1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)實(shí)驗(yàn)一、光學(xué)顯微鏡的基本使用方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理和保養(yǎng)方法；2. 掌握光學(xué)顯微鏡的操作。二、實(shí)驗(yàn)要求1遵守實(shí)驗(yàn)室安全制度，聽從指導(dǎo)教師安排；2認(rèn)真聽講，不懂就問；3完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告三、實(shí)驗(yàn)儀器和材料1光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、香柏油、二甲苯2微生物示范片：蛙血涂片四、顯微鏡的結(jié)構(gòu)、光學(xué)原理及其操作方法（一）顯微鏡的結(jié)構(gòu)和光學(xué)原理 顯微鏡分機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩部分。 1機(jī)械裝置 （1）鏡筒：鏡筒上端裝目鏡，下端接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒和雙筒兩種。單筒有直立式

2、（長度為160mm）和后傾斜式（傾斜45）。雙筒全是傾斜式的，其中一個(gè)筒有屈光度調(diào)節(jié)裝置，以備兩眼視力不同者調(diào)節(jié)使用。兩筒之間可調(diào)距離，以適應(yīng)兩眼寬度不同者調(diào)節(jié)使用。 （2）轉(zhuǎn)換器：轉(zhuǎn)換器裝在鏡筒的下方，其上有3個(gè)孔，有的有4個(gè)或5個(gè)孔。不同規(guī)格的物鏡分別安裝在各孔上。 （3）載物臺(tái)：戴物臺(tái)為方形（多數(shù)）和圓形的平臺(tái)，中央有一光孔，孔的兩側(cè)各裝1個(gè)夾片，載物臺(tái)上還有移動(dòng)器（其上有刻度標(biāo)尺），可縱向和橫向移動(dòng)，移動(dòng)器的作用是夾住和移動(dòng)標(biāo)本用。 （4）鏡臂：鏡臂支撐鏡筒、載物臺(tái)、聚光器和調(diào)節(jié)器。鏡臂有固定式和活動(dòng)式 （可改變傾斜度）兩種。 （5）鏡座：鏡座為馬蹄形，支撐整臺(tái)顯微鏡，其上有反光鏡。

3、（6）調(diào)節(jié)器：調(diào)節(jié)器包括大、小螺旋調(diào)節(jié)器（調(diào)焦距）各一個(gè)。可調(diào)節(jié)物鏡和所需觀察的物體之間的距離。調(diào)節(jié)器有裝在鏡臂上方或下方的兩種，裝在鏡上方的是通過升降鏡臂來調(diào)焦距，裝在鏡臂下方的是通過升降載物臺(tái)來調(diào)焦距，新式顯微鏡多半裝在鏡臂的下方。2光學(xué)系統(tǒng)及其光學(xué)原理 （1）目鏡：每臺(tái)顯微鏡備有3個(gè)不同規(guī)格的目鏡，例如，5倍（5）、10倍（10）和15倍（15），高級(jí)顯微鏡除了上述三種外，還有20倍（20）的。（2）物鏡：物鏡裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，物鏡有低倍（8、10、20三種）、高倍（40或45）及油鏡（100）。物鏡的性能由數(shù)值孔徑（N.A.）決定，數(shù)值孔徑=n. sin/2，其意為玻片和物鏡之間的折射

4、率乘上光線投射到物鏡上的最大夾角的一半的正弦。光線投射到物鏡的角度越大，顯微鏡的效能越大，該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。n是影響數(shù)值孔徑的因素，空氣的折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.52，用油鏡時(shí)光線入射/2為60，則sin60=0.87。 以空氣為介質(zhì)時(shí)：N.A.=l0.87=0.87 以水為介質(zhì)時(shí)：N.A.=1.330.87=1.16 以香柏油為介質(zhì)時(shí)：N.A.=1.520.87=1.32 顯微鏡的性能還依賴于物鏡的分辨率，分辨率即能分辨兩點(diǎn)之間的最小距離的能力。分辨率用表示，（為波長），分辨率與數(shù)值孔徑成正比，與被長成反比。增大數(shù)值孔徑，縮短波長可提高顯

