1、第四章 透射電鏡的其他制樣技術(shù)冷凍超薄切片技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)負染色技術(shù)電鏡酶細胞化學技術(shù)電鏡免疫細胞化學技術(shù)電鏡放射自顯影技術(shù)電鏡X射線微區(qū)分析制樣技術(shù)第一節(jié) 冷凍超薄切片技術(shù)p172冷凍超薄切片技術(shù)是將組織從活體取下后，經(jīng)過簡單的固定或不固定就直接冷凍，并在冷凍的條件下進行超薄切片的技術(shù)。冰凍超薄切片流程固定（低濃度戊二醛，短時間固定）明膠“包埋”（明膠或甲基纖維素、醛交聯(lián)的牛血清白蛋白，此步可省略）冷凍保護處理（甘油、蔗糖、二甲基亞砜）超低溫快速冷凍（液氮直接冷凍，借助金屬材料，使用制冷劑）冷凍切片（- 90 -105）染色（負染色，正染色，不染色）優(yōu) 點 新鮮組織不經(jīng)過任何化學處理或只經(jīng)輕

2、微化學處理，組織的化學成分不發(fā)生改變、可溶性成分不被提取、酶不被破壞、抗體活性得到很好保存。適于細胞化學（酶、免疫）分析及X射線微區(qū)分析。技術(shù)關(guān)鍵是識別與下述因素有關(guān)的假象： 瞬時或完全解凍 冷凍干燥切片的偶然再水化 冰的移動再結(jié)晶造成可溶性元素重新分布 冷凍切片的污染第二節(jié) 冷凍蝕刻技術(shù)p178 冷凍蝕刻技術(shù)是冷凍斷裂技術(shù)和復型技術(shù)相結(jié)合的一種樣品制備技術(shù)，是通過冷凍后，將組織劈開，顯示其不同劈裂面的細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，經(jīng)加溫使其結(jié)構(gòu)表面的冰升華，然后用鉑、碳噴鍍得到復型膜，腐蝕掉組織后就留下其內(nèi)部細微結(jié)構(gòu)真實的自然形貌的復型膜。 在顯示生物膜的結(jié)構(gòu)以及細胞連接方面有著獨特的作用。一、塑料一級復

3、型樣品上滴濃度為1%的火棉膠醋酸戍酯溶液或醋酸纖維素丙酮溶液，溶液在樣品表面展平，多余的用濾紙吸掉，溶劑蒸發(fā)后樣品表面留下一層100nm左右的塑料薄膜。分辨率低（1020nm）電子束照射下易分解和破裂。a-樣品及電子強度示意圖b-0.3%C鋼，600回火0.5h，6000塑料一級復型 a-投影 b-噴碳投影和噴碳示意圖a-樣品及電子強度示意圖b-k-3鎳基高溫合金，擴散層中相，7000碳一級復型b- k-3鎳基高溫合金，擴散層中相，7000塑料-碳二級復型a-樣品制備示意圖二級復型照片（一）二級復型照片（二）復型薄膜ER 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) M 線粒體優(yōu)點：大面積暴露膜的表面結(jié)構(gòu)，一般超薄切片法難以達到標

4、本制作過程中，可以不受化學固定、脫水、包埋等的不利影響，能觀察到更接近生活狀態(tài)的細胞超微結(jié)構(gòu)可以對細胞或細胞器斷裂面作電鏡的三維立體觀察第三節(jié) 負染色技術(shù)p142又稱為陰性反差染色。原理： 密度反差原理某樣品如果被密度比自身大2倍以上的物體浸沒時，電鏡下就形成強反差像 異常反差原理由于靜電場作用所形成的反差特點：提高了標本的反差和分辨率 簡便易行，不要求高純度的樣品 染色本身不改變生物標本的活性負染色技術(shù)常用染液染液為重金屬鹽類，常用的有：1%3%的磷鎢酸鉀、磷鎢酸鈉（ pH6.47.0 ）0.1%1%的醋酸鈾水溶液（ pH4.5）常用方法： 現(xiàn)將要觀察的生物樣品制成適當濃度的懸液（105/m

