1、貴州野生天麻遺傳多樣性的AFLP指紋分析【摘要】目的研究野生天麻的遺傳多樣性，為合理利用野生天麻種質(zhì)資源、為天麻的進一步系統(tǒng)選育研究提供一定的理論根據(jù)。方法利用AFLP技術(shù)，采用8對+3和P+3引物組合對23份貴州野生天麻品種進展了總基因組DNA程度上的多態(tài)性檢測，用NTSYSp-2.10s軟件的UPGA方法對檢測結(jié)果進展聚類。結(jié)果共獲得552條可統(tǒng)計的條帶，其中396條呈多態(tài)性，多態(tài)性帶百分率約72%。UPGA聚類可以將貴州不同產(chǎn)地的野生天麻很好地區(qū)分開來。結(jié)論該實驗提醒了貴州野生天麻種質(zhì)豐富的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果說明多數(shù)來源地一樣的天麻種質(zhì)表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】野生天麻；

2、遺傳多樣性；AFLPAbstrat：bjetiveTstudythegenetiplyrphisfildGastrdiaelataBl.inGuizhuprvine,andprvidereferenefrtheutilizingitsgerplasresuresandultivatingnevarieties.ethdsThephylgentirelatinshipsang23ildGastrdiaelataBl.inGuizhuereanalyzedusingAFLPtstudythegenetidiversityithEightAFLPprierbinatins(+3andP+3).The

3、deterinedleulararkersereanalyzedthrughUPGAethdfsftareNTSYSp-2.10s.Results552bandseredeteted，396fhihereplyrphi,andthehighratifplyrphibands(86%)erebservedinthisstudy.ThedendrgrafrthelusteringfUPGAshedgdlassifiatinfallppulatin.nlusinurresultssuggestthatildGastrdiaelataBl.inGuizhushsabundantgenetidivers

4、ities.ResultsflusteranalysisshedthatthelassifiatinbasednAFLParkersfildGastrdiaelataBl.inGuizhuisnsistentiththEIrrigin.Keyrds：ildGastrdiaelataBl.；Genetiplyrphis；AFLP天麻為蘭科(rehidaeae)多年生草本植物天麻GastrdiaelataBl.的枯燥根莖，為我國傳統(tǒng)名貴中藥。其主要有效成分天麻素具有廣泛的藥理作用,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、增智、健腦、治療老年性癡呆癥、抗氧化、延緩衰老、增強免疫功能、調(diào)節(jié)心血管等作用。就天麻遺傳學(xué)研究

5、來看，傳統(tǒng)的研究主要是從形態(tài)學(xué)方面進展研究。近年來研究主要是運用RAPD1,2，AFLP2，ISSR3等分子生物學(xué)技術(shù)對其遺傳進化、品種分類鑒定等方面進展研究。野生天麻作為一種重要的遺傳種質(zhì)資源，未見有對其遺傳多樣性進展研究的報道。本研究利用AFLP技術(shù),以8對引物對23株不同來源的貴州野生天麻基因組DNA進展分析,旨在從分子程度上認識貴州天麻野生資源的遺傳多樣性和其遺傳親緣關(guān)系,為天麻種質(zhì)資源的搜集保存和有效利用提供理論根據(jù)。1儀器與材料1.1材料樣品采自貴州不同地區(qū)或一樣地區(qū)的不同居群，均為野生未受人為干擾狀態(tài)下生長，詳細類型和分布見表1；所有樣品經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室王曉麗教授鑒

6、定。表1樣品編號分類及產(chǎn)地略1.2儀器與試劑試驗中用se、Pst、ER、T4DNAlingase、RNA酶試劑來自NEB公司，丙烯酰胺SIGA、聚丙烯酰胺SIGA，接頭和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP來自大連寶生物公司。DY2-20型電泳槽、DYY-12型電泳儀北京市六一儀器廠，PR儀TEHGENE,其余為國產(chǎn)分析純試劑。2方法2.1基因組DNA制備47新穎采集的天麻塊莖或地上莖切成小塊后用改良的TAB法提取基因組DNA，用0.8的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并用核酸蛋白測定儀測定DNA濃度，將樣品用pH8.0TE稀釋后-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.2AFLP分析8，92.2.1天

