1、感染性疾病的分子診斷第1頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三感染的慨念 感染是病原體和人體之間的相互作用過程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態共生狀態在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生第2頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。 病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。 第3頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三常規檢測方法： 免疫學方法 微生物學方法 受敏感性、特異性限制，不易早期

2、診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。第4頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR 雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）亞型耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序第5頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達產物代謝物免疫應答分子細胞免疫體液免疫TT致敏T細胞淋巴因子B漿細胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現臨近恢復期出現與原蟲和蠕蟲感染有關第6頁，共88頁，2022年，5

3、月20日，23點57分，星期三二、感染性疾病分子診斷的常用方法 根據目的基因是否被放大， 可分為雜交法和擴增法。信號放大技術檢測方法 靶分子數目不變，而檢測的探針信號放大 采用多酶、多探針或二者結合等方法來增加探針標志物的濃度使檢測信號得到放大。靶分子擴增技術檢測方法 靶分子（RNA、DNA或探針）的擴增PCR、替代擴增、LCR等第7頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA擴增子 53533535引物A 3

4、55RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 圖8-3 NASBA原理示意圖 引物A 5端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3端堿基與靶RNA 3端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA 3端序列互補第8頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)第9頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種 酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。 第10頁，共88頁，2022年，5月

5、20日，23點57分，星期三引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA擴增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 圖8-3 NASBA原理示意圖 引物A 5端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3端堿基與靶RNA 3端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA 3端序列互補第11頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)第

6、12頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種 酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。 第13頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適的標本種類、標本量、抗凝劑等及對標本進行合適的傳送、保存和預處理。第14頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1. 陰性結果 假陰性可能性 方法的靈敏度太低 方法失敗 目標分子2. 陽性結果 假陽性可能性 方法的特異性 受

7、到污染第15頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三3. 定性檢測結果 有時不能提供病原體活力相關信息 臨床治療病情緩解后一定時間內，在患者樣本中仍可以檢測出相應的病原體。 有些病原體潛伏在進體內，沒有臨床癥狀。4. 疾病狀況的判斷 檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。 該病原體可能是一種正常菌群 第16頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價用于感染性疾病治療的監控和預測、病情發展過程的危險性評價及疾病預后等。耐藥性的檢測細菌的分型流行病調查第17頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分

8、，星期三第一節 病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結構：大 ?。?0-300nm 核心區：核酸（DNA或RNA） 外周衣殼：蛋白質 包膜：脂質（鑲嵌有蛋白質）第18頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三 我國是HBV高流行區，50%70%的人受過感染，8%10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBV又與原發性肝癌密切相關。 外殼（HBsAg): 外殼蛋白成分為表面抗原 核心（HBcAg)： DNA DNA 聚合酶 HBcAg一、 乙型肝炎病毒第19頁，

9、共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三Dane顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBV DNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為27納米， 內含DNA雙鏈和DNA多聚酶第20頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（一）病毒基因組結構3.2kb雙鏈DNA病毒 不完全雙連環狀DNA 長鏈L為負鏈：有4個開放閱讀框S、C、P、X S區編碼外膜蛋白（HBsAg） C區編碼HBeAg 、HBcAg p區編碼DNA聚合酶 X區位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表 達有關。 短鏈S為正鏈：長短不一第

10、21頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三pre-s1 pre-s2S P C pre-c XHBV DNA 3.2 kbpre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAgHBV基因組結構第22頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三HBV 基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發現A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H

11、型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型 第23頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三HBV在肝細胞內的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜負鏈DNA包裹后的前基因 mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉錄酶DNA聚合酶肝 細 胞第24頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。 1.PCR 采用普

12、通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準確的病原學診斷證據。引物是根據S、C、P、X基因中高度保守序列設計，決定擴增的特異性和敏感度。第25頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三擴增位置 引物序列 擴增片斷（bp) P、X基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C基因 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCT

13、ATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 第26頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三 有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析： RLFP 斑點雜交 Southern雜交 第27頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三2. 支鏈DNA信號放大技術(bDNA）原理: 捕獲探針 檢測 靶探針1 體系 靶探針2 bDNA分子:DNA主鏈上結 合多個側鏈 第28頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三捕獲探針固化在微孔板上 靶探針1分別與捕獲探針及待測核酸雜交 靶探針2分別與待測核酸

14、及bDNA雜交 形成復合物：固相支持物捕獲探針靶探針1CEs待測核酸靶探針2LEsbDNA復合物第29頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)第30頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發光，使核酸信號放大，且發光強度與DNA量成正比。 優點：放大倍數確定 陽性檢出率高 穩定性和可重復性好 操作簡便，省時，易于普及第31頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三3.基因芯片技術 標本經PCR擴增后與芯片上的特異探針進行

