1、電鏡細胞化學技術第1頁電鏡細胞化學技術 從光鏡組織化學基礎上發展起來，任務是研究細胞內各種成份在超微結構水平上分布情況以及這些化學成份在細胞活動過程中動態改變。酶細胞化學，免疫細胞化學，放射自顯影以及各種細胞組成生化分析等都屬于電鏡細胞化學范圍。第2頁酶細胞化學發展情況酶細胞化學是從50年代末開始發展。酶在生命活動中占有極其主要地位，離開了酶，一切生命活動所需物質代謝將成為不可能。當前已知有各種酶。 LM組織化學方法-顯示出酶100各種 EM細胞化學-顯示出酶80各種 南醫大電鏡室-EM-顯示出酶30各種第3頁酶細胞化學意義酶細胞化學定位對研究細胞生理功效和病理過程有主要意義；很多酶能夠作為細

2、胞膜和各種細胞器標志酶，而且有些細胞還有其特有標志酶，這就為研究細胞器結構與功效，細胞器相互關系以及細胞判別提供了一個新武器。第4頁細胞器標志酶內質網核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高爾基體TPP（硫胺素焦磷酸酶），NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）GERL和溶酶體ACP酶（酸性磷酸酶）線粒體細胞色素氧化酶，琥珀酸脫氫酶微粒體過氧化氫酶（H2O2酶）細胞膜（膜性結構）核糖核苷酸酶（如ATP酶），堿性磷酸酶細胞器和它們標志酶第5頁酶細胞化學基本原理 在生物化學中，按照催化反應性質將酶分成水解酶、氧化還原酶、轉換酶、裂合酶、合成酶和異構酶六大類。但在細胞化學上能夠檢出酶多數屬水解酶和氧化還原酶兩

3、大類。第6頁一、水解酶底物酶條件初級反應產物捕捉劑最終反應產物捕捉劑通常是重金屬（如鉛、鋇、銅等）普通來說，這些最終產物在細胞內位置代表酶促反應位置，也就是酶定位。以酸性磷酸酶為例：甘油磷酸鈉酸性 磷酸酶PH 5.0ROHH3PO4Pb2+Pb3(PO4)2第7頁二、氧化還原酶包含氧化酶和脫氫酶，在氧化還原酶細胞化學方法中，包含著兩個既分開又緊密聯絡底物，在細胞化學中一個底物被還原，另一個被氧化。兩個底物中，有一個是酶理想底物，另一個是專門選擇在氧化還原時會起主要化學改變某種物質，后一個底物有很多方面可看作是捕捉劑等效物，稱捕捉底物。第8頁氧 化 酶H2O2H2O氧化酶DABDAB氧化聚合物O

4、sO4 （鋨酸）鋨黑（高電子密度）第9頁脫 氫 酶琥珀酸鹽延胡索酸鹽琥珀酸脫氫酶高鐵氰化物Fe(CN)63 亞鐵氰化物Fe(CN)64Cu2+亞鐵氰化銅以琥珀酸脫氫酶為例注：Cu2+存在在檸檬酸鈉或酒石酸鉀鈉條件下第10頁慣用酶細胞化學試驗步驟 一、取材與固定 試驗動物組織最好用灌注固定，人體活檢標本以浸泡固定為主。用2戊二醛固定液經血管灌注固定動物組織5分鐘左右，然后取下所需組織，切成寬1mm，長510mm長方形組織塊，在一樣固定液中繼續固定，固定時間隨組織大小、種類而定。各種酶對固定液敏感度和耐受性也不一樣，必須依據詳細情況選擇固定液溫度、濃度、時間和PH。第11頁慣用固定劑對超微結構和酶

5、活性保留情況保留情況保留情況超微結構情況酶活性超微結構情況酶活性乙醛差好羥基乙二醛好好丙烯醛好優異差乙-甲基丙烯醛好好巴豆醛尚可好丙酮醛差差甲醛尚可優異琥珀醛尚可好戊二醛優異好丙醛尚可好乙二醛尚可，好好第12頁 二、漂洗組織 用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液（PH7.4）在4下漂洗組織，洗去戊二醛固定液，漂洗時間最少2小時以上，能夠過夜。二甲胂酸鈉緩沖液是最理想漂洗液，因為它不干擾任何酶細胞化學反應。第13頁 三、切組織片 將長條組織塊埋在7瓊脂中，用組織切片機切成25m75m組織片，將切下組織片浸泡在40.1M二甲胂酸鈉緩沖液中；或將組織塊用冰凍切片機切成所需厚度組織片，但需預防冰晶產生。也可用振

6、蕩切片機切成45 m左右組織片。當被檢驗材料被充分固定時，用冰凍切片機制作切片能很好保持微細結構。當材料不能充分固定或不能被固定時，因為冷凍溶解能引發組織結構損傷，所以用組織切片機或振蕩切片機。對一些有方向性組織，在切薄片前必須注意樣品定向，事先確定所需要細胞位置。第14頁 四、置換緩沖液 將組織片放入配制孵育液用緩沖液中，換液23次，每次510分鐘，使組織內部建立細胞化學反應所需PH條件，緩沖液溫度須保持4左右。有些細胞化學反應中有預孵育步驟，即將組織片浸在沒有底物孵育液里20分鐘左右，在酶與底物相遇之前使組織內部建立起所需PH以及足夠捕捉劑濃度。第15頁 五、孵育 將組織片放在新鮮配制孵育

