1、功能基因組學(xué)第1頁，共53頁。20世紀(jì)人類科技史上的三大創(chuàng)舉40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類首次登上月球90年代人類基因組計劃第2頁，共53頁。基因組(genome)泛指一個有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。 一、基因組學(xué)概念及范疇基因組學(xué)(genomics)是指發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能。第3頁，共53頁。基因組學(xué)包括3個不同的亞領(lǐng)域結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 功能基因組學(xué)(functional genomics)比較基因組學(xué)(comparat

2、ive genomics) 基因組學(xué)概念第4頁，共53頁。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)是通過人類基因組計劃HGP的實(shí)施來完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。第5頁，共53頁。人類基因組計劃（HGP）的研究內(nèi)容遺傳圖的分析（Genetic map） 確定基因或DNA標(biāo)記在染色體上的相對位置與遺傳距離第6頁，共53頁。第7頁，共53頁。第8頁，共53頁。序列圖分析（sequence map） 測定由30億個核苷酸組成的全部序列。人類基因組的核苷酸序列圖

3、其實(shí)是分子水平上最高層次，最詳盡的物理圖。第9頁，共53頁。二、后基因組學(xué)的研究（Postgenome era）人類基因組計劃完成之后，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分。科學(xué)研究已開始進(jìn)入“后基因組時代”。主要是開展功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。有科學(xué)家形象地說道：即使基因測序全部完成，也只好像是一本沒有姓名，只有號碼的電話簿。“后基因組時代”的最終目標(biāo)，是要把深奧的DNA語言變成一本大基因百科全書。第10頁，共53頁。功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)，后基因組學(xué)(Post genomics)：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能生物學(xué)研究從對單一基因

4、或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€基因或蛋白質(zhì)同時進(jìn)行系統(tǒng)的研究。功能基因組學(xué)的目的基因功能發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)分析及突變檢測從基因組整體水平上對基因的活動規(guī)律進(jìn)行闡述。第11頁，共53頁。1、功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容基因功能的研究基因組的表達(dá)及時空調(diào)控的研究蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究基因組多樣性的研究模式生物體的基因組研究第12頁，共53頁。2、功能基因組學(xué)的研究方法單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分析表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）分析基因表達(dá)的序列分析（SAGE）DNA芯片RNA干擾蛋白質(zhì)組學(xué)（雙向電泳質(zhì)譜）第13頁，共53頁。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism, SNP)定義

5、單核苷酸多態(tài)性是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置發(fā)生了轉(zhuǎn)換，顛換，缺失和插入等變化而引起的序列多態(tài)性，而且任何一等位基因在群體中的頻率不小于1%。SNPs在GC序列上出現(xiàn)最為頻繁，以C-T最多見。據(jù)估計SNPs在人類基因組的平均密度為1/1000，數(shù)量巨大，因此多態(tài)性信息含量高。第14頁，共53頁。第15頁，共53頁。中英聯(lián)合實(shí)驗室DNA（分子）標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms,RFLP）簡單序列長度多態(tài)性（simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs)小衛(wèi)星序列：（Min

6、isatellite DNA）微衛(wèi)星序列：（Microsatellite DNA, MS）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphisms,SNP）第16頁，共53頁。SNPs與表型編碼區(qū)內(nèi)的SNPs可能改變氨基酸殘基的種類，這可以直接影響蛋白質(zhì)的功能；外顯子和內(nèi)含子相連部位的SNPs可能改變外顯子一內(nèi)含子的剪接，影響蛋白質(zhì)的修飾；在調(diào)控區(qū)域內(nèi)的SNPs可以改變mRNA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。第17頁，共53頁。以SNPs為基礎(chǔ)研究人類疾病遺傳學(xué)家尋找致病基因的基本策略是：連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析。連鎖分析是確定兩個遺傳標(biāo)記或者更多遺傳標(biāo)記之間的物理關(guān)系，以確定致病基因

7、的位置。關(guān)聯(lián)分析是研究某種遺傳標(biāo)記與某一特定表型的之間的關(guān)系第18頁，共53頁。第19頁，共53頁。第20頁，共53頁。第21頁，共53頁。第22頁，共53頁。第23頁，共53頁。表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags, EST）ESTs是從已建好的cDNA文庫中隨機(jī)取出一個克隆，從5末端或3末端對插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。第24頁，共53頁。第25頁，共53頁。EST的應(yīng)用構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜 遺傳圖譜、物理圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜,是基因組計劃要獲得的3張遺傳學(xué)圖譜。構(gòu)建染色體物理圖譜需要大量的單拷貝短序列作為界標(biāo),由于大多

