1、 細胞系的建立及鑒定 2012.2.28細胞系：有限細胞系，人的正常組織多數可以建立有限細胞系。如間充質來源的成纖維細胞，牙髓細胞、牙髓干細胞、牙周膜細胞等無限細胞系，永生化細胞系，腫瘤細胞系細胞系/細胞的鑒定細胞系的建立：1.組織塊方法2.單層細胞法 原代培養 傳代培養 大量擴增細胞后用于實驗研究 使用前對細胞的組織特異性進行鑒定成骨細胞：沒有唯一的特異性標志物 需數個指標聯合證實表面標志：表達ALP。 Gomarri 法合成型膠原、型膠原、骨鈣素、骨粘蛋白、骨橋蛋白等骨基質蛋白。組織功能： 體外形成礦化結節。 von Kossa染色法體內成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。破骨細胞：唯一特異性標志物

2、破骨細胞含有豐富的酸性磷酸酶和抗酒石酸磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色陽性是破骨細胞的重要標識。另外破骨細胞表面有降鈣素（calcitonin）受體，也可以作為標志物。形態學：多核細胞牙周膜干細胞：干細胞表面標記物:多潛能功能組織細胞分化及功能鑒定 分化為脂肪細胞： 油紅O 染色陽性腫瘤細胞系的生物學鑒定 腫瘤細胞系建立后,要對其生物學性狀進行鑒定,以便日后的研究有可比較的科學依據腫瘤細胞的生物學特征干系細胞：每個腫瘤內都含有一個或幾個具有相對穩定特性的自我保持的（Selfmaintaining）細胞系。腫瘤的生長就是這些

3、細胞系的增殖；非干系細胞：除了干系瘤細胞，腫瘤還具有失去自我保持能力的細胞的后代，可稱為“腫瘤的非干系細胞”。動物腫瘤移植實驗證實，腫瘤結節在新宿主身上多次傳代之后仍具有原來腫瘤的主要特征，包括形態、生化、抗原及細胞遺傳的標志。所有惡性腫瘤的轉移瘤結節的細胞都具有與親代原發病損類似的形態學及生物學性質。 培養中的腫瘤細胞特性 1致瘤性： 培養的腫瘤細胞移植到敏感動物后，可獲得形成腫瘤的能力。證明細胞在體外能經過類似于體內腫瘤發生過程中出現的變化。 動物接種形成的腫瘤應進行組織學、染色體及其它生物學標志的檢查并與原接種細胞進行比較。 致瘤性的判斷移植瘤是判斷細胞性質的關鍵步驟。首先，移植瘤的組織

4、形態應與原腫瘤組織一致。但有例外，細胞群體的性質可以與植入前不同，因為在植入的細胞中，只有特殊變異的細胞具有致瘤性，這些變種可能原來就存在于植入群體內，也可能是植入后產生的。在這種情況下可以確認接種的致瘤性。 （2）植入部位 ，例如，將瘤細胞接種到小鼠軀干接近頭部位置的皮下，生瘤的陽性率及生長的速度比植到尾部高24倍。（3）植入部位微環境的潛在因素，某些細胞只有在植入部位找到最佳的微環境時才形成腫瘤。生瘤性與細胞其它性質的關系細胞在基質上鋪展的面積與生瘤性有關。微絲束的結構破壞。許多生瘤細胞系均有大量的微絲束變化，它與形態轉化有關。停泊依賴性與生瘤性聯系最密切。 在動物體內不形成腫瘤的細胞系，

5、在半固體培養基內形成集落的能力也低；與之相反，而大多數能在動物體內生瘤的細胞系，形成集落的效率也高。喪失生長抑制性當培養細胞所需任何一種關鍵性營養物質或生長因子降到閾值以下時,正常細胞的生長即受到抑制,如異亮氨酸,磷酸鹽,上皮生長因子等。轉化的細胞對一些生長因子需求降低,或失去了對激素和生長因子的需求，在營養不足的情況下可繼續生長,它們甚至可以殺死一些自身的細胞,以便在不可能生存的環境下繼續生長。或者由于某些轉化產生了生長因子類似物,為自身提供了生長因子。 密度依賴性抑制 正常貼壁性細胞的增殖率,隨著每單位基質面積內的細胞群體的局部密度增加而下降。這一現象稱為密度依賴性抑制(density d

6、ependent inhibition) 。或生長接觸抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。當一個對密度依賴性抑制敏感的培養細胞達到某種密度，即所謂飽和密度時便停止生長。此時細胞停止增殖，但并不死亡。這種抑制可以由于液體培養基中的營養物質耗盡,生長抑制物質的累積所引起。惡性轉化細胞對密度依賴性抑制的敏感性在腫瘤演化的過程中自動丟失。 3獲得永生性 正常細胞原代培養物經過數次傳代就逐漸停止增殖。在腫瘤性演化過程中，細胞可能獲得生長無限代數的能力。永生性是腫瘤演化的一個特征。 成纖維及上皮細胞的原代培養經過初期的適應培養條件之后，便進入較穩定的生長時期，

7、生長速度逐漸下降，進入退化期即衰老期。細胞系的壽命差別很大，取決于培養細胞來自的動物種屬。 腫瘤細胞系的一般生物學性狀: 培養細胞的形態和/或超微結構細胞生長及增殖能力的檢測: 細胞生長曲線； 細胞分裂指數； 細胞倍增時間； 細胞周期,DNA合成； 遺傳性狀檢測： 染色體分析:倍體性、染色體眾數、核型分析； 同工酶； 集落形成能力； 腫瘤細胞系的特征：特殊標記、癌基因、抑癌基因的表達、病毒感染等； 以上各項指標中異種體內移植致瘤性最為主要,如果一個細胞系接種到免疫缺陷動物體內的適當部位后不能生瘤,則不能證明其具有腫瘤細胞的特征。 細胞懸液的制備要求：5個濃度的細胞懸液分別是： 10000個；8000個；6000個；4000 個；2000個/100ul/孔 每個濃度3個復孔1.細胞懸液的計數 得到1X105個/ml2.確定各實驗濃度所需的細胞懸液總量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）500ul3.計算各濃度細胞懸液所需的細胞數 104/孔/100ulX5孔5X