1、 專業資料整理分享 .625/6專業資料整理分享 細胞外囊泡研究新進展王琎1,陳建英2引用本文：王琎,陳建英. 細胞外囊泡研究新進展J.中國組織工程研究,2017,21:621-626.DOI:7.04.022ORCID:0000-0003-4494-3898文章快速閱讀：細胞外囊泡的生物學意義：細胞外囊泡的生物學意義：綜述分析近年相關研究進展文獻檢索細胞外囊泡概念及一般生物學特性分離提取及鑒定方法綜述分析近年相關研究進展文獻檢索細胞外囊泡概念及一般生物學特性分離提取及鑒定方法在生物醫學研究中的意義在生物醫學研究中的意義文題釋義：細胞外囊泡：是由脂質雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡,是細胞自發或

2、在一定條件下釋放出的一種亞細胞成份,實質上是一組納米級顆粒,近年來學界研究的熱點,包括外泌體、膜微粒及微囊泡等。自噬：這是發生在細胞代謝過程以清除代謝廢物或維持細胞器更新的一種現象,其過程如下：首先細胞的一些成分將部分細胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分包裹起來形成自噬體,接著自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內容物,目前研究發現自噬在機體的生理和病理過程中均能見到。摘要背景：細胞外囊泡是細胞旁分泌產生的一種亞細胞成分,近年來學界研究的熱點外泌體、膜微粒及微囊泡等均在其范疇。目的：就細胞外囊泡定義分類、形成釋放過程、分離鑒定方法、生物學意義及其在臨床疾病和生物醫學研究中應用

3、等方面的最新進展作一綜述。方法：由第一作者在PubMed、CNKI等數據庫中進行文獻檢索,關鍵詞為Extracellular Vesicles,exosome,microvesicle,microparticle及細胞外囊泡、外泌體、微囊泡、膜微粒。檢索時間為20XX7月至2016年8月。結果與結論：共納入44篇文獻。幾乎所有的細胞都能產生細胞外囊泡,其中含有脂質、蛋白質、核酸等多種母細胞來源的生物活性成份,這些信息物質包裹在囊泡中或攜帶于膜上。他們參與炎癥免疫反應、細胞間信號通訊、細胞存活與凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等,在生理狀態維持及疾病的進程中發揮重要作用。特定類型的細胞外囊泡有望成

4、為輔助疾病診斷及預后判斷的新分子標記物；在抗腫瘤治療、再生醫學、免疫調節等方面也有著廣闊前景；能為干細胞治療非細胞途徑開辟新路徑；有可能作為疫苗或藥物的天然載體為臨床治療帶來福音。細胞外囊泡分泌的分子機制及其作用于靶細胞引起生物學功能變化的具體成分及其信號通路尚在研究中,以研究miRNA者為主,近年來lncRNA、circRNA開始成為新星逐漸走進學者視野。關鍵詞：組織構建；組織工程；細胞外囊泡；外泌體；組織再生；自噬；藥物載體；非編碼RNA；免疫炎癥；國家自然科學基金主題詞：組織工程；外泌體；再生；自噬；藥物載體基金資助：國家自然科學基金資助項目Research progress of ex

5、tracellular vesiclesWang Jin1, Chen Jian-ying2 1GraduateSchool of GuangdongMedicalUniversity, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China; 2Third Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, 王琎王琎,女,1989年生,漢族,XX省人,碩士。 通訊作者：陳建英,主任醫師,碩士生導師,XX醫科大學附屬醫院心內三區,XX省XX市524001 中

6、圖分類號:R394.2文獻標識碼:A文章編號:2095-434404-00621-06稿件接受：2016-11-26Wang Jin, Master, Graduate School of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong ProvinceCorresponding author: Chen Jian-ying, Chief physician, Masters supervisor, Third Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guangdong

7、 Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, ChinaBACKGROUND: Extracellular vesicles are a kind of subcellular component produced by paracinemechanism including exosomes, microparticles and microvesicles, which have become hotspots in recent years.OBJECTIVE: To review the research stat

8、us and progress of EVs, especially in the studies about definition, secreting mechanism, isolation and identification, biological characteristics and functions in diseases as well as in biomedical research.METHODS: The first author retrieved PubMed and CNKI databases for relative articles published

9、from July 2006 to August 2016. The keywords were extracellular vesicles, exosome, microvesicle, microparticle in English and Chinese, respectively.Subject headings: Tissue Engineering; Exosomes; Regeneration; Autophage; Drug CarriersFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 8137