8、數(shù)基因是單拷貝的,所以可以用EST序列充當(dāng)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)。而且,由于EST序列是轉(zhuǎn)錄基因的產(chǎn)物,可用來直接構(gòu)建遺傳連鎖圖,通過與基因組文庫序列比較,可以提供內(nèi)含子結(jié)構(gòu),可選擇剪切方式,轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)等信息。第26頁，共53頁。EST的應(yīng)用分離和鑒定新基因 將所獲得EST用生物信息學(xué)方法與公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對,可以迅速準(zhǔn)確的確定基因的功能。由于在構(gòu)建cDNA文庫時要盡可能的選用全長cDNA,所以一旦發(fā)現(xiàn)有價值的EST,可以找到對應(yīng)的克隆,獲得的全長cDNA可以直接用于轉(zhuǎn)基因等研究。利用EST方法進(jìn)行發(fā)現(xiàn)、分離基因的研究,不僅是人類基因組研究的熱點(diǎn),而且也是模式生物基因研究的重要

9、內(nèi)容。第27頁，共53頁。EST的應(yīng)用基因差異表達(dá)的研究 通過比較不同發(fā)育時期和每個發(fā)育時期不同組織器官cDNA文庫中的EST信息,可以繪出該物種在特定時間和空間的基因表達(dá)的發(fā)育順序譜。因為一個基因表達(dá)的峰度越高,它被隨機(jī)調(diào)出而被測序的次數(shù)越多,而比較眾多cDNA文庫的EST數(shù)據(jù)可以推測1個基因在不同組織或器官中表達(dá)的差異。第28頁，共53頁。EST的應(yīng)用基因的定位克隆 以EST為重要來源的染色體物理圖譜進(jìn)一步方便了對抗病基因的連續(xù)分析,可將抗病基因定位在染色體中的狹小區(qū)段,縮小抗病基因的篩選范圍。同時,EST標(biāo)記是功能序列區(qū)的標(biāo)記,處于目標(biāo)基因的范圍內(nèi),是目標(biāo)基因的編碼區(qū),因此EST標(biāo)記是分

10、離功能基因的有效標(biāo)簽,大大提高了克隆基因的效率。第29頁，共53頁。EST的應(yīng)用比較基因組學(xué)的研究 利用EST序列中古老保守序列來研究生物中間的進(jìn)化關(guān)系,可以避免選擇家系、構(gòu)建群體、大量的統(tǒng)計分析等周期,長而繁瑣的遺傳圖譜的制作過程。此外,利用基因組較小的模式生物所獲得的已知功能基因,用復(fù)雜基因組生物,如人和動植物的EST比較,從而推測,待測EST的功能,已經(jīng)成為比較基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容。第30頁，共53頁。EST的應(yīng)用用于制備cDNA芯片 芯片技術(shù),是目前高通量篩選EST的有效方法。隨著更多基因組計劃的開展和更多已知功能基因的積累,將來無需進(jìn)行測序,只通過DNA芯片技術(shù)就可以研究基因的功能

11、。EST計劃的實(shí)施不僅獲得了關(guān)于表達(dá)基因的信息資源同時也獲得了大量已經(jīng)經(jīng)過功能鑒定了的cDNA克隆資源而這些資源都是功能基因組研究所不可缺少的。第31頁，共53頁。SAGE （serials analysis of gene expression）基因表達(dá)系列分析 1995年，JohsHopkins大學(xué)的分子腫瘤學(xué)家Kinzler和Vogelstein及其同事建立了SAGE方法.第32頁，共53頁。SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)：來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）；通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量

12、多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度（abundance）。 第33頁，共53頁。1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與RNA混合。2. 合成雙鏈cDNA。3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。4. 將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5. 用Mme I切割每一個樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE 步驟第34頁，共53頁。6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。7. PCR擴(kuò)增。8. 用Nla 酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙

