1、新城疫的血凝和血凝抑制試驗高若開一、實驗目的掌握血凝和血凝抑制試驗的基本原理、操作方法和結果判定方法。分析血凝和血凝抑制試驗的影響因素，用以確定最佳免疫時間、判定免疫效果和輔助疾病診斷。二、實驗內容血凝試驗 （HA） 檢測新城疫抗原血凝抑制試驗 （HI） 檢測新城疫抗體三、實驗原理血凝試驗（ HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種動物的紅細胞發生凝集，這種凝 集紅細胞的現象稱為血凝（ HA）, 也稱直接血凝反應。血凝抑制試驗（ HI ）原理：當在病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒 或其血凝素時， 則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆粒或血凝素直接接觸。 這時紅細

2、胞的凝集現象就 被抑制，稱為紅細胞凝集抑制（ HI ）反應，也稱血凝抑制反應。抗原 抗體I am late ！四、實驗材料離心機、恒溫箱、冰箱、振蕩器、96 孔血凝版（ 5 塊）、微量移液器（ 20-100 微升可調）、吸液尖（若干）、洗耳球、離心試管、普通試管、試管刷、燒杯、吸量管、一次性注射器、ND標準抗原、1%紅細胞懸液、抗凝劑、生理鹽水。五、實驗步驟（一）抗凝劑的配制 將1克檸檬酸鈉用 25 毫升生理鹽水稀釋備用。 1毫升抗凝劑可用于采集 9毫升血液。（二）10%紅細胞懸液的配制1、用注射器吸取毫升抗凝劑無免疫健康青年公雞的紅細胞毫升。2、1500 轉離心 5 分鐘，吸棄上清液。3、用

3、 5-10 倍生理鹽水 1500 轉洗滌 3 次，前兩次 5 分鐘，后一次 10 分鐘。4、吸棄上清液，用吸量管吸取紅細胞，配制成10%紅細胞懸液。5、2-6 攝氏度儲存，備用。（三）血凝試驗（ HA）在血凝板上第一排的 112 孔內各加入 50ul 生理鹽水將系苗用生理鹽水 5 毫升稀釋，在第 1 孔內加入 50ul 病毒抗原，然后依次倍比稀釋至第 11 孔，最 后棄 50ul 。每孔加入 1雞紅細胞懸液 50ul輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37中靜置 30 分鐘結果判定 血凝效價測定12345678910111224816326412825651210242048紅細胞對照生理鹽水50505

4、0505050505050505050抗原5050505050505050505050棄 50紅細胞505050505050505050505050結果結果判定標準1、：紅細胞呈細沙樣均勻鋪于孔底，即100凝集；2、：紅細胞均勻鋪于孔底，當邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75凝集；3、 ：紅細胞形成一個環狀，四周有凝集塊，即 50 凝集；4、 ：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，即25凝集；5、 ：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，即無凝集。 血凝價的判定以 100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒的血凝價，即為一個凝集單位。上表看出，該新城疫病 毒液的血凝價為 1:32 ，則

5、l:32 為 1個血凝單位， 1:16 、l:8 分別為 2、4個血凝單位，或將 32/4=8 ， 即 1:8 稀釋的病毒液為 4 個血凝單位。（四）4 個血凝單位抗原的配制 根據判定結果，吸取 1 毫升已稀釋的病原溶液再以 8 倍稀釋，即為 4 個血凝單位的標準抗原。（五）血凝抑制試驗1、在血凝板上 1 12 孔內各加入 50ul 生理鹽水；2、在第 1孔內加入被檢血清 50ul ，然后倍比稀釋至第 11 孔，最后棄 50ul ；3、第 112 孔內加入 4單位抗原 50ul （第 12 孔為病毒對照）；4、每孔加入 1雞紅細胞懸液 50ul ；5、輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37中靜置 30

6、 分鐘6、結果判定血凝抑制效價測定12345678910111224816326412825651210242048病毒對照生理鹽水505050505050505050505050血清5050505050505050505050棄 504 單位 抗原505050505050505050505050紅細胞505050505050505050505050結果結果判定標準1、：紅細胞呈細沙樣均勻鋪于孔底，即100凝集；2、：紅細胞均勻鋪于孔底，當邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75凝集；3、 ：紅細胞形成一個環狀，四周有凝集塊，即 50 凝集；4、 ：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，

7、即25凝集；5、 ：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，即無凝集。 血凝抑制價的判定將反應板傾斜成 45 度角，沉于管底的細細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞 未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明 紅細胞被病毒所凝集。 能將 4 單位病毒物質凝集紅細胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數，稱為該血清的紅細胞凝集抑制效價，用被檢血清的稀釋倍數或以2 為底的對數 （10g2） 表示。如上例，該血清的紅細胞凝集抑制效價為 1：4或 HI 效價為 2（10g2） 。稀釋倍數24816326412825651210242048血清對照結果結果

8、分析： 在對照出現正確結果的情況下， 已完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制 滴度。（1）一般認為雞的免疫臨界水平為 1:8（ 成年 ）或 1:16（ 雛雞 ） ，隨地區不同而稍有差異。雞血清 HI 抗體效價高于 1:16 時可適當推遲新城疫免疫的時間， HI 抗體效價在 1:16 以下， 須進行新城疫疫苗接疫種，在新城疫流行的地區或雞場，雞的免疫臨界水平應稍提高。雞群的 HI 抗體水平(血凝抑制滴度)是以抽檢樣品的HI 抗體效價 ( 2) 的幾何平均值表示的。如果某雞群的 10 份樣品中， HI 抗體效價 ( 2)為 8的有 3份樣品，為 7的有 5份樣品，為 6的 有2 份樣品

9、，它們的平均值為：( 8 3 7 5 6 2)/ ( 3 5 2)平均水平在 4(10g2) 以上，說明該雞群為免疫雞群。若在 檢樣中 HI 抗體效價的最高值與最低值相差太大時，則不能用上法計算平均水平，應根據臨界水平以 下的樣品數在全部樣品中所占的百分比決定免疫與否。大型養雞場，每次進行抽測時，抽樣率一般不低于一，小型雞群，抽樣率應有所增加， 一般認為理想的抽樣率應為。(5) 雞群接種新城疫疫苗后，經23周測血清中的 HI 抗體效價，若提高 2個滴度以上，表示雞的免疫應答良好，疫苗接種成功；若HI 抗體效價無明顯提高，表示免疫失敗。( 6)若有 10%以上的雞群出現11(10g2) 以上的高血凝抑制滴度，說明雞群已受新城疫強毒感染。若監測雞群的免疫水平，用血凝抑制滴度在 4