10、0242Cite this article: Wang J, Chen JY.Research progress of extracellular vesicles. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21:621-626.0引言 Introduction細胞外囊泡是細胞旁分泌產生的一種亞細胞成分,實質上是一組納米級顆粒,近年來學界研究的熱點外泌體、膜微粒、微囊泡等均在其范疇。Chargaff等1在1946年首次發現血漿中含有一種能加速血栓形成的可沉淀的物質,他們稱之為因子。Wolf等2在1967年報道活化血小板能釋放富含磷脂的細胞膜來源的微粒,并具有

11、促凝血作用的,將其命名為血小板塵埃。隨后的相關研究多是用術語膜微粒來描述這類物質3。Johnstone等4-5在1983年觀察綿羊網織紅細胞變為成熟紅細胞晚期過程中發現,紅細胞能將代謝終產物通過一些小囊泡釋放到細胞外,并于1987年命名這類小囊泡為外泌體。起初大家普遍認為這些微粒是垃圾桶,是為清除細胞代謝廢物、是提示細胞死亡的信號分子亦或者是某些特有器官的細胞器結構,到了20世紀90年代末,細胞外囊泡的生物學功能漸漸受到研究者們重視6 。學者們意識到這些細胞外囊泡攜帶有膽固醇、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、神經節苷細胞外囊泡是一組異質性較大的群體,參與機體多種反應,經歷了從無人問津到趨之若鶩的戲劇性變

12、化,有望成為新型分子標記物用于疾病診斷、判斷評估疾病預后,有望作為新藥研發對象11。但由于描述的術語不統一,相關研究結果存在混淆,為了方便眾多研究者學習,文章就細胞外囊泡定義分類、形成釋放過程及機制、分離鑒定方法、生物學意義及其在臨床疾病和生物醫學研究中應用等方面的最新進展作一綜述。1 資料和方法 Data and methods1.1 資料來源由第一作者應用計算機檢索CNKI 數據庫和PubMed數據庫相關文獻。檢索時間范圍：20XX7月至2016年8月。中文檢索詞為：細胞外囊泡、外泌體、微囊泡、膜微粒；英文檢索詞為Extracellular Vesicles,exosome,microve

13、sicle,microparticle。1.2入選標準：納入標準：論點、論據可靠的細胞外囊泡研究。同一領域的細胞外囊泡研究文獻選擇近期發表或權威、專業雜志的文獻。1.3文獻質量評估根據納入標準,作者先閱讀經相關關鍵詞篩選出的文獻標題和摘要進行初步篩選,排除與研究目的不符或重復性文章,選取英文文獻113篇,中文文獻14篇,查閱全文。持嚴謹科學態度,盡量查詢引用原始文獻資料,按照納入標準,最后選擇44篇作為引用文獻進行寫作。對對CNKI、PubMed數據庫中2006至2016年的文獻進行計算機檢索將共44篇文獻納入分析全體作者共同篩選圖1 文獻檢索流程2 結果 Results2.2細胞外囊泡形成、

14、釋放機制及過程細胞外囊泡主要存在于細胞生存的微環境中,如細胞培養上清以及各種體液等14。幾乎所有的細胞都可自發或在一定刺激條件下產生和釋放細胞外囊泡,如上皮細胞、未成熟樹突狀細胞等會自發的產生和釋放細胞外囊泡15。刺激條件主要包括細圖2圖2 細胞外囊泡的分類圖注：細胞外囊泡據分泌方式不同分3類,一種是多泡小體脫離溶酶體途徑與母細胞胞膜特定部位融合釋放出外泌體；一種是通過出芽的形式釋放出膜微粒；還有一種就是釋放出凋亡小體15。胞活化、氧化應激、細胞癌性轉化、放射損傷、細胞死亡和凋亡等16,如骨髓間充質干細胞經低氧或低營養誘導后會分泌釋放細胞外囊泡17。微囊泡：分子直徑100-1000 nm,也有