5、l），滴一滴在覆有Formvar膜或碳膜的銅網(wǎng)上，沉淀510min后用濾紙吸去多余液體。在銅網(wǎng)上液滴將干未干時將染色劑滴在銅網(wǎng)上，染色510min，濾紙吸干觀察。避免標本凝集現(xiàn)象 生物標本凝集成團的原因：可能是由于標本表面張力、標本帶電荷、支持膜的“疏水”作用及其制備的標本的質(zhì)量、懸液的酸堿度等問題 解決辦法：采用分散劑（BSA） 具體：在0.5ml樣品內(nèi)加入34滴0.005%0.05%牛血清白蛋白（BSA），或直接用0.01% BSA作為離心沉淀物的稀釋劑甲型流感病毒，多形態(tài)性（園，橢圓，絲狀體），外膜有放射狀排列的纖突第四節(jié) 電鏡酶細胞化學技術(shù)p103目前電鏡下能定位的酶還不到100種，而

6、且只能作定性觀察，即通過酶的活性間接證明酶的存在。原理：先將酶原位固定在細胞內(nèi)，再使它與特定底物起反應(yīng)，底物的分解物經(jīng)過捕捉反應(yīng)沉著于發(fā)生分解的原位上，最后使沉著物變?yōu)殡婄R下可以見到的物質(zhì)。電鏡下能定位的酶：水解酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶（應(yīng)用少）1. 水解酶水解酶：磷酸酶類，酯酶類，芳香基硫酸酯酶，糖苷酶，作用于肽鍵的酶孵育液：酶的反應(yīng)底物&捕捉劑（重金屬類，如鉛、銅、鋇、鈰等）反應(yīng)基本原理：底物 初級反應(yīng)產(chǎn)物 最終反應(yīng)產(chǎn)物 酶 捕捉劑（多為不溶性金屬沉淀物）2. 氧化酶氧化酶H2O2H2OnDABDAB鋨黑（高電子密度）氧化聚合物OsO43. 脫氫酶琥珀酸脫氫酶琥珀酸延胡索酸酶鐵氰化物亞鐵氰化物亞

7、鐵氰化銅沉淀Cu2+酶細胞化學的常規(guī)操作取材 固定（低濃度的戊二醛）置換緩沖液（建立適宜的pH條件）孵育（新鮮配制的孵育液）漂洗組織（去除剩余試劑，特別是鉛離子）后固定（1%四氧化鋨）脫水包埋（同常規(guī)，脫水時間縮短）超薄切片與染色對照實驗（去除特異性反應(yīng)）酶及其在細胞內(nèi)的定位部位酸性磷酸酶溶酶體，高爾基堿性磷酸酶細胞膜葡萄糖-6-磷酸酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜乙酰膽堿酯酶神經(jīng)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜，突出間隙琥珀酸脫氫酶線粒體內(nèi)膜和嵴細胞色素氧化酶線粒體膜和嵴焦磷酸硫胺素酶高爾基體腺苷三磷酸酶分解ATP，耗能部位髓過氧化物酶粒細胞和單核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜、高爾基體和胞質(zhì)顆粒中血小板過氧化物酶巨黑包的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及血小

8、板致密管道系統(tǒng)第五節(jié) 電鏡免疫細胞化學技術(shù)p110免疫電鏡（immunoelectron microscopy,IEM）技術(shù)使利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。為研究細胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段分為：免疫凝集電鏡技術(shù)，免疫電鏡定位技術(shù)免疫電鏡技術(shù)的三個發(fā)展階段：1959年 鐵蛋白標記技術(shù)1968年 酶標記技術(shù)1970s 膠體金標記技術(shù)1. 鐵蛋白標記技術(shù) 鐵蛋白分子質(zhì)量大，電子密度高，適用于定位細胞膜表面抗原。2. 酶標記技術(shù)酶與抗體交聯(lián) 優(yōu)點： 可用于細胞內(nèi)的定位 可現(xiàn)在光鏡結(jié)果陽性部位定位后進一步電鏡觀