5、微鏡的分辨率，使目的物的細(xì)微結(jié)構(gòu)更清晰可見。事實(shí)上可見光的波長（0.380.7）是不可能縮短的，只有靠增大數(shù)值孔徑來提高分辨率。 物鏡上標(biāo)有：NA125、100、“OI”、160/0.17、0.16等字樣，其中NA1.25為數(shù)值孔徑，100為放大倍數(shù)，“160/0.17”中160表示鏡筒長，0.17表示要求蓋玻片的厚度。“OI” 顯微鏡的總放大倍數(shù)為物鏡放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 （3）聚光器：聚光器安裝在載物臺(tái)的下面，反光鏡反射來的光線通過聚光器被聚集成光錐照射到標(biāo)本上，可增強(qiáng)照明度，提高物鏡的分辨率。聚光器可上、下調(diào)節(jié)，它中間裝有光圈可調(diào)節(jié)光亮度，在看高倍鏡和油鏡時(shí)需調(diào)節(jié)聚光器，合理調(diào)

6、節(jié)聚光器的高度和光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹蘸颓逦膱D像。 （4）反光鏡：反光鏡裝在鏡座上，有平、凹兩面，光源為自然光時(shí)用平面鏡，光源為燈光時(shí)用凹面鏡。它可自由轉(zhuǎn)動(dòng)方向。反光鏡可反射光線到聚光器上。（5）濾光片：自然光由各種波長的光組成，如只需某一波長的光線，可選用合適的濾光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。濾光片有紫、青、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等顏色。根據(jù)標(biāo)本顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。 圖1.普通光學(xué)顯微鏡五、實(shí)驗(yàn)步驟及內(nèi)容1低倍鏡的操作（1）置顯微鏡于固定的桌上。窗外不宜有障礙視線之物。（2）旋動(dòng)轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡移到鏡筒正下方，和鏡筒對直。（3）轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡向著光源處，同時(shí)用眼對準(zhǔn)目鏡（

7、選用適當(dāng)放大倍數(shù)的目鏡）仔細(xì)觀察，使視野亮度均勻。（4）將標(biāo)本片放在載物臺(tái)上，使觀察的目的物置于圓孔的正中央。（5）將粗調(diào)節(jié)器向下旋轉(zhuǎn)（或載物臺(tái)向上旋轉(zhuǎn)），眼睛注視物鏡，以防物鏡和載玻片相碰。當(dāng)物鏡的尖端距載玻片約0.50cm（6）左眼向目鏡里觀察，將粗調(diào)節(jié)器向上旋轉(zhuǎn)，如果見到目的物，但不十分清楚，可用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，至目的物清晰為止。（7）如果粗調(diào)節(jié)器旋得太快，使超過焦點(diǎn)，必須從第（5）步重調(diào)，不應(yīng)正視目鏡情況下調(diào)粗調(diào)節(jié)器，以防沒把握的旋轉(zhuǎn)使物鏡與載玻片相碰撞壞。（8）觀察時(shí)兩眼同時(shí)睜開（雙眼不感疲勞）。單筒顯微鏡應(yīng)習(xí)慣用左眼觀察，以便于繪圖。2高倍鏡的操作（1）使用高倍鏡前，先用低倍鏡觀察，

8、發(fā)現(xiàn)目的物后將它移到視野正中處。（2）旋動(dòng)轉(zhuǎn)換器換高倍鏡，如果高倍鏡觸及載玻片立即停止旋動(dòng)，說明原來低倍鏡就沒有調(diào)準(zhǔn)焦距，目的物并沒有找到，要用低倍鏡重調(diào)。如果調(diào)對了，換高倍鏡時(shí)基本可以看到目的物。若有點(diǎn)模糊，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)就清晰可見。3油鏡的操作（1）如果用高倍鏡目的物未能看清，可用油鏡。先用低倍鏡和高倍鏡檢查標(biāo)本片，將目的物移到視野正中。（2）在載玻片上滴一滴香柏油（或液體石蠟），將油鏡移至正中使油鏡頭浸沒在油中，剛好貼近載玻片。用細(xì)調(diào)節(jié)器微微向上調(diào)（切記不用粗調(diào)節(jié)器）即可。（3）油鏡觀察完畢，用擦鏡紙將鏡頭上的油揩凈，另用擦鏡紙蘸少許二甲苯揩拭鏡頭，再用擦鏡紙揩干。4用鉛筆分別繪出各種細(xì)菌

