總RNA提取--常用方案總RNA提取--常用方案總RNA提取--常用方案資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月總RNA提取--常用方案版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁(yè)次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：試劑盒快速提取實(shí)驗(yàn)方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA，則根據(jù)Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，而RNA中如含無(wú)機(jī)鹽，則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。實(shí)驗(yàn)材料微生物動(dòng)物細(xì)胞植物組織試劑、試劑盒RNA提取試劑盒焦碳酸二乙酯乙醇儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機(jī)紫外分光光度計(jì)取液器電泳儀電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)胞或組織破碎

1.

微生物材料

（1）發(fā)酵3~4天（或?qū)?shù)生長(zhǎng)期）的菌體，離心收集菌絲體（動(dòng)植物材料無(wú)需此步處理）。

（2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。

（4）研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12ml變性液的容器中勻漿。

2.

動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料（適用的樣品量為細(xì)胞：108）

（1）細(xì)胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進(jìn)行。

（2）深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎。

①細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無(wú)菌離心管中，4℃，3000g離心5分鐘。

②細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25ml滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3000g離心5分鐘。

③細(xì)胞破碎：在沉淀細(xì)胞中加入15ml預(yù)冷的變性液，用無(wú)菌處理過(guò)的勻漿器勻漿。

3.

表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎

（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108。

（2）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8ml預(yù)冷變性液。

（3）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時(shí)可見(jiàn)粘度加大。

（4）用無(wú)菌吸管將第一個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶，以此類(lèi)推。

（5）直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個(gè)培養(yǎng)瓶開(kāi)始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。

（6）將上述12ml含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50ml無(wú)菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。

4.

植物組織破碎（適用的樣品量為g組織）

（1）將600ul變性液置于ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）將g新鮮組織用液氮冰凍。

（3）在液氮下，研磨組織塊。

（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中。

5.

動(dòng)物組織破碎（適用的樣品量為1g組織）

（1）將12

ml變性液置于50

ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）在上述管中加入1g新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻漿粉碎。

二、RNA的抽提

1.

在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul+60ul的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

2.

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

3.

冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。

4.

上層水相吸至無(wú)菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。

5.

離心4℃，10000g，20分鐘。

6.

沉淀RNA，冷凍干燥15分鐘，RNA沉淀重新溶于300ul變性液中，可振蕩（有時(shí)為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時(shí)間應(yīng)極短）。

7.

60ul的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

8.

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

9.

冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。

10.

上層水相吸至無(wú)菌離心管中。

11.

等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。

12.

復(fù)溶于去RNA酶的水中（對(duì)于準(zhǔn)備長(zhǎng)期保存的RNA可加入pH的乙酸鈉至終濃度為M，再加入體積的乙醇，-70℃保存。）。展開(kāi)

注意事項(xiàng)1.

研磨組織塊用于RNA提取的樣品，必須是新鮮的細(xì)胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。

2.

變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。其他1.

變性液組成

25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM乙酸鈉、%十二烷基肌氨酸鈉、mMβ-巰基乙醇)，65℃溶解，過(guò)濾滅菌，4℃預(yù)冷。

2.

酸性酚配制

55℃時(shí)，500g酚溶入500ml50mM，乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM，乙酸鈉，直到pH<。氯化鋰提取法實(shí)驗(yàn)方法原理用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。實(shí)驗(yàn)材料微生物動(dòng)物細(xì)胞植物組織試劑、試劑盒氯化鋰尿素Tris-HCLEDTASDS儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機(jī)紫外分光光度計(jì)取液器電泳儀電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、組織或細(xì)胞勻漿

1.

對(duì)于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5~10ml氯化鋰-尿素溶液，勻漿器高速勻漿2分鐘。

2.

對(duì)于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入ml氯化鋰—尿素溶液手工勻漿，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。

二、純化

1.

勻槳液在0~4℃放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘。

2.

取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰—尿素溶液，重復(fù)步驟1。

3.

沉淀用原勻漿液1/2體積的氯化鋰—尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15~30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘。

4.

取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（）及2倍體積的乙醇，-20℃放置1小時(shí)，5000g離心。

5.

70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥。

6.

RNA溶解液溶解沉淀，得RNA。

三、保存

分裝，于-70℃保存。一步法實(shí)驗(yàn)材料RNA試劑、試劑盒乙酸鈉氯仿異戊醇異丙醇乙醇SDS酚儀器、耗材離心機(jī)分光光度計(jì)搖床實(shí)驗(yàn)步驟1.

組織來(lái)源材料：100ng組織加1μl變性液，在玻璃Teflon勻漿器中將其勻漿。

2.

培養(yǎng)細(xì)胞：離心棄懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液或倒去單層培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液（不需用生理鹽水洗滌），每107細(xì)胞加入1ml變性液，然后用吸管抽吸7~10次。

3.

將勻漿移入5ml聚丙烯管子，加入體積的2mol/l的乙酸鈉緩沖液，混勻。

4.

加入1ml水飽和酚，混勻；再加入體積的49：1氯仿/異戊醇。

5.

混勻后0~4℃放置15min。

6.

于4℃用SS-34轉(zhuǎn)子10000g離心20min，將上層水相移入一個(gè)干凈試管中。

7.

加入1ml（等體積）異丙醇-20℃放置30min沉淀RNA，于4℃10000g離心10min。

8.

將RNA溶解于ml變性液，并移入1.5ml微量離心管中，加ml異丙醇,。

9.

-20℃放置30min沉淀，于4℃10000g離心10min。

10.

重懸RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室溫放置10~15min，10000g離心5min。

11.

真空干燥RNA5~10min，溶解沉淀于100~200μlDECP此處理過(guò)的水或DEPC處理過(guò)的%SDS，-70℃冰凍保存或保存在-20℃的乙醇中。CsCl法實(shí)驗(yàn)材料RNA試劑、試劑盒PBS異硫氰酸胍CsClDEPC無(wú)水乙醇儀器、耗材注射器電泳儀離心機(jī)培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)步驟一、用于單層培養(yǎng)細(xì)胞

1.

室溫下用PBS冼滌細(xì)胞，每平皿用5ml，洗2次。

2.

在不超過(guò)108細(xì)胞中加入異硫氰酸胍溶液，并使之遍布整個(gè)平皿。

3.