關(guān)于基因組學(xué)物理圖繪制第1頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四遺傳圖的缺點(diǎn)遺傳圖的分辨率有限

基因組測序和組裝所要求的標(biāo)記密度是100kb。遺傳圖的覆蓋面較低

重組熱點(diǎn)，倒位區(qū)段遺傳圖分子標(biāo)記的排列有時會出現(xiàn)差錯

環(huán)境因素，取樣誤差第2頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四物理作圖的方法

限制酶作圖(RestrictionMapping)

依靠克隆的基因組作圖(clone-basedmapping)

熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖(STS，Sequencetagedsite)第3頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四1.限制性作圖

它是將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對位置.

其只能應(yīng)用于較小的DNA分子,其上限取決于作圖分子中限制酶位點(diǎn)的頻率.

通常采用的6堿基對識別順序的限制酶僅適合50Kb以下DNA分子的精確作圖.第4頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四1.1限制酶作圖(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待檢的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH第5頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四瓊脂糖電泳第6頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四用于小片段DNA的分析，精度非常高聚丙烯酰胺凝膠電泳第7頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四1.2限制酶作圖的改進(jìn)脈沖凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切點(diǎn)限制圖繪制垂直交變電場,兩個電場方向成為直角一般的凝膠電泳30Kb以下，脈沖凝膠是提高了2個數(shù)量級，達(dá)到10MbDNA片段>50Kb第8頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四稀有切點(diǎn)限制圖繪制注意事項:

識別序列越長產(chǎn)生的片段越大;識別位點(diǎn)堿基數(shù)預(yù)計DNA片段平均長度/Kb41648641010004的n次方，n是限制酶識別的堿基數(shù)第9頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四

識別位點(diǎn)堿基的組成影響限制性片段的大小;

如人類基因組A/T比例接近60/%,選用高比例A/T位點(diǎn)限制酶,產(chǎn)生的片段多于高比例G/C識別位點(diǎn)酶特異序列含量高，否則效果不好第10頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四

有些限制酶識別位點(diǎn)較長如酵母的Ⅰ-SceI識別順序為18bp,TAGGGATAA/CAGGGTAAT

如果高等真核生物基因組中無此序列,可通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座和噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將其引入待測基因組中.第11頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四基因組DNA的甲基化狀態(tài)

如人類活細(xì)胞基因組中大量5’-CG-3’順序的胞嘧啶被甲基化,形成5’-TG-3’，使許多含有5’-CG-3’順序的內(nèi)切酶很少找到可切位點(diǎn).SmaICCC/GGG78kbNotIGC/GCGCGC1Mb第12頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四凝膠濃度、電場強(qiáng)度、緩沖液第13頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。脈沖凝膠電泳(PFGE)(pulsed-fieldgelelectrophoresis)分離范圍：分子量20kb—5000kb第14頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四分辨力：10MB垂直交變電場,兩個電場方向成為直角30Kb10MbDNA片段>50Kb1984年，Schwartz和Centor發(fā)明了交變脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)技術(shù)，與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。

一、PFGE的基本原理

脈沖電泳分離DNA大分子的介質(zhì)是瓊脂糖，大于20kb的線性DNA雙鏈片段，在瓊脂糖凝膠的網(wǎng)孔中的泳動，就像蛇行似的尋找彎曲蜿蜒的孔隙。普通的單方向恒定電場給DNA分子的泳動動力方向確定且不發(fā)生變化，所以嚴(yán)重影響凝膠電泳分離大分子量DNA片段的效果。

PFGE施加在凝膠上至少有兩個電場方向，時間與電流大小也交替改變，使得DNA分子能夠不斷地調(diào)整泳動方向，以適應(yīng)凝膠中不規(guī)則的孔隙變化，達(dá)到分離大分子線性DNA的目的，最大分辨率為5000kb大小的線性DNA分子。在交變脈沖電場中，大分子量線性DNA改變泳動方向所需時間比小分子線性DNA要長，因為前者變形能力低于后者。當(dāng)某一線性DNA在脈沖場中改變形狀調(diào)整方向進(jìn)行遷移所需的時間大于脈沖場脈沖維持時間時，該DNA的遷移速度將減為最低。線性分子改變形狀和泳動方向所需時間與其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差異作為分離不同DNA分子的依據(jù)。當(dāng)DNA分子變形轉(zhuǎn)向所需時間與脈沖時間較接近時，遷移率與DNA分子量成反比。根據(jù)被分離DNA分子的范圍選擇適當(dāng)?shù)拿}沖時間，經(jīng)過較長時間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動，不同大小的DNA就被分離。DNA分子的凈遷移方向與普通電泳一樣，垂直于樣品孔。