15、雜交，可以檢測： 是否有病毒感染 感染病毒的種類及亞型 病毒的耐藥情況 特點：可同時進行大量標本的檢測第32頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三近年來陸續上市的核苷(酸)類似物對HBV的治療壓力集中在P區。干擾素治療對HBV的壓力主要集中在前C/C區及前S區。HBV耐藥突變lamivudineadefovirentecavirtelbivudine第33頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三YMDD (酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) HBV對拉米夫定耐藥是HBV DNA聚合酶突變所致。耐藥基因位點(YMDD)位于聚合酶的C區(rtM2041或rt

16、M204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD變異.拉米夫定作用靶位為HBV DNA聚合酶C區。有研究表明，拉米夫定與HBV逆轉錄酶的親和力與位于第552位氨基酸側鏈長度有關，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側鏈氨基酸長度縮短，使逆轉錄酶dNTP結合區增大，不適于拉米夫定結合，從而誘發耐藥性。第34頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三HBV耐藥檢測（ YMDD突變檢測方法）第35頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三YMDD突變檢測方法1. 基因測序法2. 熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的

17、TM值來區分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交 YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74第36頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（三）臨床意義1.早期診斷 免疫學檢測敏感性： 0.1g/ml 核酸雜交檢測敏感性：0.1pg/ml PCR檢測： 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通過DNA檢測證實病毒的存在。第37頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三2.監測治療效果: HBVDNA107拷貝/ml提示病毒復制活躍； HBVDNA104拷貝/ml治療有一定療效； HBVDNA103拷貝/ml、HBeAg陰轉、轉氨酶正常

18、為乙型肝炎臨床治愈指標；3.判斷病情，指導制定合理的治療方案第38頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三4.病毒耐藥性的檢測 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產生耐藥性的重要原因，通過監測YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導抗病毒治療。第39頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起流行性感冒的病原體;分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個型別;根據病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin ，HA)和神經氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗

19、原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發生變異，致病力強，1918年發生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人， 即是由甲型流感病毒引起。 There are 16 different Hantigens(H1 to H16) and nine different N antigens (N1 to N9).第40頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第41頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（一）流感病毒基因組結構 單鏈RNA病毒，RNA為負鏈； 有8個RNA片段或7個RNA片段； 所有RNA片段5末端和3末端高度保守； 兩種不同亞型病毒感染

20、宿主時，會生成基因重配的新病毒； RNA基因在復制過程中 常會發生點突變。 第42頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（二）分子診斷方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結構基因（NS）的序列進行設計。為證實PCR擴增產物的特異性或提高檢測的靈敏度，可用限制性內切酶分析法、斑點雜交法、Southern印跡法進行擴增產物的分析。 第43頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三擴增位置 引物序列 擴增片段大小 NS基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 (bp) 5-CCCATTCTCATT

21、ACTGCTTC-3 NS基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 (bp) 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3 第44頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（三）臨床意義 流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。 PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。 第45頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三三. 人類免疫缺陷病毒（HIV)HIV，human immunodeficiency virusAIDS，acquired

22、immunodeficiency syndromeHIV為艾滋病的病原體。現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。 1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數為3.340萬，已死亡1.390萬，是全球十大主要死因之一。第46頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；其內為核衣殼。第47頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第48頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三2.基因組結構 逆轉錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈RNA； 每個RNA長約9.7Kb，有5帽，

23、3端有多聚尾； HIV是一種高度變異的病毒； 含有gag、env 和 pol三個基因以及6種調控基因 tat, vif, vpr, vpx, nef, rev。 第49頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三gag基因編碼病毒的核心蛋白； pol基因編碼病毒復制所需要的酶類（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）； env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學診斷的主要檢測抗原。 調控基因編碼輔助蛋白，調節病毒蛋白合成和復制。 第50頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測法（IFA）；感染2周后才

24、能逐漸產生病毒抗體； 抗原的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測P24抗原，靈敏度低第51頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三1.病毒載量檢測 感染者體內HIV的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。 目前常用三種技術： RT-PCR 最低檢測限50拷貝/ml bDNA 最低價測限50拷貝/ml NASBA 最低檢測限20拷貝/ml第52頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三PCR RNA逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞DNA為模板PCR擴增； HIV為高變異病毒，不同患者體內分離的病毒基因結構有差異，引物設計應根據各編碼區的

25、保守序列設計； 靈敏度高，特別是用于無癥狀HIV感染者。 第53頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三擴增位置 引物序列 擴增片斷（bp) gag基因 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 342 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 gap基因5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 115 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 pol基因5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 360 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 第54頁，共88頁，2022

