1、DNA的復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄DNA的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )2復(fù)制(replication) 是以DNA為模板的DNA合成，是基因組的復(fù)制過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，親代DNA作為合成模板，按照堿基配對(duì)原那么合成子代分子，其化學(xué)本質(zhì)是酶促脫氧核苷酸聚合反響。 復(fù)制親代DNA子代DNA3本章主要內(nèi)容： DNA復(fù)制的根本規(guī)律 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 原核生物DNA復(fù)制過(guò)程真核生物DNA生物合成過(guò)程 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 DNA損傷與修復(fù) 4DNA復(fù)制的根本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication5半保存復(fù)制(semi-conservat

2、ive replication)雙向復(fù)制(bidirectional replication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication)高保真性 DNA復(fù)制的主要特征 6一、 DNA以半保存方式進(jìn)展復(fù)制 DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地承受過(guò)來(lái)，另一股單鏈那么完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保存復(fù)制。半保存復(fù)制的概念:半保存復(fù)制是DNA復(fù)制的根本特征。7AGGTACTGCCACTGGTCCATGA

3、CGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子代DNA8子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: 全保存式 半保存式 混合式 9密度梯度實(shí)驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保存復(fù)制的設(shè)想。含15N-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代梯度離心結(jié)果10按半保存復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保存了親代的全部遺傳信息，表達(dá)了遺傳的保守性。半保存復(fù)制的意

4、義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子根底，但不是絕對(duì)的。11原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)origin。復(fù)制從起點(diǎn)開場(chǎng)，向兩個(gè)方向進(jìn)展解鏈，進(jìn)展的是單點(diǎn)起始雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸復(fù)制中的放射自顯影圖象12A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination, ter)oriterA B C13真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。 53oriorioriori531453oriorioriori53

5、5533553復(fù)制315三、DNA復(fù)制反響呈半不連續(xù)特征3535解鏈方向35335領(lǐng)頭鏈(leading strand)隨從鏈(lagging strand)16順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)展的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand) 。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(lagging strand) 。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。 17DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化The Enzymology and Topology

6、of DNA Replication18參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP；聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為 DNA-pol；模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。19(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiRNA引物RNA引物子代DNA20聚合反響的特點(diǎn):DNA 新鏈生成需RNA引物和模板； 新鏈的延長(zhǎng)只可沿5 3方向進(jìn)展。21一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合全稱：依賴DN

7、A的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性225 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5外切酶活性:5 3外切酶活性:?能切除突變的 DNA片段。能識(shí)別錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性: 235 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C

8、 53 5外切酶活性:5 3外切酶活性:?能切除突變的 DNA片段。能識(shí)別錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性: 24一原核生物有3種DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 25原核生物的DNA聚合酶26功能：DNA-pol 109kD對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)展校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)展填補(bǔ)。27323個(gè)氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)展分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 28DNA-pol 120kDDNA-pol II基

9、因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-pol 對(duì)模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。29個(gè)核心酶1個(gè)-復(fù)合物、 6種亞基1對(duì)-亞基可滑動(dòng)的DNA夾子DNA聚合酶全酶構(gòu)造多聚體不對(duì)稱多亞基二聚體全酶構(gòu)造包括：30二常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有5種DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制 。在復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 31真核生物的DNA聚合酶32二、DNA聚合酶

10、的堿基選擇和校對(duì)功能實(shí)現(xiàn)復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)展，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的根本原理。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來(lái)保證復(fù)制的保真性：核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇性是復(fù)制的保真性的分子根底。33遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律，A-T配對(duì)，G-C配對(duì)；聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校對(duì)功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：34A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNA pol 的校讀功能35一復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子構(gòu)造協(xié)調(diào)非共價(jià)氫鍵與共價(jià)磷酸二酯鍵鍵的有序形成

11、。 嘌呤的化學(xué)構(gòu)造能形成順式和反式構(gòu)型。 與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型36三、復(fù)制中的解鏈伴有DNA 分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。 37一多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)38E. Coli 基因圖39一多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)40解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase) 復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。 41108局部解鏈后二DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)復(fù)制過(guò)程正超螺旋的形成：42解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成43既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。 拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：44拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反響不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。