechnology.TrendsBiotechnol.23:42–47.10.Consiglio,A.,etal.(2004).Robustinvivogenetransferintoadultmammalianneuralstemcellsbylentiviralvectors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:14835–14840.11.Jakobsson,J.,Ericson,C.,Jansson,M.,Bjork,E.,andLundberg,C.(2003).Targetedtransgeneexpressioninratbrainusinglentiviralvectors.J.Neurosci.Res.73:876–885.12.Miletic,H.,etal.(2004).Selectivetransductionofmalignantgliomabylentiviralvectorspseudotypedwithlymphocyticchoriomeningitisvirusglycoproteins.Hum.GeneTher.15:1091–1100.References8.Wong,L.F.,etal.(2004).

GOODLUCK很高興與你共享！共同學習，歡迎批評指正！HULUNBEIERPRAIRIEGOODLUCK很高興與你共享！共同學習，歡迎慢病毒載體的構建－－Gatewaytolentiviralvector------獻給勇敢的斗士

January2007慢病毒載體的構建------獻給勇敢的斗士Introduction

慢病毒（Lentiviruses）屬于逆轉錄病毒科。慢病毒核蛋白質前整合復合物具有噬核特性，病毒基因組運輸至細胞核，從而使慢病毒可以感染和在非有絲分裂細胞中復制。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉移載體。HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）

、EIAV（Equineinfectiousanemiavirus）、

FIV（Felineimmunodeficiencyvirus）

、

SIV（Simianimmunodeficiencyvirus）。其中研究最多最為透徹的是HIV。

Introduction慢病毒（Lent

Lentiviruseslifecycle

慢病毒通過病毒衣殼糖蛋白與細胞膜上的特異受體結合而進入易感靶細胞。一旦與細胞膜上的特異受體結合，慢病毒膜和細胞膜融合后病毒核心釋放入細胞漿里。病毒RNA逆轉錄合成雙鏈線性DNA而轉運之細胞核。線性病毒DNA永久性的整合入染色體DNA（宿主基因組）中，形成前病毒，成為永久的遺傳成分，在細胞周期中與靶細胞基因一樣進行復制，轉給子代細胞。前病毒DNA轉錄成RNA后再轉運至胞漿，在胞漿里RNA翻譯成病毒蛋白。病毒前結構蛋白和復制酶與病毒RNA組裝成新的病毒核心，從包裝細胞獲得病毒包膜蛋白后以出芽的方式從細胞膜上釋放出。病毒前結構蛋白經進一步處理而最終形成成熟的具有感染性的子代病毒顆粒。這些特性是慢病毒成為基因治療轉運工具的重要原因。MitrophanousK,GeneTher5(11):1481–1487(1999)Lentiviruseslifecycle慢病LentiviralVectorSystems

UnderDevelopmentPrimateHumanimmunodeficiencyvirus(HIV)Simianimmunodeficiencyvirus(SIV)Non-primateFelineimmunodeficiencyvirus(FIV)Equineinfectiousanemiavirus(EIAV)LentiviralVectorSystems

UndeTheoutlineofthisppt

接下來將以HIV為例從以下方面說明慢病毒載體構建方面的基礎知識：一.HIV-1lifecycle

二.HIV-1基因結構和病毒顆粒結構三.載體系統構建的基本原理四.載體系統的設計五.包裝系統的設計-----HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction,concentration&titration

1.HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction&titration2.HIV-1VectorProduction----Supernatantrecoveries&concentrat六.ThedifferenceofPackagingCellsforLVVwithotherretroviruses七.TheDevelopmentofLVVectors八.AdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectors九.ThecomparisonofLentiviralvectorswithothervectorsTheoutlineofthisppt接下來將以一HIV-1lifecycle

一HIV-1lifecycle二HIV-1基因結構

gag,-----群抗原基因，編碼核心蛋白p24pol-----多聚酶基因，編碼多聚酶；

env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41；

tat-----基因反式激活因子對HIV-1基因其正調控作用

rev,-----病毒蛋白表達調節因子，能增加gag和env基因對結構蛋白的表達

vif,-----病毒感染因子,其作用是在一些細胞因子的協下促進HIV-1在細胞內復

Vpr,-----R蛋白能使HIV在巨噬細胞中增殖

vpu,-----U蛋白，能促進HIV從細胞膜上釋放

nef,----負因子，具有抑制HIV-1增殖作用二HIV-1基因結構gag,-----群抗原基因二HIV-1病毒顆粒結構二HIV-1病毒顆粒結構三載體系統構建的基本原理

HIV-1基因組中如包裝信號、長末端重復序列的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列進行分離。即從病毒基因組中將反式gag,pol,andenv基因(其他輔助基因省去)從病毒中分離出而用我們感興趣的外源性目的基因代替，剩下的順式作用元件在病毒復制周期中------逆轉錄、整合、轉錄和包被--------可以被其它病毒或細胞蛋白識別。Fig.1