15、文獻稱之為脫落囊泡或Ectosomes。形成過程相對簡單,是直接通過出芽方式從母細胞膜表面脫落產生,大小不均一,高表達磷脂酰絲氨酸,沒有特定的表面分子標記物,但和外泌體一樣表達母細胞來源的表面標記物22。如EMV表達CD31,PMV表達CD42b,白細胞來源的表達CD45,網織紅細胞來源的表達轉鐵蛋白受體分子,抗原呈遞細胞來源的富含MHC-,。微囊泡中也含有如金屬蛋白酶等外泌體中不包含的一些物質。凋亡小體：是細胞程序性死亡或凋亡晚期釋放的微粒,文章不贅述,這類囊泡顆粒較大,分子直徑為500-4000 nm,具有Annexin V高親和力,富含死細胞碎片的濃縮DNA,能將這些DNA運載入巨噬細胞

16、細胞核中。2.3細胞外囊泡分離提取和鑒定方法2.4細胞外囊泡生物學功能細胞外囊泡所攜帶信息物質目前Vesiclepedia中記錄了來自33種不同種類的538份研究統計分析出細胞外囊泡中含有92 897種蛋白,27 642 種mRNAs,4934種 miRNAs和584種脂質等24。蛋白質譜分析發現這些蛋白包括血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉化生長因子、MAPK通路信號分子、RHO通路信號分子、Tie-2/TEK及細胞黏附分子等。這些蛋白質分子部分是酶類,酶催化具有高效性,能夠放大其效應,相比RNA,進入內皮細胞的蛋白質能夠即時迅速發揮作用,在維持血管新生以及維持

17、血管功能及修復損傷組織等方面起主要作用。Ratajczak等25證實小鼠胚胎干細胞來源的MVs能把蛋白質和mRNA轉運到造血祖細胞中,并使其重新編程,這一作用經RNase處理微粒后不復存在,表明有微粒轉運的mRNA不僅能穩定存在于靶細胞,還能在靶細胞內被翻譯成相應蛋白。近年來有研究者報道在這類囊泡中發現lncRNA、circRNA等noncodingRNA及gDNA20-21,26。microRNA 是一類長約22 nt且高度保守的單鏈小分子RNA,本身不編碼蛋白質但能夠在轉錄后水平調控基因的表達。且一個miRNA能夠調控多個mRNA,而一個mRNA能同時被多個miRNA調控,目前已知miRN

18、A的功能有調控細胞的增殖、分化和代謝,并與心血管疾病、腫瘤、白血病等疾病的發生、發展有著密切聯系。lncRNA即長鏈非編碼RNA,是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA,能干擾mRNA的剪切,他在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多層面調控基因的表達。circRNA即環狀RNA,是一類特殊的非編碼RNA分子,富含miRNA結合位點,在細胞中起到miRNA海綿的作用,進而解除miRNA對靶基因的抑制作用,升高靶細胞外囊泡參與細胞間物質、信息傳遞在生理、病理條件下,細胞外囊泡將其攜帶生物信息運輸到周邊靶細胞或經2.5細胞外囊泡參與疾病的發生發展 中樞神經細胞來源的細

19、胞外囊泡可以進入血液循環并在外周循環中發揮其促增殖、分化及抗凋亡的作用,在阿爾茨海默病和帕金森病等退行性疾病及其他中樞神經系統疾病中發揮著重要作用。內皮細胞來源細胞外囊泡本身與機體高凝傾向和小血管炎癥等微循環障礙疾病有密切關系30。T細胞來源的外泌體可通過磷脂酰絲氨酸識別單核細胞膜表面的受體,誘導膽固醇堆積,進而促進動脈粥樣硬化形成31。類風濕性關節炎患者關節滑液來源的纖維母細胞分泌的細胞外囊泡攜帶的TNF-結合于T淋巴細胞后抵抗機體活化誘導的細胞死亡,從而加重關節炎癥狀32。細胞外囊泡也參與體內自噬過程,有研究指出,經煙霧提取物誘導人氣道上皮細胞后收集到的HBEC-細胞外囊泡中miR-210

20、表達量上調,后者作圖3圖3 以外泌體為例闡釋細胞外囊泡與靶細胞信息傳遞方式圖注：圖A顯示富含母細胞信息的外泌體從細胞中釋放出來；B：通過其攜帶的特異性表面分子配體與靶細胞上相應受體位點結合；C：直接與靶細胞質膜融合,釋放其內容物到靶細胞胞質中；D：改變外泌體作用方式時對靶細胞影響；E：通過內陷以類似胞吞作用的機制將信息直接傳遞給靶細胞。用于體高表達FasL配體當與CD8+T細胞上FasL受體結合后能誘導CD8+T細胞凋亡,導致腫瘤免疫逃逸。此外,細胞外囊泡 不僅與腫瘤細胞增殖、上皮間質轉化及遠處轉移相關,在腫瘤細胞耐藥方面也發揮重要作用。總之,細胞外囊泡在生理狀態維持以及細胞遷移、血管新生、血