7、液中，在室溫或37水浴箱中孵育30分鐘至2小時，孵育過程中不停振蕩孵育液，使其輕易擴散到組織內。孵育液要求現配現用，成份普通不能有大變動，底物和捕捉劑濃度、緩沖液緩沖能力等必須保持在很窄程度內；在一些孵育液配方中，一些成份已靠近溶解度極限，所以在混合各種成份時必須尤其小心。各種酶有其對應孵育時間、溫度、PH，必須嚴格恪守。第16頁 六、漂洗組織 首先用配制孵育液緩沖液清洗組織，以去除孵育液中過剩試劑，普通換洗23次，每次5分鐘，然后用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，所用緩沖液保持在4左右。第17頁 七、后固定 用1鋨酸固定液對組織作后固定，因為組織較薄，在4下固定時間普通不超出1小時。為了更加好

8、顯示細胞各種膜結構，能夠用亞鐵氰化鉀還原鋨酸作后固定。 第18頁 八、脫水包埋 按超薄切片技術中常規方法進行脫水和環氧樹脂包埋，但脫水時間縮短二分之一，且不用醋酸雙氧鈾作塊染。對超薄切片染色要慎重，因為電子染色可能會含糊細胞化學反應細節，染色液也可能會含糊細胞化學反應細節，染色液也可能與細胞化學反應產物起作用。所以，首先必須觀察未經染色切片，只有確證染色對細胞化學反應產物沒干擾情況下才能做常規超薄切片染色。第19頁應 用第20頁第21頁第22頁第23頁第24頁免疫電子顯微技術第25頁電鏡免疫細胞化學技術 電鏡免疫細胞化學技術是在細胞超微結構水平上研究抗原抗體反應部位并研究其動態改變。 1959

9、年，Singer首先提出用電子密度較高鐵蛋白(Ferritin)標識抗體方法，使在細胞超顯微水平上研究抗原抗體反應成為可能。在此基礎上，相繼發展了雜交抗體技術、鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術、免疫酶技術及膠體金標識技術等。第26頁對標識物要求標識物必須是電子密度高物質，在電鏡下可識別標識物與抗體或與抗原反應必須不改變抗體或抗原活性標識物在電子轟擊下不改變形狀慣用標識物有鐵蛋白、辣根過氧化物酶（HRP）、膠體金等第27頁基本操作組織固定與取材：固定要求保留良好細胞超微結構和保持組織抗原性，取材要求快速、精細。固定液：過碘酸賴氨酸多聚甲醛液（PLP液），多聚甲醛戊二醛混合液，4%多聚甲醛液免疫染色：包埋

10、前染色、包埋后染色、超薄冰凍切片染色包埋：樹脂包埋、低溫包埋第28頁包埋前染色即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修整成小塊，按常規電鏡方法處理，經鋨酸固定、脫水、包埋。包埋前染色組織以中層較為理想；表層因受機械修整，結構往往保留不好；深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。在做超薄切片前應先做半薄切片，找出免疫反應陽性部位。第29頁 優點： 1. 標本染色前不經過鋨酸固定、脫水、包埋等過程，抗原未被破壞，易于取得良好免疫反應。 2. 可在免疫反應陽性部位定位做超薄切片，提升電鏡下檢出率。 3. 適于含抗原量較少組織。 缺點： 因為經過一系列免疫染色步驟，常出現一定超微結構損傷。

11、第30頁包埋后染色 組織標本經固定、脫水及樹脂包埋，制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。 注意點： 1、OsO4可使抗原活性顯著降低。 2、銅網易與化學物質產生反應，故需選鎳網或金網。 3、在免疫組化處理全過程中，應注意保持網面濕潤，以免影響抗原活性。第31頁 優點： 超微結構保留很好，方法簡便，陽性結果有高度可重復性，同一張切片上可進行多重免疫染色。 缺點： 抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；包埋在環氧樹脂中組織不易進行免疫反應等。第32頁超薄冰凍切片染色將組織置于2.3mol/l蔗糖液中，投入液氮中速凍，在冰凍超薄切片機上切片。優點：樣品抗原性保留很好，兼有包埋前和包埋后染

12、色優點。缺點：需配置冰凍超薄切片機，且技術難度較大。第33頁 不論哪一個免疫電鏡技術都面臨微細結構保留和組織中抗原活性保留這一對矛盾。如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構保留，但抗原活性有影響；而H2O2能增加樹脂穿透性，但對微細結構有損傷，能使反應部位產生孔洞。在生物樣品處理過程中，應同時注意到這兩方面。其次，每次免疫染色中清洗工作應注意徹底，不然非特異性產物和其它污染物會影響特異性反應物顯示和觀察。第34頁免疫電鏡膠體金標識法第35頁 金標法是Faulk和Taylor在1971年提出，并首先用于免疫電鏡。 金標法是利用膠體金在堿性環境中帶有負電荷性質，使其與抗體相吸附，從而將抗體標識。 L