影響PFGE分辨率的因素包括幾方面：兩個脈沖場的均一性；兩個脈沖場的脈沖時間以及它們之間的比率；兩個脈沖場的強(qiáng)度和方向。為了增強(qiáng)PFGE對大小差異較大的DNA樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時間使較小的DNA分子分離，然后用較長的交變脈沖時間分離較大的DNA分子。第15頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四端粒自主復(fù)制起始點(diǎn)標(biāo)記基因標(biāo)記基因著絲粒大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)質(zhì)粒擴(kuò)增篩選標(biāo)記2.1大片段DNA的克隆載體克隆位點(diǎn)第16頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四YAC插入子穩(wěn)定性問題,同一酵母細(xì)胞中多個YAC引起交換產(chǎn)生嵌合順序PBR322人工改造而來色氨酸、鳥苷酸篩選，TRP和URAnium，基本培養(yǎng)基上篩選是否有這兩個臂的基因。SUP確定是否有插入片段，插入時，紅色克隆，無克隆時顯示白色11.4kb著絲粒負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂時染色體均等分配端粒：保持人工染色體的穩(wěn)定性。自主復(fù)制起點(diǎn)：細(xì)胞染色體復(fù)制的啟動第17頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四缺點(diǎn)插入子不穩(wěn)定交換效應(yīng)GC區(qū)克隆效率低

標(biāo)準(zhǔn)的YAC操作程序克隆的DNA平均為600kb，改進(jìn)的程序可獲得1400kb第18頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四230kb-1700kb標(biāo)準(zhǔn)操作為600kb，改進(jìn)的1400kb插入子不穩(wěn)定交換效應(yīng)嵌合序列GC區(qū)克隆效率低人類基因組中第19頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四BAC:細(xì)菌人工染色體300Kb1992與一般質(zhì)粒有2點(diǎn)不同:單拷貝復(fù)制(不會發(fā)生重組嵌合)相對分子量大(具有較大容量)介導(dǎo)F因子單向復(fù)制維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)第20頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四BAC來源于大腸桿菌中的天然F質(zhì)粒,與一般質(zhì)粒有2點(diǎn)不同:單拷貝復(fù)制(不會發(fā)生重組嵌合),相對分子量大(具有較大容量),類似于制備質(zhì)粒方法提取質(zhì)粒,方便快捷Cm氯霉素Loxp蛋白作用位點(diǎn)，可將環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性DNA，p1Cre蛋白作用位點(diǎn)CosN伽馬噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)第21頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四2.2重疊群組建重疊群:相互重疊的DNA片段組成的物理圖.重疊群的組建方法染色體步移法第22頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四

指紋:系指確定DNA樣品所具有的DNA片段;

一個克隆的指紋表示了該克隆所具有的限定的順序特征.2.3指紋作圖法第23頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四常用的指紋分析方法:

A

限制性帶型(restrictionpatterns)指紋

B

重復(fù)序列DNA指紋(repetitiveDNAfingerprints)第24頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四Southern

印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜第25頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四常用的指紋分析方法:C

重復(fù)DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重復(fù)序列PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指紋DSTS作圖(STScontentmapping)第26頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四AluPCR方法特點(diǎn)在于利用人DNA中普遍存在的Alu重復(fù)序列，這種300bp序列的拷貝約900.000個，分布于整個人基因組。雖然Alu重復(fù)序列各拷貝間有很大差別，但已確定出了一個相同序列，且重復(fù)子中一些區(qū)域是極為保守的。我們認(rèn)為，可設(shè)計合適的能識別這些保守區(qū)的PCR引物，進(jìn)行有效的內(nèi)-Alu擴(kuò)增，從復(fù)雜源中分離人DNA。平均密度4kb第27頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四第28頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四3.熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

將探針用熒光標(biāo)記，與細(xì)胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標(biāo)定在連鎖圖上。第29頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四分辨率低,敏感性低精細(xì)作圖對于特定探針,原位雜交所顯示的中期染色體熒光信號所處的位置與染色體短臂末端的相對距離不變,經(jīng)標(biāo)記可將其標(biāo)定在連鎖圖上.分辨力達(dá)到25Kb,染色體無法確定外部形態(tài)第30頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四限制性作圖快速，但是不適合大基因組克隆重疊群構(gòu)建程序復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力指紋作圖對于大基因組有不少問題，會出現(xiàn)誤排原位雜交操作困難，資料積累慢，一次實驗定位的分子標(biāo)記3-4個，第31頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖

(STS,SequenceTagedSite)長度:100-500bp序列已知,可以設(shè)計PCR反應(yīng)單拷貝,在染色體上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS第32頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.1STS作圖原理與遺傳作圖的相似，都是頻率決定遠(yuǎn)近，是斷裂頻率第33頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四4.2尋找STS的方法:表達(dá)順序標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)

從cDNA中找到的小段順序,但基因家族成員間共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）簡單序列長度多態(tài)性隨機(jī)基因組順序第34頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四隨機(jī)挑選cDNA克隆進(jìn)行單向、一步大規(guī)模測序，將所獲得的部分cDNA序列稱為ＥＳＴ。

EST是一個cDNA克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的３’端和５’端部分cDNA隨機(jī)片段，每個EST長度約200～600bp,代表了一個單拷貝基因的部分cDNA表達(dá)序列。由于大多數(shù)ＥＳＴ的長度不足400bp,說明一個基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列可能包含多個序列重疊的EST，由于一個基因mRNA剪接點(diǎn)不同可以獲得多個cDNA克隆，因此EST既可能對應(yīng)于一個cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式

。任何單一DNA順序都可作為STS，特別是已在連鎖分析中（遺傳圖中）定位的SSLP，其可建立物理圖與遺傳圖之間的聯(lián)系。第35頁，共40頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期四ESTEST是一個cDNA克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的3’端和5’