1、實驗進展書面報告 實驗進展書面報告 一實驗目標 1.幫助師兄純蛋白并進一步熟練純蛋白的實驗操作技能。 2.手提質粒，測質粒濃度 3.學習測p450酶蛋白的濃度 4.掌握基因定點突變的原理和基因定點突變完整的實驗操作流程。 二實驗進展 1.純蛋白的實驗操作過程： （1）4度，4000-8000rpm,15-30分鐘，收集菌體，沉淀可凍于-80度保存。 （2）配制lys buffer,wash buffer,desalting buffer,最后配制elution buffer 溶液，調節PH時要精確。 （3）加入適當的lys buffer,1000毫升菌液收集的菌體，加入30毫升即可，太少超聲時

2、容易起泡。 （4） 混合震蕩，沒有塊狀，成為均勻的溶液。（菌體要放在冰上） （5）往冰桶里面加冰，超聲細胞破碎儀進行破碎菌體，開2.0秒。關4.0秒。超聲破碎時間30分鐘。（在進行超聲細胞破碎時，一定要把小燒杯邊緣卡在線圈的地方） （6）用離心機離心掉菌體（離心1小時，10000rpm）.去除菌體碎片，取上清備用，(一定不要菌體碎片，上清液包括蛋白質，細胞內容物，lysbuffer緩沖液) (7)洗 Ni 柱，假設有乙醇，用清水進行洗第一遍，再用lys buffer 洗一遍，留點 lys buffer 液體，lys buffer 液體與藍色體積1:1比例，使Ni 柱重懸起來，加Ni柱，（500

3、毫升培養基加2毫升Ni柱，1升的培養基加3-4，5毫升NI柱。500毫升培養基加3毫升Ni柱。） （8）將加過Ni 柱的上清液放在4度，使其充分動態混合，轉速不可太快，保護Ni 柱，使Ni柱和上清液充分融合，進行孵育。 （9）將lysbuffer 加入柱子中，（選擇用10毫升的槍加入試劑），流完之后，將上一步的液體加入小的柱子中。 （10）上一步液體過濾完之后，加入wash buffer 洗兩遍，（目的是將雜蛋白洗下來） （11）在普通過濾管下面接試管，往普通過濾管中加入4毫升的elution buffer ,將目的蛋白洗脫下來。 (12) 提前預約離心機，超濾管中要有乙醇的味道，先用純水洗掉

4、乙醇味，并在超濾管中加入desalting buffer溶液，將desalting buffer 溶液離心下來，5000-5500rpm,60分鐘，4度。 （13）將洗脫下來的蛋白裝入超濾管中，用離心機進行濃縮，5500rpm,60分鐘，4度。離心之后將超濾管中外管的液體扔掉， （14）將濃縮以后的蛋白中加入4毫升的desalting buffer,離心濃縮5500rpm ,1小時，目的是去除目的蛋白中的咪唑。（要輕輕的進行，同時速度要快，保證溫度）要是使用脫鹽柱，首先對脫鹽柱進行清洗，一次加5毫升desalting buffer,每管加25毫升，將濃縮好的蛋白加入到脫鹽柱中，一次加2.5毫升

5、蛋白溶液。 （15）純到的蛋白分裝到EP 管中，在分裝之前一定要將酶混勻，以免影響酶濃度的測量，用液氮快速冷凍，-80度保存。（1.5ml的ep管當中加入300UL的酶，PCR管中加入100ul 的酶。） 清洗：柱子用elution buffer,洗兩遍，用二級水洗一遍，留點二級水重懸起來加到Ni柱里面。脫鹽柱的清洗，每次加5毫升的desalting buffer,一共加夠25毫升。最后的5毫升留著保持脫鹽柱里面的填料濕潤）。 2.大腸桿菌中質粒的提取制備和DNA濃度的測定 （1） 接菌:在超凈臺操作，接1.8毫升菌液到2毫升的EP管中。 （2） 將過夜培養的菌液14000rpm,離心2min

6、,收集菌體，棄掉上清。 （3） 加入200ul buffer p1溶液，置于振蕩器上1300rpm,震蕩10min. （4） 加入200ul buffer p2溶液，震蕩3次，每次3秒。 （5） 加入200ul buffer p3溶液，震蕩3次，每次3秒。 （6） 上下顛倒3次，14000rpm,離心20min. （7） 在新的無菌1.5ml EP管中加入500ul 異丙醇。 （8） 將步驟 6 中所得到的上清液轉移到異丙醇的1.5ml EP管中。 （9） 劇烈震蕩，14000rpm,離心20min. (10) 棄掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上。 （11） 將EP 管放置于雙面板上，加入1毫升

7、75%乙醇，倒掉乙醇，用吸水紙吸干EP管壁上殘留的乙醇。 （12） 將干燥的質粒溶解于適量的雙蒸水中，并測雙鏈DNA的濃度。 3. 學習測P450酶蛋白濃度 (1)用15毫升離心管先稀釋蛋白，例如960ul desalting buffer +40ul p450酶 放在15ml 離心管中，稀釋之后的顏色為淡黃色。 (2)準備物品（比色皿，保險粉，勺子，封比色皿的封口膜，1毫升的槍和槍頭，比色皿最小1毫升，） (3)吹co,測量的是活性蛋白的濃度，蛋白與co 結合才會有活性。（用15毫升離心管防止蛋白溶液被吹出來） (4)先測不加保險粉的P450,再測加入 保險粉之后的P450,操作要迅速，因為