9、的形態(tài)圖。六、數(shù)據(jù)整理七、實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意事項(xiàng)及心得1.取、送顯微鏡時(shí)要輕拿輕放，一定要一手握住彎臂，另一手托住底座。顯微鏡不能傾斜，以免目鏡從鏡筒上端滑出。不可把顯微鏡放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的邊緣，以免碰翻落地。取拿顯微鏡罩子的時(shí)候也一定輕取，以免將目鏡從鏡筒上帶出摔壞。2.顯微鏡的光學(xué)部分只能用特殊的擦鏡紙擦拭，切忌亂用他物擦拭，更不能用手觸摸透鏡，以免汗液玷污透鏡。3.轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，不要用手直接旋轉(zhuǎn)物鏡鏡頭，只能轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器。4.使用高倍物鏡時(shí)，勿用粗準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)焦距，以免移動(dòng)距離過大，損壞物鏡和玻片。5.調(diào)節(jié)顯微鏡的焦距從低倍到高倍，用油鏡時(shí)，直接從低倍到油鏡。6.油鏡使用過后應(yīng)用擦鏡紙蘸二甲苯擦

10、拭干凈，如此兩次，第三次用干凈的擦鏡紙直接擦拭鏡頭。八、思考題1如何保養(yǎng)和維護(hù)好一臺(tái)光學(xué)顯微鏡？2油鏡為什么要先用低倍和高倍鏡檢查？先用低倍鏡和高倍鏡觀察，可逐漸縮小視野范圍，選取目的物，便于觀察。實(shí)驗(yàn)二、各類細(xì)胞形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解動(dòng)、植物細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；2. 初步掌握臨時(shí)玻片標(biāo)本的制備方法；3. 掌握顯微測量的基本方法；4. 初步掌握光學(xué)顯微鏡下所見細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)的繪圖記錄方法；5. 進(jìn)一步掌握光學(xué)顯微鏡的規(guī)范使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位。構(gòu)成人體和其他高等動(dòng)植物的細(xì)胞種類繁多，形態(tài)各異。有球形、橢圓形、扁平形、立方體、長梭形、星形等。

11、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)是很多細(xì)胞的共同特點(diǎn)，在分化程度較高的細(xì)胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進(jìn)化過程所形成的。例如：具有收縮功能的肌細(xì)胞呈長梭形或條形；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動(dòng)機(jī)能的神經(jīng)細(xì)胞有長短不一的樹枝狀凸起；游離的血細(xì)胞為圓形、橢圓形或圓餅形。高等生物體不同細(xì)胞的大小差異很大，其直徑大多數(shù)在10-100um，一般都需借助顯微鏡才能看到。由于細(xì)胞較小，而且其內(nèi)含有較大比例的水分，故大多數(shù)是無色透明的，如果不經(jīng)過染色處理，在顯微鏡下很難看清細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。因此，要觀察細(xì)胞時(shí)，通常先進(jìn)行染色處理。雖然細(xì)胞的形態(tài)、大小和功能各不相同，但在普通光學(xué)顯微鏡下，一般可見人體及動(dòng)物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)可分為細(xì)胞

12、膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核三部分。但也有例外。哺乳類紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞核消失。植物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)可分為細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核四部分。任何動(dòng)、植物細(xì)胞都具有特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行固定和染色等處理，便可以在顯微鏡下分辨清楚，然后借用目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺，便可測量大小。三、實(shí)驗(yàn)用品材料與標(biāo)本：洋蔥、人口腔粘膜上皮細(xì)胞、人血涂片標(biāo)本、神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)本儀器與器材：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、目鏡測微尺、擦鏡紙、吸水紙、手術(shù)器材一套、消毒牙簽、解剖盤一個(gè)、小平皿兩個(gè)試劑：1%甲苯胺藍(lán)、1%碘液，1%甲基藍(lán)、瑞氏染液、Ringer氏液四、實(shí)驗(yàn)方法步驟（一）洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞的標(biāo)本制備取干凈載玻片，中央滴一滴

13、1%碘液；取洋蔥鱗莖，用鑷子在其內(nèi)表面輕輕撕取一小塊方形膜質(zhì)表皮（邊長3-4mm），置于載玻片的碘液中，鋪平。用鑷子夾取干凈的蓋玻片，將其一側(cè)先接觸標(biāo)本旁的碘液，再緩緩的蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。（二）人口腔粘膜上皮細(xì)胞的標(biāo)本制備取干凈載玻片，中央滴一滴1%碘液；用一根滅菌的牙簽輕輕刮取頜部任一側(cè)的上皮。然后將它涂在載玻片的碘液中，并輕輕攪動(dòng)幾下使細(xì)胞分開。用鑷子夾取干凈的蓋玻片，將其一側(cè)先接觸標(biāo)本旁的碘液，再緩緩的蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。（三）蛙血涂片標(biāo)本觀察（四）人血涂片標(biāo)本觀察（五）神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)本觀察（六）神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)本觀