7、麻基因組DNA的酶切與連接取參加45l如下的酶切連接混和液：ddH237.85l；10NEB2.5l；se接頭(50pll-1)1l；Pst或ER接頭5pll-11l；10ATP1l；5l濃度為100200ngl-1天麻基因組DNA；T4DNAlingase5Ul-10.4l；se10Ul-10.5l；Pst或ER(10Ul-1)0.5l。37保溫過夜后取5l酶切連接產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。2.2.2預(yù)擴增預(yù)擴增PR反響體系20l為：ddH210l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；酶切連接產(chǎn)物2l；引物00(50ng

8、l-1)1l；引物P00或E00(50ngl-1)1l。預(yù)擴增PR反響程序為：95.05in95.035s56.035s72.01inGTSTEP230yles72.05in4.0保溫。反響完畢后取5l預(yù)擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。剩余的預(yù)擴增產(chǎn)物用TE(pH8.0)溶液稀釋20倍后于-20保存，以待選擇性擴增用。2.2.3選擇性擴增選擇性擴增PR反響體系20l為：ddH27l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；稀釋20倍的預(yù)擴增產(chǎn)物5l；引物(50ngl-1)1l；P或E引物(50ngl-1)1l。選擇性擴增PR反響

9、程序為：95.05in95.040s65.0每循環(huán)降低0.740s72.01inGTSTEP213yles95.040s56.040s72.01inGTSTEP624yles72.05in4.0保溫。選擇性擴增產(chǎn)物與7l的LadingBuffer混和，95變性5in，立即轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻，待用。2.2.4選擇性擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析聚丙烯酰胺凝膠電泳時，先安裝好垂直電泳槽然后灌入1TBE電泳液，排除點樣孔氣泡，2500V恒壓預(yù)電泳40in。預(yù)電泳后將7l變性后的選擴產(chǎn)物上樣于點樣孔內(nèi)，2500V恒壓電泳至第一條指示劑條帶跑至膠板底邊時停頓，電泳時間約23h。然后銀染顯帶3。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)

10、計與分析AFLP電泳圖譜用GelPrAnalyzerVersin410分析,只記錄那些可識別的、兩次擴增結(jié)果一致的條帶，同一位點有帶記為“1,無帶記為“0，形成0/1矩陣圖輸入計算機，采用NTSYSp-2.10s軟件的UPGA方法對檢測結(jié)果進展聚類，計算出天麻各樣品的遺傳相似度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1天麻基因組DNA圖譜結(jié)果見圖1。3.2AFLP結(jié)果分析利用從30對引物中挑選出的8對AFLP引物對23份野生天麻種質(zhì)的基因組DNA進展片段長度多態(tài)性擴增，獲得了較好的擴增結(jié)果見表2。共擴增出552條譜帶100700bp，其中396條具有多態(tài)性，占72%，平均每對引物擴增出69條可統(tǒng)計的

11、帶，其中50條具有多態(tài)性?？梢姡珹FLP檢測野生天麻種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高，也充分表達了野生天麻的遺傳多樣性。結(jié)果見圖2。表28對AFLP選擇性擴增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性略3.3遺傳間隔 和聚類分析結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，23株野生天麻種質(zhì)兩兩間的相似系數(shù)分布在0.570.85之間，其中21號與23號的相似系數(shù)最小，為0.584，說明2種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠。2號與3號、12號與13號、19號與20號的相似系數(shù)最大，為0.85，說明這6個種質(zhì)兩兩間的親緣關(guān)系最近。以相似系數(shù)0.57為標準，23株野生天麻種質(zhì)可分為A、B兩大聚類群，其中紅麻和烏麻聚在一起，黃麻和綠麻聚在一起。A聚類群在相似

12、系數(shù)0.58附近又分為2個亞類：第1亞類包括18株，在相似系數(shù)0.66附近又分為兩組，第1組有13株，全部為來自不同產(chǎn)地的烏麻，第2組5株全部為來自不同產(chǎn)地的紅麻。說明野生天麻種間變異度比擬校從圖3還可以看出多數(shù)來源地一樣的種質(zhì)表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系，比方來自遵義地區(qū)的1、2、3、號聚在一起，來自德江的19、20號聚在一起等。但也有同一來源地的品種未聚在一起的情況，比方來自遵義的1、2、3、4、5、6號沒有完全聚在一起。說明同一品種一樣地區(qū)的種間變異度比擬大。第2亞類只有1株，為烏麻品種。B聚類群包括4株，該類包含兩個品種黃麻和綠麻，其中7號綠麻與10號和11號黃麻先聚在一起，再與21號綠麻