13、鏈標(biāo)簽。9. 連接片斷形成串聯(lián)體。10. 克隆到pZErO-1+里，并測序。第35頁，共53頁。SAGE實(shí)例第36頁，共53頁。DNA芯片DNA芯片（DNA chip）也叫基因芯片（Gene chip）是指在固相載體（玻璃，硅等）上有序地，高密度地（點(diǎn)間距小于500m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探針）。這些被固定的分子探針在基質(zhì)上形成高密度的DNA微陣列，因此DNA芯片又叫DNA微矩陣（DNA Microarray）第37頁，共53頁。DNA芯片的基本原理基因芯片技術(shù)是建立在Southern blot基礎(chǔ)之上的，可以說它是Southern blot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性DN

14、A加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。第38頁，共53頁。基因芯片基本操作流程制備總RNA mRNA經(jīng)RT-PCR用Cy3（正常對照組）和Cy5（實(shí)驗組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cDNA探針 混合標(biāo)記探針 與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交 掃描 分析雜交結(jié)果 結(jié)論第39頁，共53頁。第40頁，共53頁。基因芯片第41頁，共53頁。基因芯片的應(yīng)用生物信息學(xué)的工具基因相關(guān)性研究基因功能藥物設(shè)計和開發(fā)潛在反義試劑開發(fā)個體化醫(yī)療身份識別基因診斷其他與生物有關(guān)的領(lǐng)域特定基因檢測突變檢測多態(tài)性分析基因表達(dá)譜第42頁，共53頁。例：腫瘤診斷 國外有一臨床病人表現(xiàn)出典型的

15、白血病癥狀，但形態(tài)學(xué)檢測不典型，根據(jù)相關(guān)檢查，診斷為AML（acute myeloid leukaemia, 急性骨髓白血病），治療幾個月后未見好轉(zhuǎn)。后來用DNA芯片與病人骨髓的mRNA雜交，結(jié)果顯示AML和ALL(acute lymphoblastic leukaemia 急性成淋巴細(xì)胞白血病)基因都表達(dá)較低，而在數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，編碼原肌球蛋白的基因表達(dá)極高，從而確診為肺泡彈狀肌肉瘤，改變治療方案，病情出現(xiàn)緩解。第43頁，共53頁。RNAi（RNA interference，RNA干擾） 通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，存在于從低等的線蟲到人類培養(yǎng)

16、細(xì)胞等多種有機(jī)體。 RNAi相關(guān)技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具，可用于功能基因組學(xué)研究以及基因治療等臨床用途。第44頁，共53頁。RNAi 研 究 史十幾年前，Rich Jorgensen 在矮牽牛花中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默七年前，researchers Guo 和Kemphues 注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1 基因的表達(dá)；三年后，F(xiàn)ire等注入雙鏈RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過RNAi進(jìn)行線蟲基因敲除的策略。近年來，顯微注射，基因槍，基因工程手段誘導(dǎo)RNAi也成為果蠅研究中的反向遺傳學(xué)工具。2001年Elbashir等 Nature上首次報道通過21個核苷酸

17、的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。第45頁，共53頁。RNAi 機(jī)制模式圖第46頁，共53頁。核心技術(shù)： siRNA（ Small interfering RNA）的設(shè)計與合成siRNA的標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染RNAi的檢測（核酸及蛋白水平）RNA干擾技術(shù)第47頁，共53頁。1.siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動物：21-23bp dsRNA 其它生物：更長的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的設(shè)計第48頁，共53頁。2.設(shè)計流程（選擇siRNA靶位點(diǎn)）從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)；根據(jù)5和3非翻譯區(qū)（UTR)及靠近起始密碼子（75個堿基之內(nèi)）等富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域來設(shè)計siRNA。將候選靶位點(diǎn)與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫比較，去掉哪些與其它編碼序列同源的靶序列。設(shè)計陰性對照：陰性對照siRNA應(yīng)與siRNA的核苷酸組成相同但沒有與基因組明顯同源的序列。一般通過改變siRNA核苷酸順序并經(jīng)同源序列比較確證而得。siRNA的設(shè)計第49頁，共53頁。RNAi技術(shù)的應(yīng)用功能基因組學(xué) 蛋白表達(dá)調(diào)控，蛋白功能研究基因治療 候選治劑；藥物靶位點(diǎn)鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理研究第50頁，共53頁。RNAi技術(shù)