14、察四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄（一）各類動(dòng)植物細(xì)胞形態(tài)觀察1. 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞標(biāo)本的觀察將制備好的臨時(shí)玻片置于低倍鏡下觀察，可見洋蔥鱗莖表皮是由許多長柱狀、排列整齊且緊密的細(xì)胞組成的（圖1）。選擇其中一個(gè)較典型的細(xì)胞移至視野中央，再轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察一下結(jié)構(gòu)（圖2）：（1）細(xì)胞壁：為細(xì)胞最外層的一層由纖維素組成的較厚結(jié)構(gòu)，它是植物細(xì)胞的重要特征之一。細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)并與其緊密相貼，光鏡下不易分辨。（2）細(xì)胞核：位于細(xì)胞中央或者靠近細(xì)胞邊緣，呈圓形或者卵圓形，染成深黃色。轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，在細(xì)胞核內(nèi)可以看見1-2個(gè)遮光較強(qiáng)的核仁。（3）細(xì)胞質(zhì)：細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的區(qū)域是細(xì)胞質(zhì)，染成淺黃色。其中可以見到一至

15、數(shù)個(gè)液泡，液泡內(nèi)充滿清澈明亮的液體。 圖1. 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞（100） 圖2. 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞（400）2. 人口腔粘膜上皮細(xì)胞標(biāo)本的觀察將制備好的口腔粘膜上皮細(xì)胞玻片標(biāo)本置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察，可見呈不規(guī)則形或扁平橢圓形或多邊形的細(xì)胞，單個(gè)或者多個(gè)連在一起。這就是口腔粘膜上皮細(xì)胞。選擇輪廓清晰而無重疊的細(xì)胞，移至視野中央，轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察。高倍鏡下，可清晰地看到細(xì)胞外形扁平而不太規(guī)則，中央有一卵圓形的被染成深黃色的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)染成淺黃色，均勻地分布于細(xì)胞核與細(xì)胞膜之間（圖3） 圖3. 口腔粘膜上皮細(xì)胞（400）3. 人血涂片標(biāo)本的觀察將血涂片標(biāo)本放于顯微鏡下，先用低倍鏡瀏覽整張

16、血涂片，選擇細(xì)胞均勻分布、較少重疊、有核細(xì)胞較多的區(qū)域。然后轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察紅細(xì)胞和白細(xì)胞。人血涂片上紅細(xì)胞數(shù)目最多、體積小、呈雙凹盤狀，無細(xì)胞核（圖4）。細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色；白細(xì)胞比例較少，尋找較困難，但細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核明顯，形態(tài)多樣，呈紫藍(lán)色。 圖4. 人血細(xì)胞（400）4. 蛙血涂片標(biāo)本觀察顯微鏡觀察可見蛙紅細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞質(zhì)淺紅色，細(xì)胞核呈橢圓形；白細(xì)胞數(shù)目較少，為圓形（圖5）。圖5. 蟾蜍紅細(xì)胞（400）（二）細(xì)胞大小測量 選一洋蔥表皮細(xì)胞，測細(xì)胞大小（長X寬）及核的大小（直徑） 選一蛙紅細(xì)胞，測細(xì)胞大小（長X寬）及核的大小（直徑）實(shí)驗(yàn)三、 死活細(xì)胞鑒別及細(xì)胞計(jì)數(shù)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

17、）練習(xí)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； （2）掌握臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行的死活細(xì)胞鑒別。2.實(shí)驗(yàn)原理（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)原理 細(xì)胞密度（個(gè)/ml）=n/41000稀釋倍數(shù) n=四大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù) （二）臺(tái)盼藍(lán)染色原理 死活細(xì)胞鑒別有許多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是：許多酸性染料不容易穿過活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，使其著色，以此來鑒別死活細(xì)胞。比較常用的臺(tái)酚藍(lán)染色法，原理：細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，由于膜的完整性喪失，通透性增加，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與細(xì)胞的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。3.實(shí)驗(yàn)用品試劑：0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液 （4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取 4