21、栓形成、免疫炎癥反應、腫瘤浸潤和轉移等過程中發揮重要作用29。2.6細胞外囊泡能作為標記物診斷疾病、評估預后細胞外囊泡有望作為一種非侵入性標記物,在心血管疾病、腎臟疾病、中樞神經系統疾病診斷以及癌癥等的早期篩查等方面起重要作用。這一作用主要有賴于細胞外囊泡攜帶的生物信息物質,尤其是RNA,有文獻報道,急性冠脈綜合征患者血清中,肌特異性miR-1和miR-133a表達水平升高,并且這一變化和肌鈣蛋白T水平相關7。血液中膜微粒與內皮祖細胞的比值能反應ACS中內皮細胞凋亡與修復的變化情況33。血液循環中細胞外囊泡攜帶的miRNA可以用于心肌梗死、腦膜瘤的診斷；尿液細胞外囊泡中含有一些蛋白質、miRN

22、A可輔助診斷腎臟疾病及膀胱癌等34。2.7細胞外囊泡能作為藥物或藥物載體發揮治療作用近幾年來研究證實干細胞來源的細胞外囊泡有著類似于干細胞的生物學功能同時兼具其他眾多優點,如體積小、易穿透生物膜、免疫原性低等,且其特殊的脂質雙分子層膜性結構可保護其內容物的降解,同時抵擋RNAse對核酸的破壞,保證其生物學活性。這類囊泡能通過調節免疫炎癥反應、調節血管內皮細胞及平滑肌細胞功能、抗纖維化、促血管及細胞再生、改善受損細胞的凋亡及增殖等多種機制對多種疾病發揮治療作用,且這種作用在組織再生和修復中尤為突出,能為干細胞治療非細胞途徑開辟新路徑39。間充質干細胞-細胞外囊泡能減少大鼠缺血再灌注腎臟損傷模型及

23、小鼠殘腎模型中腎臟淋巴細胞浸潤。促進大鼠腦卒中損傷后組織修復。可減輕肺小動脈壁的增生肥厚,減輕肺血管狹窄及重構,改善肺血流動力學異常,從而有效降低肺動脈壓力,提高肺動脈高壓實驗大鼠生存質量及存活率。一項關于小鼠心肌梗死模型研究表明,來源于過表達HIF-1的心臟內皮細胞來源的exosome與心臟祖細胞共同輸注到成年NOD/SCID小鼠中能提高移植CPC的存活,改善心肌梗死損傷,并證實是exosome中富含的miR-126、miR-210起作用40。誘導性多潛能干細胞來源的細胞外囊泡用于組織再生治療,則可大大降低誘導性多潛能干細胞的致瘤等風險,這些都為干細胞非細胞途徑治療疾病提供新視角。也有學者報

24、道,一定條件下,用腫瘤抗原刺激樹突細胞后獲取的細胞外囊泡能誘導抗腫瘤免疫反應,而有望用于腫瘤治療,目前已有臨床一期實驗相關報道10-11。基于細胞外囊泡而進行的免疫療法越來越引人注意,有學者提出有望將其作為疫苗用于預防傳染性疾病,但目前還缺乏臨床實驗數據。3小結Conclusion作者貢獻：文章設計、實施、評估為第一作者和通訊作者。資料收集為第一作者。利益沖突：所有作者共同認可文章內容不涉及相關利益沖突。倫理問題：文章內容不涉及倫理問題。文章查重：文章出版前已經過CNKI反剽竊文獻檢測系統進行3次查重。文章外審：文章經國內小同行外審專家雙盲外審,符合本刊發稿宗旨。作者聲明：文章第一作者對研究和

25、撰寫的論文中出現的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數據記錄及樣本已按照有關規定保存、分享和銷毀,可接受核查。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章,文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協議。根據知識共享許可協議署名-非商業性使用-相同方式共享3.0”條款,在合理引用的情況下,允許他人以非商業性目的基于原文內容編輯、調整和擴展,同時允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級鏈接該文獻,并為之建立索引,用作軟件的輸入數據或其他4參考文獻ReferencesWolf P. The nature and signif

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