慢病毒載體的順式作用元件三載體系統構建的基本原理HIV-1基因組中如包裝信號、長四載體系統的設計慢病毒載體系統由三種不同的組成部分：包裝結構、轉移載體成分和包膜蛋白成分（Env表達結構）。包裝部分由去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用元件的HIV-1基因組而構建,能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白;載體部分與包裝成分互補,僅含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV-1順式作用元件,同時具有異源啟動子控制下的MCS及在此位點插入的目的基因。三種表達結構均以細菌質粒的形式保存，能轉染到哺乳動物細胞內產生復制缺陷性病毒原種。為降低包裝成分和載體成分同源重組產生有復制能力的慢病毒(RCL)的可能性,將包裝成分的5ˊLTR換成巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子,3′LTR換成猿猴空泡病毒40（SV40）polyA位點等，而將包裝成分分別構建在兩個質粒上,即一個表達gag和pol、另一個表達env。以HIV-1為基礎的慢病毒載體而言，病毒顆粒的核心和酶成分來自于HIV-1,而包膜蛋白來自于異源性病毒,大多是水泡性口炎病毒(VSV-G)－－－

四載體系統的設計慢病毒載體系統由三種不同的組成部分：包裝結ComponentsofthelentiviralsystemExpressionvectorPackagingvectorEnvelop/HostRangevectorComponentsofthelentivirals五包裝系統的設計

-----HIV-1-Derivedlentiviralvector

production,concentration&titration

重組慢病毒的產生：瞬時轉染法，即將包裝結構和載體結構瞬時共轉染法如293T高表達細胞系而產生重組慢病毒。此法非常成功，大多實驗室采用此法。包膜質粒、包裝質粒與載體質粒共轉(多用磷酸鈣共沉淀法)染293T細胞直接產生生產細胞。最后重組慢病毒分泌到培養基中進行培養而得到大量載體慢病毒。

例如用以下三質粒來包裝產生重組慢病毒：VECTORCONSTRUCTPACKAGINGCONSTRUCTENVELOPECONSTRUCT五包裝系統的設計

-----HIV-1-D1.HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction&titrationPackagingConstructTransferVectorConstructEnvelopeConstructTri-Transfection(CaPO4)293TcellsPseudoparticlesRecovery(filtration0.45μm)Supernatantsat48hand72hp.t.ConcentrationbyUltracentrifugationVectorTiterDeterminationTransducedCellsVirionsFACS(TU/ml)qPCRSybRGreen(proviralDNA/cell)p24ELISA(ngp24/ml)AllplasmidscontainaSV40replicationorigin-->EpisomalstatusIPPP1.HIV-1-Derivedlentiviralve2.HIV-1VectorProductionSupernatantrecoveries&concentration

293TproducercellsD0Tri-transfectionD1MediumexchangeD2&D3SupernatantharvestsFiltration0.45μmConcentrationbyultracentrifugationD3supernatantsSW28Pool212AliquotsD2supernatantsSW28Pool112Storeat4°CAliquots3SW55Pool1&Pool2Pool3AliquotsIntheevening

2.HIV-1VectorProduction293T六ThedifferenceofPackagingCellsforLVVwithotherretroviruses

六ThedifferenceofPackaging七TheDevelopmentofLVVectors

The1stGeneration

CMV(cytomegalovirus)immediate-earlyenhancer/promoterVSV-G(Vesicularstomatitisvirusglycoproteinenvelope)AcellularpolyAwasusedtoreplacethe3’LTRvpufromHIVwasdeleted七TheDevelopmentofLVVectoTheDevelopmentofLVVectors

The2ndGenerationBiosafetyissue:Additionalaccessorygenesweredeleted(vif,vpu,vprandnef)ThegenerationofRCL(replicationcompetentlentiviruses)was reducedTheDevelopmentofLVVectors

TheDevelopmentofLVVectors

The3rdGeneration

Self-inactivating(SIN)vectorsFurtherimprovementinbiosafetyTatwasdeletedRevwasputintoaseparateplasmidU3ofthe5’LTRwasreplacedbytheCMVIEpromoter/enhancerThepossibilityofgeneratingRCLisfurtherreducedTheDevelopmentofLVVectors

八AdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectors1.Potentialforlongtermtherapeuticexpression:incorporatesintothegenomeoftargetcells

2.Highefficiencygenetransduction3.Transduceseveralnondividingcells

4.Broadapplicationinvivo/exvivo1.Potentialforinsertionalmutagenesis

2.Unabletotransduceallnondividingcells(e.g.Hepatocytes)

3.Safetyissues

1).HIV-basedvectorsmustovercomeagreatsocialbarrier

2).Limitedknowledgeofotherlentivirusposesariskforrecombination八AdvantagesandDisadvantagesAdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectorsLVsareconsideredattractiveCNSgenetransfertoolsduetheircapacitytotransduceslowlyornondividingcellsinthebrain[2–3],

theextremelylowprobabilityofoccurrenceofreplication-competentretroviruses[4–6],thelackofexpressionofviralgenes[1],therelativelylargecloningcapacity[1],theabilitytoexpandthehostrangebypseudotypingLVswithavarietyofenvelopes[7,8],andthepossibilityofincorporatingcomplexexpressioncassettes[9].LVshavebeendemonstratedtotransducemostcell-typeswithintheCNSinvivo,includingneurons,astrocytes,adultneuronalstemcells,oligodendrocytes,andgliomacells[2,10–12].AdvantagesandDisadvantageso九ThecomparisonofLentiviralvectors

withothervectors九ThecomparisonofLentiviralReferences1.Naldini,L.,etal.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272:263–267.2.Blomer,U.,Naldini,L.,Kafri,T.,Trono,D.,Verma,I.M.,andGage,F.H.(1997).Highlyefficientandsustainedgenetransferinadultneuronswithalentivirusvector.J.Virol.71:6641–6649.3.Naldini,L.,Blomer,U.,Gage,F.H.,Trono,D.,andVerma,I.M.(1996).Efficienttransfer,integration,andsustainedlong