18、g 臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至 100ml，用濾紙過濾，4 度保存。使用時(shí)。用 PBS 稀釋至 0.4%）耗材：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋片、滴管或移液器、槍頭。儀器：顯微鏡試劑材料：動(dòng)物細(xì)胞4.實(shí)驗(yàn)方法1. 用 PBS配制 0.1% 臺(tái)盼藍(lán)溶液；2. 用 0.5% 胰蛋白酶： 0.2%EDTA=1 ： 1 混合液來消化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞；3. 再加入適量 PBS 制成細(xì)胞懸液；4. 將待染色細(xì)胞稀釋至所需濃度（方法及濃度范圍與細(xì)胞計(jì)數(shù)相同）；5. 每 0.1ml 細(xì)胞懸液約加新鮮配制的染液一小滴（細(xì)胞懸液與 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以 9:1 混合混勻。），室溫下染 35min；6. 染色過的細(xì)胞材料

19、，取一滴細(xì)胞懸液置玻片上，加蓋玻片后放高倍鏡下觀察；7. 死亡的細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大，無光澤。活細(xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤；8. 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋片備好； 9. 加入20ul懸液滴至計(jì)數(shù)板和蓋片空隙中； 10.計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果：死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。根據(jù)下式求細(xì)胞活力：細(xì)胞存活率5. 觀察結(jié)果鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。 根據(jù)下式求細(xì)胞活力： 活細(xì)胞率（%）= 活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）100 6. 注意事項(xiàng)： 1. 細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻； 2. 吹打混勻細(xì)胞時(shí)不要產(chǎn)生氣泡； 3. 計(jì)數(shù)中，不要漏記，不要重復(fù)，每個(gè)細(xì)胞懸

20、液至少滴樣兩次求平均值；4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)板不可放干，需用完即沖。5. 臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)，時(shí)間不宜過長。否則，部分活細(xì)胞也會(huì)著色，會(huì)干擾計(jì)數(shù)。7.思考題細(xì)胞活力檢測有何用途？實(shí)驗(yàn)四、細(xì)胞化學(xué)1 Feulgen染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^根尖壓片法，掌握Feulgen反應(yīng)顯示DNA的基本原理和主要操作環(huán)節(jié)二、實(shí)驗(yàn)原理：Feulgen反應(yīng)是1924年由Feulgen和Rossenbeck開創(chuàng)的。這一反應(yīng)的原理是：DNA在一定的溫度（60）下，被酸水解，打開嘌呤堿與脫氧核糖連接的鍵。在脫氧核糖的一端形成游離的醛基，醛基與Schiff試劑（脫色堿性品紅）結(jié)合，形成紫紅色化合物。所以，凡有DNA的部位，會(huì)呈現(xiàn)紫紅色

21、陽性反應(yīng)，可以作為定性研究DNA的一種簡便方法。三、實(shí)驗(yàn)用品：（一）、藥品：1、Schiff試劑：稱1g堿性品紅，溶于200ml已煮沸的蒸餾水中（要漫漫加入，不可一下全部倒入），繼續(xù)煮沸5分鐘（攪動(dòng)），然后使其冷卻至50，過濾于棕色磨口瓶中，加入20ml 1N HCl（取比重為1.19的HCl32.5ml，加蒸餾水至1000ml即成），繼續(xù)冷卻至25時(shí)加入1g偏亞硫酸鉀（KHSO3）或偏亞硫酸鈉（NaHSO3），將瓶塞蓋嚴(yán)，置于暗處24小時(shí)，溶液應(yīng)為無色，可保持在1-4冰箱中備用。如果紅色不退可加入2g活性炭粉末，攪動(dòng)數(shù)分鐘后靜置數(shù)小時(shí)，再過濾即可脫去紅色。2、1N HCl：取82.5ml比重

22、為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成（應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中）。3、45%醋酸4、亞硫酸水溶液：在200ml自來水中，加入10ml 10%的偏亞硫酸鈉（或偏亞硫酸鉀）溶液，或加入10ml 30%的偏重亞硫酸鈉溶液，再加入1N HCl 10ml即成，蓋緊瓶塞。此液要現(xiàn)配現(xiàn)用。5、Carnoy固定液：95%酒精3份，冰醋酸1份混合即可。6、50%酒精、30%酒精。7、5%三氯醋酸（二）、用具：顯微鏡、恒溫水浴鍋、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、酒精燈、青霉素小瓶、吸水紙等四、實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥根尖五、方法步驟：1、取0.5-1cm的根尖，在carnoy固定液中固定2-24小時(shí)。固定時(shí)以冰箱中進(jìn)行為宜。2