26、年，5月20日，23點57分，星期三2.病毒表型和耐藥檢測HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法, 即查找與病毒耐藥有關的基因突變。檢測病毒逆轉錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結果與已知的沒有發生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發生了突變。檢測出的任何突變都有可能導致形成HIV耐藥性，但具體結果的解釋必須要有非常有經驗的專家和醫師來進行。 第55頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（三）臨床意義1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位； 2.PCR：可對無癥狀的感染者進行早期診

27、斷； 3.病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值。 第56頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第九章：細菌感染的分子生物學檢驗概述 正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細菌； 條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌； 病原菌：具有毒性和侵襲力的細菌，造成人體感染；第57頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三病原菌的診斷方法： 直接涂片法 生化試驗 血清學試驗 分離培養 動物實驗 分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；不能確診或進行分型、耐藥性的檢測，或費時等第58頁，共88頁，2022年，5月20

28、日，23點57分，星期三 全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結核，中國占70%，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。 結核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，細長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，對多種抗生素有抵抗力。一. 結核分枝桿菌第59頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三形 態 第60頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三(一)基因組結構 1.TB H37Rv株基因組是環狀雙鏈DNA， 共有4 411 529bp; 2.共有4033基因，功能已知的有1734個, 1694個可能為新基因; 3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列

29、，包括水解酶或者藥物修飾酶。 第61頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第62頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第63頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（二）分子診斷方法 普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR 擴增靶序列： 65KDa抗原基因（細菌細胞壁上蛋白） MPB蛋白基因（結核桿菌復合群特有） rRNA基因 （種屬鑒定） ISDNA6110插入序列第64頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三靶序列 引物序列 擴增片斷（bp） IS6110插入 5-CCTGCGAGCGTAGGCGT

30、CGG-3 317 5-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 463 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 DNA重復序列 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 245 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 第65頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三TB耐藥檢測利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因異煙肼耐藥-katG基因鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因 16SrRNA的rrs基因 喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或藥物修飾酶（-內酰胺酶、

31、氨基糖苷乙酰基轉移酶和藥物外排系統等）第66頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三細菌耐藥基因的檢測 細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。 機理：由于細菌基因組的變異，導致 1.細菌細胞外膜通透性改變； 2.產生滅活酶和鈍化酶，如-內酰胺酶； 3.藥物作用靶位改變； 4.代謝途徑改變；第67頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（三）臨床意義1.準確、快速、早期診斷TB 2.區分TB與其它分枝桿菌 3.疫情監控和抗癆治療療效的評價 第68頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三二、 淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌

32、，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，發病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現和流行對淋病的控制帶來很大困難。 傳播途徑：1.直接性接觸感染 2.間接接觸感染 第69頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第70頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（一）基因組結構 1.染色體分子量980M，可編碼約5000個基因，GC含量為50%； 2.無操縱子結構 3. 含有1至數個質粒（2.6MDa，24.5MDa），通過質粒介導耐藥性在不同菌株間的轉移； 第71頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第72頁，共88頁，2022年，5月

33、20日，23點57分，星期三（二）分子診斷1.PCR: 擴增的靶序列：編碼外膜蛋白的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上） 第73頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三靶序列 引物序列 擴增片斷（bp） CPPB基因 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 外膜蛋白5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 181第74頁，共88頁，2022年，5月20日，23

34、點57分，星期三2.LCR（ Ligase chain reaction ） 連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增. 第75頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三原理：在PCR反應體系中加入二對引物，加熱 (9495)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65)，引物與模板DNA結合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補，DNA連接酶即連接封閉缺口， PCR反應接著進行，擴增出大量的目標DNA.若有點突變，引物不能與模板精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連接酶不能封

35、閉缺口， PCR反應不能進行，無擴增產物生成，據此可判斷模板DNA中有無突變.第76頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三第77頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三（三）臨床意義 1.分子診斷技術具有靈敏性高、快速、特異性好的優點，可檢測極微量的淋球菌。 2.應用于以下幾方面： 對菌株進行分型和耐藥性分析。 抗生素治療效果的觀察。 進行流行病學分析。 對疑似病例的診斷和鑒別診斷。第78頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三衣原體的基因檢測 衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。 沙眼衣原體是一種在人體內長期生存并又廣泛傳播的病原體，常導致人泌尿生殖道疾病及眼病，有15種血清型。第79頁，共88頁，2022年，5月20日，23點57分，星期三一、基因組 沙眼衣原體（血清型D）基因組大小1042Kbp，GC含量為41.3%，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有894個蛋白編碼基因，其中604個(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(28%)