9、察缺點： 酶反應(yīng)產(chǎn)物會發(fā)生一定程度的擴散，因此分辨率不高3. 膠體金標記技術(shù) 膠體金作為特異細胞成分的標記物可用于細胞表面和細胞內(nèi)多種抗原的精確定位，使目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標記物。優(yōu) 點：膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯變化金顆粒定位比酶反應(yīng)物更精確膠體金標記物易于制備，可進行免疫電鏡的雙重或多重標記金顆粒能發(fā)射強烈的二次電子，使掃描電鏡的理想標記物經(jīng)過銀顯影增強后的金顆粒呈現(xiàn)黑（褐）色，能用于光鏡觀察能用于冷凍蝕刻標本的免疫標記 常用免疫電鏡方法的原理及步驟PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又稱可溶性酶-抗酶法。特點為參加反應(yīng)的抗體都

10、不被酶直接標記。包括以下步驟：用一抗（Ab1）與組織中特異性抗原（Ag）相結(jié)合形成抗原抗體（AgAb1）復合物；用二抗（Ab2）的一個Fab段與一抗結(jié)合，另一個Fab段游離，形成抗原-一抗-二抗（Ag-Ab1-Ab2）復合物；用過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物（PAP，與Ab1同種動物的血清）與二抗的游離Fab段結(jié)合，形成Ag-Ab1-Ab2PAP復合物；用過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）使PAP的過氧化物酶形成不溶、暗棕色的嗜鋨化合物。PAP（peroxidase-antiperoxidase）法優(yōu)點： 保存抗體活性好；PAP復合物穩(wěn)定；敏感性高，比間接免疫熒光抗體法敏感性高1001000倍；

11、節(jié)約抗體用量,也減少非特異性背景染色。缺點：反應(yīng)產(chǎn)物顆粒較大，遮蓋背景；DAB有致癌作用，操作中需小心；內(nèi)源性氧化酶對此法有干擾。 ABC法 基本原理： 抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物技術(shù)（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex Technique）簡稱 ABC技術(shù)，是目前常用的免疫細胞化學技術(shù)之一。1979年Guessdon首先把生物素-卵白素技術(shù)用于免疫組織化學，先后設(shè)計出橋式卵白素-生物素（BAB）技術(shù)和標記式卵白素一生物素（LAB）技術(shù)，1981年Hsu和許世明在BAB法和LAB法基礎(chǔ)上改良而建立了ABC法， 其基本原理與PAP法相似，特點是利用抗生物素分

12、別連接生物素標記的二抗和生物素標記的過氧化物酶，形成抗原-一抗-生物素標記的二抗-抗生物素過氧化物酶復合體（AgAb1Ab2ABC）。抗生物素又稱卵白素（Avidin），它有四個活動結(jié)合點，并與生物素有特別高的親和力，一旦和生物素結(jié)合就極為穩(wěn)定。當生物素和二抗共價偶聯(lián)后，就使二抗獲得與抗生物素相結(jié)合的能力。ABC法第六節(jié) 電鏡放射自顯影技術(shù)p143 放射自顯影術(shù)(autoradiography,ARG)： 是使用感光材料（核乳膠、X膠片）與含有放射性核素標本接觸，從而檢測出放射性核素標記的探針、核苷酸等存在于靶基因、蛋白、細胞內(nèi)的一種示蹤定位技術(shù)。 放射性核素標本放射性同位素所發(fā)射的帶點離子（通常用離子）原 理： 感光材料中的溴化銀被帶電粒子作用，釋放出電子。 AgBr + Ag+Br + e- 該電子被正電荷的銀離子俘獲。 e- + Ag+ Ag 正電荷的銀離子被還原，在溴化銀分子中形成潛影 Ag Ag nAg 經(jīng)顯影、定影處理，在X膠