23、、取出固定材料，用50%酒精、30%酒精、蒸餾水各沖洗5分鐘，以除掉材料上的醋酸。準(zhǔn)備兩張切片，其中一張作對照。3、水解：用1N的冷HCl過洗材料一次，然后放入溫度穩(wěn)定在60的1N HCl中，水解10-14分鐘，取出材料后再用1N冷HCl過一次。4、染色：將水解后的材料放入Schiff試劑中染色1小時(shí)左右，此時(shí)根尖部分會(huì)出現(xiàn)紫紅色。5、用亞硫酸水漂洗三次，每次5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)的紫紅色退掉，再流水沖洗515分鐘，洗后的材料放入蒸餾水中。8、用45%的醋酸壓片。9、鏡檢。與對照裝片比較。10、對照切片的制做：進(jìn)行Feulgen反應(yīng)時(shí)， 一般要做一對照切片以便驗(yàn)證反應(yīng)結(jié)果。對照切片可用下面兩種方法制

24、作：1不經(jīng)水解直接放入Schiff試劑內(nèi)染色。2 材料固定后用5%三氯醋酸于90處理15min，用蒸餾水沖洗，以后步驟同實(shí)驗(yàn)組。六、注意事項(xiàng)：1、Feulgen反應(yīng)的染色深淺與材料、水解時(shí)的溫度和時(shí)間都有關(guān)系。水解時(shí)間的長短要根據(jù)固定液和材料來進(jìn)行選擇，時(shí)間太短則游離的醛基量少而染色不深，時(shí)間太長會(huì)因醛基進(jìn)一步變成其它物質(zhì)，染色也不深。水解時(shí)的溫度要嚴(yán)格控制。2、未經(jīng)水解的對照切片在Schiff試劑中最多不要超過1 h （0.5 h即可），時(shí)間過長，試劑本身的酸性也會(huì)使DNA水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。3、Schiff試劑的作用 ：Feulgen反應(yīng)成功與否的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素，就是Schiff

25、試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實(shí)際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。七、作業(yè)：1、繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果， 并驗(yàn)交Feulgen反應(yīng)的壓片1張。2、總結(jié)Feulgen反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素。3、Feulgen反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理是什么？4、在稀鹽酸水解后，為什么要用亞硫酸水洗片？實(shí)驗(yàn)五、 細(xì)胞骨架制備與觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈩?dòng)植物細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。掌握考馬斯亮藍(lán)R250對動(dòng)植物細(xì)胞骨架染色的方法。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維

26、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。他們除了對細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鸬街匾饔猛猓€參與許多重要的生命活動(dòng)。如：在細(xì)胞分裂中細(xì)胞骨架牽引染色體分離，在細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸中，各類小泡和細(xì)胞器可沿細(xì)胞骨架定向運(yùn)轉(zhuǎn)；在肌肉細(xì)胞中，細(xì)胞骨架和它的結(jié)合蛋白組成動(dòng)力系統(tǒng)；在白細(xì)胞（白血球）的遷移、精子的游動(dòng)、神經(jīng)細(xì)胞的軸突和樹突等方面都與細(xì)胞骨架有關(guān)。另外，在植物細(xì)胞中細(xì)胞骨架指導(dǎo)細(xì)胞壁的合成。目前研究細(xì)胞骨架的主要方法是應(yīng)用高壓電鏡或免疫熒光顯微技術(shù)等。細(xì)胞骨架在通常固定情況下不穩(wěn)定，如低溫、高壓、酸處理等。當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄危鏜-緩沖液洗滌細(xì)胞

27、，可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛在室溫下能較好的保存細(xì)胞骨架的成分，另外，Triton X-100處理能抽取掉一部分雜蛋白，可使骨架成分顯現(xiàn)的更加清晰。本實(shí)驗(yàn)用考馬斯亮藍(lán)R250顯示各種骨架蛋白，因?yàn)楣羌芾w維成束分布，結(jié)構(gòu)驚考馬斯亮藍(lán)R250染色以后，有夸大作用。由于微管的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，部分纖維太細(xì)，光鏡下無法分辨，因此，我們看到的主要是微絲組成的應(yīng)力纖維。實(shí)驗(yàn)材料器材：洋蔥鱗莖若干、人口腔上皮細(xì)胞、光學(xué)顯微鏡、電子天平、0.02移液槍、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、消毒棉簽、水浴鍋試劑：PB (PH7.3) :0.02mol/L Na2HPo4 77ml0.0