13、M: 金標識抗體與抗原反應時，呈鮮艷櫻紅色 EM: 金顆粒含有很高電子密度，清楚可見第36頁優 點標識抗體不復雜，對微細結構損傷小。金顆粒電子密度高，在TEM下清楚可見。利用不一樣直徑金顆粒標識不一樣抗體，是研究突出小泡內神經遞質共存有力工具。由抗原抗體反應部位結合金顆粒數量多少能夠進行粗略免疫細胞化學定量分析。能夠對培養細胞內抗原進行標識定位。金含有強烈激發電子能力-能夠用于TEM和SEM觀察。金標液無毒性，對人體無害。膠體金被科技工作者認為是當前最理想標識物之一。第37頁操作步驟 應用于電鏡水平免疫金染色法，可分為包埋前染色和包埋后染色，因為包埋前染色對細胞膜穿透性差，普通只用于細胞表面抗

14、原標識；細胞內部抗原標識普遍采取包埋后染色。第38頁包埋后染色 1.超薄切片厚5070nm左右，載于200300網孔鎳網上。 2.置1%H2O2內10min至1h，促進樹脂穿透性，有利于抗體進入。滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網載片面輕浮于液滴上。 3.雙蒸水洗3次，每次10min，第一、二次洗法如步驟2，浮于液滴上，第三次以盛有雙蒸水加樣器沿鎳網面沖洗，水流應有適當壓力，但不易過強，用濾紙在網緣將水吸干。 4.浮于正常羊血清（1:501:100）滴上，室溫30 60 min，以飽和固定劑中游離醛基占據非特異性結合部位，以阻斷非特異性吸附。 5.PBS漂洗3min，3次。第39頁 6.濾紙

15、吸干，孵育于第一抗體血清上，先室溫預孵1h，再置于4冰箱2436h。（從冰箱取出后需室溫放置1h） 7.PBS漂洗3min，3次。 8.PBS（內含1%牛血清白蛋白，PH8.2）中5min，此步為膠體金結合做準備。 9.膠體金標識抗體液1:301:100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育1h。 10.雙蒸水洗3min，3次。 如作雙重染色，則應將鎳網翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟210。 11.枸櫞酸鉛染色5min，然后雙蒸水洗。 12.飽和醋酸鈾染色5min，雙蒸水洗凈。 13.電鏡觀察。第40頁應用第41頁第42頁第43頁組織內雌激素受體CG-HRP-E2標識技術第44頁 雌激素受體(

16、ER)除存在于性器官外，幾乎在全身器官或多或少存在。對對應組織進行ER定性、定量檢驗，對研究疾病發生、發展、診療和治療都有主要意義。 有生化法、組化法、組化免疫法及新近發展起來單克隆抗體，已經有學者對這些方法進行評價。 最近有作者用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯雌二醇(E2)檢測乳腺癌水平，并廣泛地得到應用。上述方法均缺乏準確定性和定量研究 南醫大電鏡室首次將膠體金(CG)與HRP偶聯E2結合作為配體形成了CG-HRP-E2，使ER在電鏡下顯示，可在細胞超微結構水平進行定位和定量分析。第45頁結 果HRP-E2在LM下顯示CG-HRP-E2在EM下顯示對應靶細胞核內和胞漿內有不一樣程度膠體金顆粒

17、分布附表：細胞漿與細胞核內ER平均密度(顆粒數/0.12nm2)種類例數胞漿內胞核內增生期間腺細胞102.151.802.962.233.262.54增生期間質細胞101.501.22腺癌細胞61.341.813.221.28第46頁第47頁討 論CG穩定，快速吸附蛋白質而不改變生物活性E2對靶細胞內ER有高度親和力與專一性HRP和CG都是標識物創新之處于于把CG與HRP-E2（有售）相結合，形成CG-HRP-E2標識物，能很好標識靶細胞內胞漿和胞核受體HRP-E2與CG-HRP-E2結果完全吻合在超微結構水平上進行準確定性和定量方法可靠，試劑起源易，價格低廉本科研（國家自然科學基金資助免疫電

18、鏡細胞化學部分）結果證實靶細胞中，核內ER顯著多于漿內ER，為30年來關于核受體或漿受體爭論提供了一個有力科學檢測伎倆第48頁細胞形態立體計量學第49頁細胞形態立體計量學意義是對細胞及其結組成份形態進行定量分析一個方法，也就是用立體學方法來分析細胞形態結構（膜結構、顆粒結構、纖維結構）從二維圖像推導三維空間結構，要用到幾何概率論等一些數學方法，這一套方法稱為立體學（Stereology）。將立體學方法用在細胞形態分析上，就是形態計量學（Cell Morphometry）第50頁超薄切片取得圖像存在以下問題 1. 二維圖像與三維結構 細胞含有三位結構，而電鏡圖像顯示只是二維形態。怎樣從二維圖像導出三