8、保險粉和溶液反應速度很快。 (5)作圖,看圖可以看在420nm處是否還有峰 (6)計算；p450酶蛋白的濃度等于（兩次測量差值450nm處的OD-兩次測量差值490nm處的OD）*91000*1000*1000*稀釋倍數。 4. 基因的定點突變 （一）定點突變的目的 把目的基因上面的一個堿基換成另一個堿基。 （二）定點突變的原理 通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，得到PCR產物，將產物進行轉化，再篩選陽性克隆，最后測序驗證。 （三）引物設計原則 （1）通常引物長度為25-45bp,我們建議引物長度為30-35bp.一般是要以突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列。兩邊長度至

9、少為11-12bp.若兩邊引物太短，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設12個bp,并且合成多一條反向互補的引物。 （2）如果設定的引物長度為30bp,接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78度，（GC含量應大于40%）. (3)如果Tm值低于78度，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78度。（GC含量大于40%）。 （4）設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。 （5）最好使用經過純化的引物。 Tm值計算公式：Tm=0.41*(%of GC)-675/L+81.5. 注：L:引物堿基數；% o

10、f GC：引物GC含量。 （四）定點突變操作步驟 用待突變的質粒為模板，用設計的引物及高保真酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。 1）設計點突變引物。 2）準備模板質粒DNA. 3）反應體系(50ul 反應體系) PCR反應體系與反應條件 成分 用量 PrimerSTAR Max 25 L Template DNA 1L Primers (10 M) 2 L each ddH2O 22L Stage 1: 98, 3 min (預變性) Stage 2: 98, 15 s (變性); Tm 63,10 s (退火); 72, 2kb/min(延伸); 35個循環 Stage 3: 72,1

11、0min Stage 4: 4, 4) 酶切 一般來說50ul PCR 產物加1ul酶（Fast Digest Dpn1）,10 x Fast Digest Dpn1 buffer 稀釋成 1x Fast Digest Dpn1 buffer.37度下反應3小時。 5) 膠回收 a) 加1xTAE 30ml(小膠 30毫升，中膠 50毫升，大膠100毫升) b) 加 1%瓊脂糖 0.3g c) 加熱 2分鐘，沸騰。 d) 加入核酸染料 30ml中一般加入3ul. e) 倒膠 （膠的形成一般是20-30min） f) 將loading buffer 和酶切產物融合，進行跑膠，loading bu

12、ffer加一滴，酶切產物全部加入. g) 進行跑膠，30分鐘。 h) 切完膠之后，稱量膠的凈重，（注意膠不要切的太厚，切下目的基因片段即可），1;1加入 bling buffer,1g加入1毫升，0.5g加入0.5毫升。做膠回收所用的試劑在（Gel Extraction Kit）的盒子里。 i） 在55度的金屬水浴鍋中加熱，讓里面的膠溶解，時常拿出來看一看，晃一晃，讓里面的膠溶解的快一些。 j） 準備好套管，將溶解好的DNA加到套管里面（一次加入750ul）,一定要注意換槍頭。先讓DNA液體過濾一遍，往套管中加完DNA液體之后，11000rpm,30s(1min). k） 使用SPW wash

13、 buffer 洗兩遍，先看SPW wash buffer 上面畫對勾沒，畫對勾的話說明加了乙醇，加入750ulspw wash buffer,(套管當中一次最多加入750ul 的液體)，加完spw wash buffer 液體之后進行離心，第一次離心11000rpm,30s;第二次加750 ul spw wash buffer 之后離心11000rpm,1分鐘。 l）之后11000rpm,2min 空離，（實際上離心的是wash buffer 里面的乙醇）把套管里面小管外壁的乙醇離心下來，（切不可忘記） m）把套管外的大管扔掉，此時加上一個2ml 的EP管，在外面開口晾曬3min , n）加

14、買來的elution buffer,每個小管加入30 ul Elution buffer,在加elution buffer 之前要將elution buffer 加熱一下，將elution buffer 加到套管里面小管的正中心，要輕輕的進行，不可以把小套管里面的膜弄壞，加完elution buffer 之后，讓他們融合2 Min，開始離心11000rpm,2min ,在套管外面離心下來的是DNA. 6) 體外重組 7） 轉化 （a） 等質粒和感受態細胞(BL21感受態細胞)在冰上融化后再使用。質粒與感受態混勻，在冰上放置30Min，（1.5mlEP管）.感受態和質粒混勻一定要輕輕的，不能用槍

15、吹打混勻，用手輕輕的撥動，做完馬上要插在冰上，可以把冰盒放在超凈臺里面。 （b） 熱激 42度水浴90 秒，在冰上放置2分鐘,降溫。 （c） 加入1ml 的LB 培養基，提供營養。 （d） 37 度搖床1 小時， （e） 離心濃縮，去除部分上清液后與沉淀混合均勻后涂布，具體操作（剩余50-100 ul，然后吸取一半的菌液進行涂布平板）100毫升LB培養基倒四個板子，吹板子吹十分鐘。 （f） 37度培養后根據菌落進行篩選（卡納抗性） （g） 在2ml 的EP管中加入1.8ml的LB 培養基和相應的抗生素之后，挑取單克隆菌落，進行搖菌培養。 （h） 提取質粒DNA. 8）測序 驗證目的基因的堿基順序 9）保菌和劃板 10) 挑取單克隆搖菌培養作為種子液， 11）發酵 12）純蛋白 13) 酶反應 14）液相檢測 三實驗總結 1進一步熟練實驗室中的基本實驗操作技能，在做轉化操作時要保證嚴格的無菌操作！做實驗過程中要認真。 2.基因的定點突變做到純蛋白這一步驟，后續的