28、2mol/L Na2HPo4 23ml2. 0.01mol/L PBS (PH6.5)0.2mol/L PB 50ml0.15mol/L Nacl 50ml 雙蒸餾水加至1000ml3. M-緩沖液（PH7.2）各成分終濃度為：咪唑 50mol/LKcl 50mol/LMgcl2 0.5mol/LEGTA 1mol/LEGTA-Na2 0.1mol/LDTT 1mol/L4. 1%的Triton X-100：Triton X-100 1mlM-緩沖液 99ml5. 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸餾水 46.5ml6. 3%戊二醛10

29、0ml25%戊二醛 12mlPBS 88ml實(shí)驗(yàn)步驟取材：取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮2-3mm置于滴有PH6.8磷酸緩沖液（PBS）的載玻片上，使其充分潤濕。去垢：吸去PBS緩沖液，用吸水紙吸凈。取2-3滴1%Triton X-100處理20-30min，為保證去垢效果，可水浴加熱至37度。沖洗：吸去1%Triton X-100，用M-緩沖液洗三次，每次3分鐘。固定：吸去M-緩沖液，用3%戊二醛固定30min-60min。沖洗：吸去戊二醛，用PH6.8磷酸緩沖液沖洗3次，每次10min。染色：吸去PBS，用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20-30min（實(shí)際用時(shí)可根據(jù)當(dāng)時(shí)的室溫及濕度做出相應(yīng)改變）。制片

30、：用蒸餾水沖洗1-2次，展平置于載玻片上，加蓋玻片。人口腔上皮細(xì)胞骨架考馬斯亮藍(lán)R250染色涂片 用干凈牙簽刮取人口腔上皮細(xì)胞，置于裝有生理鹽水試管中，洗滌離心1-2次，剩約0.5-1ml上清液，吸管吹打均勻、涂片、晾干。漂洗 M-緩沖液漂洗3次。處理 1%Triton X-100 37度處理15-20min，M緩沖液漂洗3次。固定 3%戊二醛固定15-20min，PBS洗3次，濾紙吸干。染色 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色5-10min。封片 水洗制成臨時(shí)片或晾干用中性樹膠封片成永久片。觀察：將制備好的裝片置于光學(xué)顯微鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細(xì)胞輪廓（圖14-1），細(xì)胞內(nèi)

31、可見到被染成藍(lán)色的粗細(xì)不等的分枝狀結(jié)構(gòu)，這便是細(xì)胞骨架。轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋可見到細(xì)胞骨架的立體結(jié)構(gòu)。光鏡下動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)不甚清楚，只能大概見到細(xì)胞輪廓，中間纖維呈深藍(lán)色（圖14-2）實(shí)驗(yàn)記錄洋蔥和表皮細(xì)胞與人口腔上皮細(xì)胞骨架圖圖14-1 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（400 x）圖14-2 人口腔上皮細(xì)胞骨架（400 x）在光學(xué)顯微鏡下，可見在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表面分布許多排列不規(guī)則的纖維束，走向清晰，呈淺藍(lán)色或深藍(lán)色。但試驗(yàn)中，也可見到部分細(xì)胞骨架纖維并非呈纖維狀，而是呈串珠狀或顆粒狀，這是由于在固定和PBS洗滌過程中，并沒有將溶解下來的膜蛋白等成分去除造成的。但由于考馬斯亮藍(lán)R250染色是一種非特異性反應(yīng)，因此此實(shí)驗(yàn)尚不能區(qū)別微管、微絲和中間纖維。作業(yè)繪制洋蔥表皮細(xì)胞與人口腔上皮細(xì)胞骨架圖。光鏡下觀察到的細(xì)胞骨架有何形態(tài)特征？注意事項(xiàng)：Triton X-100抽提處理的時(shí)間很關(guān)鍵，如果處理時(shí)間太短，沒有抽提掉細(xì)胞器膜上的蛋白，會(huì)造成很深的背景顏色，干擾細(xì)胞骨架的觀察；如果處理時(shí)間太長，會(huì)破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂，應(yīng)控制在30min左右。每一次加液或染色后，應(yīng)洗凈漂洗