13、聚合；7號和21號同為綠麻，但是并沒有聚在一起，可能是因為產(chǎn)地相距較遠。4討論本試驗利用AFLP方法分析了23份野生天麻的遺傳差異，獲得了約72%的多態(tài)性位點。鄒佳寧等1利用RAPD研究天麻種質(zhì)的遺傳關(guān)系，獲得70.97%的多態(tài)性位點，與我們得到的結(jié)果略有差異。這可能是由于AFLP在擴增出豐富的多態(tài)性帶的同時也擴增出了大量的單態(tài)性帶，使得其多態(tài)性帶的百分率并沒有明顯進步。但平均每對引物所產(chǎn)生的多態(tài)性帶數(shù)69條明顯高于前者的7.75條。由此可見，AFLP標記顯然是快速、高效的分子標記。此外，從DNA分子程度上來說，遺傳多樣性越高，說明其遺傳背景越復(fù)雜，該物種存在的歷史越長遠。約72%的多態(tài)性，說

14、明野生天麻在其遺傳進化過程中，基因組DNA發(fā)生了豐富的變異。同時也提醒了野生天麻種質(zhì)資源極其豐富的遺傳多樣性。一個物種的進化潛力和抵御逆境的才能取決于種內(nèi)遺傳變異的大小，遺傳多樣性越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)才能越強，其自然分布范圍越廣。聚類圖中兩大群中大局部同一變型、同一來源地的天麻優(yōu)先聚合，表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系。這與天麻野生種源生態(tài)條件與生態(tài)習(xí)性等綜合因素有關(guān)。但也有同一來源地的品種未聚在一起的情況，這種現(xiàn)象可能是AFLP方可反映基因組本質(zhì)的差異所致。在第一大類中，紅麻和烏麻先聚在一起，再與不同產(chǎn)地的烏麻聚為一大類，同樣第二大類中黃麻和綠麻先聚在一起，再與其它產(chǎn)地的綠麻聚為一大類，這一方面

15、說明野生天麻種間變異度比擬小，紅麻和烏麻遺傳相似度比擬大，黃麻和綠麻遺傳相似度比擬大。另一方面也反映了不同產(chǎn)地的同一品種間變異度比擬大，說明不同的環(huán)境因素可能是造成天麻遺傳變異的主要因素。此與鄒佳寧等對野生和栽培天麻親緣關(guān)系的RAPD分析結(jié)果有相似之處，鄒佳寧等認為，地理分布和生長環(huán)境的差異是導(dǎo)致天麻形成豐富的遺傳多態(tài)性的一個重要的原因。野生天麻種質(zhì)在長期的自然選擇下積累了豐富的遺傳變異，遺傳組成異常復(fù)雜，有必要結(jié)合形態(tài)與分子分類對野生天麻種質(zhì)資源進展更深化的研究，以便為野生天麻種質(zhì)資源利用提供科學(xué)根據(jù)。此外，不同生態(tài)區(qū)野生天麻品種間遺傳差異相對較大。在進展天麻雜交育種時，應(yīng)盡可能選擇生態(tài)類型

16、差異較大的育種材料，以使雜交后代有更多時機出現(xiàn)理想的性狀組合，培育出更多更好的天麻新品種。【參考文獻】1鄒佳寧,宋聚先,常楚瑞，等.貴州天麻種質(zhì)資源的RAPD分析J.中藥材，2022,299：881.2趙永亮，傅體華，范巧佳，等.野生天麻栽培天麻的RAPD和AFLP標記遺傳多態(tài)性分析J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2022，36(17):7119.3關(guān)萍，馬丹煒，王貴俠，等.利用ISSR標記對天麻的貴州種群遺傳多樣性分析J.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2022，296：35.4常楚瑞,王曉麗.一種適于AFLP分析的天麻花葶DNA提取方法J.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2022，306：502.5李相陵，王曉玲，劉安發(fā).天麻總DNA提取的研究J.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2022，305：399.6顏子穎，王海林譯.精編分子生物學(xué)實驗指南.北京：科學(xué)出版社，1998，6:37.7郭寶林,李家實,閻玉凝.中藥材DNA分子標記研究的技術(shù)問題(1)植物藥基因組DNA的提取J.中草藥,2000,31(12):951.8Z